地龍?zhí)崛∥飳ι窠?jīng)母細胞SH-SY5Y細胞增殖的影響*

王玉 伍鳳云 劉丹 林芬

（1江西省中醫(yī)藥研究院 南昌 330046；2南昌大學醫(yī)學院2008級研究生 江西南昌 330006；3南昌大學醫(yī)學院2009級研究生 江西南昌 330006）

地龍為環(huán)節(jié)動物門鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓、通俗毛蚓、威廉環(huán)毛蚓或櫛肓毛蚓的干燥體，其性咸寒，是我國重要且歷史悠久的中藥材之一，具有多方面的藥理作用，如抑制血小板聚集[1]、降壓[2]、平喘[3]等。本文對地龍?zhí)崛∥飳w外神經(jīng)細胞細胞增殖情況的影響進行研究，旨在尋找合適的體外藥物濃度為臨床給藥劑量提供參考?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 神經(jīng)母細胞株SH-SY5Y：江西省中醫(yī)藥研究院中心實驗室凍存。

1.2 試劑DMEM培養(yǎng)基 GIBCOBRL產(chǎn)品（批號：1024265，貨號：12100-038）；小牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司（批號：060209）；胰蛋白酶：Sigma產(chǎn)品（批號：4977，效價為 1:250）；MTT：Sigma產(chǎn)品（貨號：M2128）。

1.3 主要儀器 超凈工作臺（SW-CJ-IF型，蘇州凈化設(shè)備廠）；二氧化碳培養(yǎng)箱（3164型，美國Forma scientic公司）；倒置顯微鏡（808434型，日本Nikon公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（KHB-ST360，上?？迫A公司）。

1.4 實驗藥物 地龍?zhí)崛∥铮喝〉佚埶幉?0g，10倍水量煎煮提取2次，1h/次，合并提取液，濾過，濃縮至100mL，加入乙醇配制成含乙醇終濃度為50%的藥液，常溫靜置24h，取上清液濃縮至500mg/mL，用飽和NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，離心，上清液過0.45μm微孔濾膜除菌，濾液作為貯備液，置冰箱保存?zhèn)溆茫ㄋ盟幬餄舛染陨幜坑嬎悖?/p>

2 實驗方法

2.1 神經(jīng)母細胞SH-SY5Y傳代培養(yǎng) 倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，將長滿細胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄掉，用無血清DMEM液洗一遍，加0.25%胰蛋白酶消化，當細胞變成圓形時小心棄去培養(yǎng)瓶中的液體，加適量DMEM完全培養(yǎng)液終止消化，棄去DMEM完全培養(yǎng)液，再加適量DMEM完全培養(yǎng)液并吹打細胞制成細胞懸液，置含5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)。

2.2 MTT比色法 將培養(yǎng)對數(shù)生長期的神經(jīng)母細胞株SH-SY5Y配成單個細胞懸液，調(diào)整懸液濃度并接種到96孔板中，5%CO2、37℃培養(yǎng)24h，分別給予實驗各組含不同濃度地龍?zhí)崛∥锏腄MEM完全培養(yǎng)液，使藥物終濃度分別為 2、5、10、20、30、40、50、80、100 mg/mL，對照組給予等體積的 DMEM完全培養(yǎng)液，每組 8 個復孔，5%CO2、37℃培養(yǎng) 48h，每孔加20μL 5mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，每孔加 150 μL DMSO，振蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測OD值。

3 實驗結(jié)果

地龍?zhí)崛∥镌?～10mg/mL濃度范圍內(nèi)，其OD值與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異，P＞0.05，表明在此濃度范圍內(nèi)地龍?zhí)崛∥飳ι窠?jīng)母細胞株SH-SY5Y增殖無顯著影響，且藥物濃度在2mg/mL時對其生長有一定的保護作用。當濃度達到20mg/mL以上時，隨著劑量增大OD值逐漸降低，與正常對照組比差別均有統(tǒng)計學意義，P＜0.01，并且抑制率也隨著劑量的增大而增大，表明地龍?zhí)崛∥餄舛冗_到20mg/mL以上時明顯抑制神經(jīng)母細胞株SH-SY5Y的增殖；并且當濃度達100mg/mL時，OD值為0，表明此時100%抑制。見表1。

表1 地龍?zhí)崛∥飳ι窠?jīng)細胞SH-SY5Y細胞增殖的影響 （±S）

表1 地龍?zhí)崛∥飳ι窠?jīng)細胞SH-SY5Y細胞增殖的影響 （±S）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01。

組別 n OD值 抑制率（%）正常對照組 8 0.5893±0.0481 -地龍?zhí)崛∥铮? mg/mL） 8 0.5980±0.0414 -1.48地龍?zhí)崛∥铮? mg/mL） 8 0.5490±0.0788 6.84地龍?zhí)崛∥铮?0 mg/mL） 8 0.5250±0.0538 10.91地龍?zhí)崛∥铮?0 mg/mL） 8 0.2551±0.0604* 56.71地龍?zhí)崛∥铮?0 mg/mL） 8 0.1966±0.0381* 66.64地龍?zhí)崛∥铮?0 mg/mL） 8 0.1429±0.0336* 75.75地龍?zhí)崛∥铮?0 mg/mL） 8 0.0818±0.0170* 86.12地龍?zhí)崛∥铮?0 mg/mL） 8 0.0180±0.0058* 96.94地龍?zhí)崛∥铮?00 mg/mL）8 0.0000±0.0000* 100.00

4 討論

地龍為我國傳統(tǒng)中藥，具有較為廣泛的藥理學作用，中醫(yī)臨床用于治療多種疾病。常規(guī)認為在常用劑量及傳統(tǒng)給藥劑量下本品無毒。但有研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓應激分泌液的蛋白組分有劇毒性[4]。因此，應用地龍?zhí)崛∥飼r必須選擇合適的劑量，既保證良好的臨床效果，又降低對人體毒性。

MTT法是一種檢測細胞存活和增殖的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚，結(jié)晶的產(chǎn)量與活細胞數(shù)成正相關(guān)。MTT比色法因靈敏度高、操作簡便、經(jīng)濟、快速而被廣泛應用。

本文研究結(jié)果顯示，地龍?zhí)崛∥镌?～10mg/mL濃度范圍內(nèi)對神經(jīng)母細胞株SH-SY5Y的存活無明顯抑制作用，而且在2mg/mL時表現(xiàn)出保護作用，這意味著在臨床上小劑量使用地龍?zhí)崛∥飳ι窠?jīng)系統(tǒng)具有康復保健、預防疾病發(fā)生的作用，這給地龍保健品的開發(fā)提供了實驗依據(jù)。當濃度達到20mg/mL及以上時，細胞毒性呈跳躍式加強，隨著劑量的增大神經(jīng)細胞的抑制率也增大；當濃度達100mg/mL時，呈現(xiàn)100%抑制。提示：（1）地龍在小劑量使用時，對神經(jīng)細胞體無毒性并且有一定的保護作用，這對預防腦中風的發(fā)病用藥以及保健藥品的開發(fā)具有指導意義；（2）地龍在大劑量使用時，不僅沒有保護作用，而且對神經(jīng)細胞有抑制生長的毒性作用，提示地龍在臨床上的使用劑量不能過大，以免副作用的發(fā)生。

[1]韓正雪,賴光強,張維,等.地龍水煎劑對血小板聚集的影響[J].中外健康文摘·臨床醫(yī)藥版,2008,5（4）：27

[2]馮敏超,康白,毛淑梅,等.地龍耐熱蛋白對自發(fā)性高血壓大鼠心肌血管緊張素Ⅱ水平及血管緊張素Ⅱ-1型受體表達的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007,16（26）：3 794-3 796

[3]張德新.五味地龍湯對哮喘豚鼠作用機制的試驗研究[D].武漢：湖北中醫(yī)學院,2007.78

[4]張租,何俐明,于培爛,等.蚯蚓毒素及其去除方法的初步研究[J].中國生化藥物雜志,2001,22（3）：112-113