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    坤泰膠囊對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜容受性影響的研究*

    2016-07-15 08:59:45李玉潔
    重慶醫(yī)學(xué) 2016年18期
    關(guān)鍵詞:坤泰雌鼠腺體

    王 慧,李玉潔,陳 帆,南 燕

    (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南新鄉(xiāng) 453003)

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    坤泰膠囊對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜容受性影響的研究*

    王慧,李玉潔△,陳帆,南燕

    (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南新鄉(xiāng) 453003)

    [摘要]目的通過比較溶血磷脂酸受體-3(LPAR3)在小鼠胚胎著床期子宮內(nèi)膜的表達(dá),了解坤泰膠囊對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響。方法將90只6~8周齡的昆明雌鼠分為3組[A組:控制性超促排卵(COH);B組:坤泰+COH;C組:生理鹽水對(duì)照),每組30只],檢查合籠次日晨陰栓,于第1~6天每天每組處死5只雌鼠,測定血清中雌二醇(E2)、孕酮(P)水平,以及腺體數(shù)和LPAR3免疫組化光密度值(IOD)。 結(jié)果A、B組血清E2、P水平值均高于同期C組(P<0.05);HE染色,A組較B、C組腺體數(shù)明顯減少(P<0.05)。A組第3天LPAR3的IOD值高于B、C組(P<0.05),而A組第4天IOD值明顯小于B、C組(P<0.05),B組較C組略高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論坤泰膠囊可能通過改善COH小鼠LPAR3正常時(shí)空表達(dá),起到改善子宮內(nèi)膜容受性的作用。

    [關(guān)鍵詞]坤泰膠囊;子宮內(nèi)膜容受性;控制性超促排卵;溶血磷脂酸受體-3

    隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展,輔助生殖技術(shù)在卵子的獲取、受精卵的培養(yǎng)、胚胎移植等方面取得很大的進(jìn)步,為廣大的不孕癥患者帶來希望;但是胚胎的著床率較前并未出現(xiàn)明顯改善[1],嚴(yán)重影響了妊娠結(jié)局,為此子宮內(nèi)膜容受性即子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受能力就成為當(dāng)今生殖醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)問題[2]。本實(shí)驗(yàn)建立了控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation,COH)小鼠模型,觀察坤泰膠囊對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響,并了解溶血磷脂酸受體-3(lysophosphatidic acid receptors 3,LPAR3)在小鼠子宮內(nèi)膜上的表達(dá)特點(diǎn),對(duì)坤泰膠囊作用機(jī)制及胚胎著床影響的機(jī)制進(jìn)行探討。

    1材料與方法

    1.1材料清潔級(jí)昆明雌鼠90只,6~8周齡,24~34 g;雄鼠45只,8~10周齡,28~37 g,由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。雌雄分籠飼養(yǎng),自由取食水,室溫22~25 ℃。

    1.2方法將90只雌鼠分為A、B、C 3組(n=30),B組給予坤泰膠囊(貴陽新天藥業(yè)股份有限公司提供),A、C組給予相同劑量生理鹽水,均灌胃1個(gè)月,每只每天劑量為0.7 mL。將坤泰膠囊溶于生理鹽水濃度為50 mg/mL,灌胃劑量根據(jù)許文生氏公式和Meeh-Rubner氏公式,按中國婦女的平均身高158.6 cm,體質(zhì)量53.6 kg,本次實(shí)驗(yàn)雌鼠的平均體質(zhì)量27.5 g計(jì)算,小鼠的每日灌藥量約為1.2 mg/g。3組小鼠灌胃20 d后,于小鼠發(fā)情后期,A、B兩組均于上午9:00腹腔注射促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRHa)1.5 μg/100 g,連續(xù)9 d,第9天加注孕馬血清促性腺激素(PMSG)10 IU/只,48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)10 IU/只,C組同時(shí)注射同等劑量的生理鹽水。HCG注射日當(dāng)晚A、B、C 3組雌∶雄比2∶1合籠,次日晨7:00~8:00時(shí)檢查陰栓,并記為第1天,依次為第2、3、4、5、6天,每天每組平均頸椎脫臼處死5只雌鼠,心臟取血行雌二醇(E2)、孕酮(P)測定,解剖取其子宮組織,放置4%的多聚甲醛中固定待行HE染色和免疫組化檢測LPAR3表達(dá)的光密度值(IOD)。

    2結(jié)果

    2.13組小鼠第1~6天E2、P水平比較A、B組E2、P水平均高于同期C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);B組E2、P水平高于A組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1、表2。

    2.23組小鼠第4天子宮內(nèi)膜HE染色比較A、B、C組腺體數(shù)分別為(12.6±3.36)、(19.8±1.92)、(17.0±2.45)個(gè),B組腺體數(shù)高于A、C組,與A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。鏡下觀A組腺體發(fā)育差,腺腔小,間質(zhì)致密,血管較少;B組腺體發(fā)育好,腺腔大,間質(zhì)疏松,血管多;C、B組鏡下比較無明顯差別。圖1~3。

    2.33組小鼠LPAR3表達(dá)的IOD比較LPAR3在3組小鼠的第1~6天出現(xiàn)規(guī)律性表達(dá),A組峰值出現(xiàn)在第3天,B、C組峰值均出現(xiàn)在第4天,且A組第3天的IOD值高于B、C組(P<0.05);B、C組第4天的IOD值高于A組(P<0.05);B組第4、5天的IOD值略高于C組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。三組峰值可見免疫組化圖4~6。

    表1  3組小鼠第1~6天E2水平比較

    a:P<0.05,與同期C組比較。

    表2  3組小鼠第1~6天P水平比較

    a:P<0.05,與同期C組比較。

    表3  3組小鼠LPAR3的IOD比較

    a:P<0.05,與同期A組比較。

    圖1 A組第4天HE染色(×400)圖2 B組第4天HE染色(×400)圖3 C組第4天HE染色(×400)

    圖4 A組第3天LPAR3的表達(dá)(×400)圖5 B組第4天LPAR3的表達(dá)(×400)圖6 C組第4天LPAR3的表達(dá)(×400)

    3討論

    通過提高子宮內(nèi)膜容受性,從而提高輔助生殖技術(shù)的臨床妊娠率是現(xiàn)在生殖醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)問題,國內(nèi)外學(xué)者通過大量研究以期解決超促排卵后導(dǎo)致的種植窗期子宮內(nèi)膜容受性低下的問題,同時(shí)也是目前解決胚胎種植率低的切入點(diǎn)。

    溶血磷脂酸(LPA)存在于機(jī)體的血清、眼房水、精漿等多種體液中,其受體有4種,分別是LPAR1、LPAR2、LPAR3、LPAR4,其中LPAR3與雌性生殖系統(tǒng)關(guān)系密切。有研究發(fā)現(xiàn),LPAR3基因缺陷的雌性小鼠中LPAR3空間分布異常,并推測其表達(dá)異??蓪?dǎo)致胚胎種植的延遲[3]。本實(shí)驗(yàn)免疫組化提示,LPAR3表達(dá)于子宮內(nèi)膜上皮及腺上皮細(xì)胞質(zhì),且在子宮內(nèi)膜上的表達(dá)具有規(guī)律性,3組均出現(xiàn)峰值,A組峰值出現(xiàn)在第3天,B、C組出現(xiàn)第4天;B組峰值高于A組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),這種規(guī)律性表達(dá)可能與生殖關(guān)系密切相關(guān)。

    坤泰膠囊為純中藥制劑,由熟地黃、黃連、白芍、黃芩、茯苓、阿膠等六味中藥組成,無雌激素,卻有類雌激素作用。有研究證實(shí),坤泰膠囊有雌激素樣作用,并且能改善子宮內(nèi)膜發(fā)育,有利于胚胎著床[4];有研究證實(shí),雌、孕激素在胚胎與子宮內(nèi)膜對(duì)話建立關(guān)聯(lián)之間起到重要的把控作用[5]。通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)坤泰膠囊確實(shí)具有升高雌、孕激素的作用,但作用弱。陳蓉等[6]研究的坤泰膠囊可以升高E2,且不會(huì)造成子宮內(nèi)膜過度增生。本實(shí)驗(yàn)顯示,坤泰膠囊同時(shí)具有改善COH引起的子宮內(nèi)膜腺體少且發(fā)育不良、間質(zhì)致密等作用。付連方[7]研究COH藥物具有影響小鼠子宮內(nèi)膜容受性,導(dǎo)致臨床妊娠率低;龔瑜等[8]試圖從子宮內(nèi)膜厚度、血流指數(shù)等方面研究超促排卵對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的影響,發(fā)現(xiàn)超促排卵對(duì)內(nèi)膜厚度與血流指數(shù)影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由本實(shí)驗(yàn)可見COH可能是在異常升高雌、孕激素水平,影響內(nèi)膜腺體發(fā)育等方面降低子宮內(nèi)膜容受性的;而坤泰膠囊在一定程度上可通過改善子宮內(nèi)膜腺體少、發(fā)育不良、疏松間質(zhì)從而改善COH引起的子宮內(nèi)膜容受性降低;這一結(jié)論與鄭瑞君等[9]研究的坤泰膠囊具有改善子宮內(nèi)膜容受性的結(jié)論相同。南燕等[10]研究發(fā)現(xiàn),坤泰膠囊能改善子宮內(nèi)膜容受性,有助于胚胎的著床;此外宋暉等[11]研究發(fā)現(xiàn),坤泰膠囊具有促排卵作用,但是不會(huì)造成子宮內(nèi)膜過度增生,因此和促排卵藥物聯(lián)合應(yīng)用可降低促排卵藥物對(duì)子宮內(nèi)膜的不良影響,從而達(dá)到改善子宮內(nèi)膜容受性的作用。另外臨床研究也證實(shí),坤泰膠囊具有改善卵巢功能、調(diào)節(jié)雌激素水平、促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生,利于胚胎著床[12-13];還有研究顯示,坤泰膠囊對(duì)更年期大鼠子宮具有營養(yǎng)作用[14]。

    小鼠子宮內(nèi)膜的種植窗為第4~5天晨,約18 h[15]。胞飲突為目前公認(rèn)的子宮內(nèi)膜容受性評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。郭燕紅等[16]研究小鼠在合籠第4天,出現(xiàn)完全發(fā)育的胞飲突,本實(shí)驗(yàn)的B組與C組的LPAR3峰值均出現(xiàn)在第4天;與胞飲突的發(fā)育一致,可見LPAR3與胚胎著床確實(shí)關(guān)系密切。坤泰膠囊在改善子宮內(nèi)膜腺體數(shù)少、發(fā)育不良的同時(shí),也改善了LPAR3總體表達(dá)量,為此可見B組第4天較其他兩組腺體多、LPAR3的IOD值較其他兩組高,免疫組化與HE染色結(jié)果一致。為此,可推斷,LPAR3與胚胎著床關(guān)系密切,其可能通過黏附作用參與胚胎著床過程。郭燕紅等[16]研究表明,LPAR3在子宮內(nèi)膜著床期表達(dá),對(duì)評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜容受性有重要意義,可作為子宮內(nèi)膜容受性的良好評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。A組LPAR3峰值提前出現(xiàn)且較B組低,第4天腺體發(fā)育不良、間質(zhì)致密、血管較少,可見COH可能導(dǎo)致胚胎種植窗提前,造成胚胎與子宮內(nèi)膜發(fā)育不同步,而坤泰膠囊改善了COH小鼠內(nèi)膜的LPAR3時(shí)空表達(dá),并增加了LPAR3的表達(dá)量,從而起到改善小鼠子宮內(nèi)膜腺體發(fā)育,提高子宮內(nèi)膜容受性的作用。

    坤泰膠囊能促進(jìn)子宮內(nèi)膜發(fā)育,并能抵制促排卵藥物引起的子宮內(nèi)膜容受性降低,而此作用可能是通過改善LPAR3的正常時(shí)空表達(dá)及量的表達(dá)實(shí)現(xiàn);但LPAR3如何承上啟下發(fā)揮調(diào)節(jié)作用尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。

    參考文獻(xiàn)

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    [3]Ye X,Hama K,Contos JJ,et al.LPA3-mediated lysophosphatidic acid signalling in embryo implantation and spacing[J].Nature,2005,435(738):104-108.

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    [7]付連芳.控制性超排卵(COH)藥物GnRHα對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜整合素αv、β1表達(dá)的影響[J].醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床,2006,17(6):33-34,40.

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    [9]鄭瑞君,張宸銘.坤泰膠囊對(duì)原因不明性不孕癥子宮內(nèi)膜容受性的影響[J].中成藥,2014,36(11):2261-2264.

    [10]南燕,段予新,李玉潔等.坤泰膠囊對(duì)不孕癥患者子宮內(nèi)膜容受性的影響[J],新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,29(5):384-385.

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    Study on effect of Kuntai Capsule on mice endometrial receptivity*

    WangHui,LiYujie△,ChenFan,NanYan

    (DepartmentofObstetricsandGynecology,ThirdAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,Xinxiang,Henan453003,China)

    [Abstract]ObjectiveTo understand the effect of Kuntai Capsule on mice endometrial receptivity by comparing the lysophospholipids acid receptor-3(LPAR3) expression in endometrium during mouse embryos implantation period.MethodsNinety 6-8 week old Kunming female mice were randomly divided to three groups:the group A[controlled ovarian hyperstimulation(COH)],B (COH+Kuntai Capsule) and C(normal saline control),30 cases in each group.The vaginal plug was performed on the next day after mating.Five mice in each group were daily killed on 1-6 d.The serum estradiol(E2) and progesterone(P) levels were detected.The glands number and the immunohistochemical integrated optical density(IOD) were also determined.ResultsThe levels of serum E2 amd P in the group A and B were higher than those in the group C at the same period(P<0.05);in the HE staining,the glands number in the group A was significantly decreased compared with the group B and C(P<0.05).The IOD value of LPAR3 on 3 d in the group A was significantly lower than that in the group B and C(P<0.05),while the group B was slightly higher than the group C without statistical difference(P>0.05).ConclusionKuntai Capsule may play the role for improving the endometrial receptivity by improving the normal space-time expression of LPAR3.

    [Key words]Kuntai Capsule;endometrial receptivity;controlled ovarian hyperstimulation;lysophosphatidic acid receptors 3

    doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.18.005

    基金項(xiàng)目:2012年河南省高等學(xué)校骨干教師資助項(xiàng)目(2012GGJS-135)。

    作者簡介:王慧(1987-),住院醫(yī)師,碩士研究生,主要從事子宮內(nèi)膜容受性研究?!魍ㄓ嵶髡撸珽-mail:645482554@qq.com。

    [中圖分類號(hào)]R715.9

    [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

    [文章編號(hào)]1671-8348(2016)18-2464-03

    (收稿日期:2015-11-16修回日期:2016-03-08)

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