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    魷魚眼中透明質(zhì)酸的提取工藝

    2021-09-10 01:45:25沈蘭王婷婷
    科學(xué)與生活 2021年10期
    關(guān)鍵詞:透明質(zhì)酸提取工藝鑒定

    沈蘭 王婷婷

    摘要:透明質(zhì)酸是一種存在于生物體內(nèi)的大分子聚合物,化學(xué)成分為粘多糖,廣泛存在于動(dòng)物和人體結(jié)締組織及細(xì)胞外基質(zhì)中,具有特殊的生理作用和極強(qiáng)的保濕能力??蓮V泛應(yīng)用于醫(yī)藥、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。本文對魷魚眼透明質(zhì)酸的提取方法進(jìn)行了研究,實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉、等電點(diǎn)法脫蛋白質(zhì)與超濾相結(jié)合的加工工藝,運(yùn)用正交試驗(yàn)法對提取工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,并對產(chǎn)品的質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行了檢驗(yàn)。

    關(guān)鍵詞:透明質(zhì)酸;魷魚眼;提取工藝;鑒定

    1 前言

    透明質(zhì)酸(Hyaluranic acid,簡稱HA),廣泛存在于動(dòng)物結(jié)締組織,是一種由β-D-N-乙酰基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸為結(jié)構(gòu)單元以β-1,4-糖苷鍵縮合而成的一種酸性粘多糖,屬于糖胺聚糖。1934年,Meyer 和Palmer [1]從牛眼中最先分離出此種物質(zhì),發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸是由相同的二糖單體重復(fù)排列而形成的無支鏈的直鏈多聚物,無定型固體,無臭、無味,溶于水而不溶于有機(jī)溶劑,水溶液比旋度為-70°~80°[2]。

    透明質(zhì)酸兼具有高分子和大分子體積的特性,由葡萄糖醛酸-乙酞氨基葡萄糖為雙糖單位組成的直鏈高分子多糖,除了親水性外,透明質(zhì)酸較強(qiáng)的保濕性和粘彈性,在眼科、外科手術(shù)中有特殊的功效和較高的醫(yī)學(xué)臨床價(jià)值,。經(jīng)過半個(gè)多世紀(jì)的研究,人們對透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生理功能已有了明確的認(rèn)識,其研究領(lǐng)域不斷擴(kuò)展,透明質(zhì)酸已成為細(xì)胞生物、病理、免疫學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。

    本研究以魷魚(illex argentinus)加工下腳料--魚眼為原料,研究了魷魚眼透明質(zhì)酸的提取工藝,并對產(chǎn)品的理化性質(zhì)進(jìn)行了初步分析鑒定,使魷魚資源得以合理開發(fā)利用,利于提高其加工的綜合效益及經(jīng)濟(jì)附加值,變廢為寶。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 工藝流程

    魷魚眼→預(yù)處理→浸提→鹽析→脫蛋白質(zhì)→離心→濃縮→乙醇沉淀→超濾→干燥→成品

    2.2 操作要點(diǎn)

    魷魚眼預(yù)處理

    將冷凍著的魷魚眼睛放置在實(shí)驗(yàn)容器中溶解。

    浸提

    準(zhǔn)確稱取50 g魷魚眼置于DS-1型高速組織搗碎機(jī)中進(jìn)行組織搗碎,用去離子水浸提1-3次,將浸提液合并貯存于容器內(nèi)待用。

    鹽析

    向浸提液中加入去離子水配制成500 mL溶液,再加入5.85 g氯化鈉攪拌至溶解,使其溶液最終NaCl濃度為0.2 mol/L,靜置半小時(shí)。

    脫蛋白質(zhì)

    根據(jù)等電點(diǎn)法除蛋白質(zhì)法,用1:10的稀鹽酸加入溶液中,并輕微攪拌,使溶液pH調(diào)節(jié)至4.0左右,達(dá)到沉淀量最大。

    脫蛋白工藝確定:等電點(diǎn)法、三氯乙酸法[4]、Sevage法[4]

    離心

    脫蛋白的溶液通過DL-5低速大容量離心機(jī)離心,轉(zhuǎn)速5000 r/min,離心時(shí)間為45 min,去沉淀取上清液。

    濃縮

    上清液通過A-1000S水循環(huán)真空泵進(jìn)行真空濃縮,溫度控制在40~50℃最后使溶液濃縮到適宜濃度即可。

    乙醇沉淀

    在濃縮后的溶液中加入其3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉,然后離心取沉淀,復(fù)溶置于容器中。

    超濾

    用截留分子量為10000 Da的millipore labscale TFF system 超濾膜裝置超濾。

    干燥

    將超濾后的溶液進(jìn)行冷凍后,通過LGJ-10冷凍干燥機(jī)進(jìn)行真空冷凍干燥得到的白色粉末即為透明質(zhì)酸粉末。

    3 透明質(zhì)酸的分析

    3.1 理化分析

    3.1.1葡萄糖醛酸含量的測定[5]

    實(shí)驗(yàn)步驟:

    標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精確吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9、1 mL葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于帶塞試管中,各管加水至1 mL,在冰水浴中各管加入3 mL試劑A,搖勻后,于沸水浴中保持10 min,取出后冷至室溫,各管加0.2 mL試劑B,于沸水浴中保持15 min,取出冰水浴中冷卻。在室溫下,測定光吸收值(530 nm),以濃度對光吸收作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    樣品測定:準(zhǔn)確稱取15.0mg的樣品,定量于50 mL的容量瓶中,取1 mL樣品溶液于帶塞試管中,在冰水浴中各管加入3 mL試劑A,其余步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線制備操作。由所測得的光吸收值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)葡萄糖醛酸量。

    3.1.2 氨基葡萄糖含量的測定[6,7,8]

    實(shí)驗(yàn)步驟:

    氨基葡萄糖的鑒定

    精取樣品加適量4 moL/L鹽酸使成為8 mg/mL封安瓶中于100℃烘箱中水解14 h。取0.75 mL稀釋至10 mL。

    低溫乙酰丙酮反應(yīng):測光吸收(530 nm)為AL。

    高溫乙酰丙酮反應(yīng):測吸光度(530 nm)為AH。

    AH/AL≈1,為半乳糖胺 AH/AL﹥1,為葡糖糖胺

    標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:分取鹽酸葡萄糖胺0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL于帶塞試管中,各加水至5mL,加1 mL乙酰丙酮試液(B),置沸水中25 min,用迅速冷卻后,各管加無水乙醇3 mL及對二氨基苯甲醛試液1 mL,強(qiáng)力振搖,20~25 ℃下放置1 h,以0 mL為空白,測吸光度(530 nm)。

    樣品測定:取樣品2 mg左右,置50 mL容量瓶中,加6 moL/L鹽酸1.5 mL,沸水浴中水解1 h,冷卻后用NaOH中和至中性,用水稀釋至刻度,取2 mL樣液,加水至5 mL其他操作同上。

    3.2 光譜分析

    3.2.1紫外光譜分析[9]

    樣品配成1 mg/mL透明質(zhì)酸溶液,UV-240紫外可見分光光度計(jì)掃描,掃描范圍為190~300 nm。

    3.2.2紅外光譜分析[10]

    透明質(zhì)酸微量樣品KBr壓片后,用Nicolet Nexus 5DXC FT-IR紅外光譜儀在4000-500 cm-1區(qū)域內(nèi)進(jìn)行紅外掃描。

    3.3 透明質(zhì)酸提取率和得率的計(jì)算

    透明質(zhì)酸提取率=透明質(zhì)酸含量(g)/魷魚眼睛質(zhì)量(g)×100%,以干基(扣除魷魚眼睛原料水含量)計(jì)。葡萄糖醛酸測量值除以46.32%[13],即可得到HA的含量。

    透明質(zhì)酸得率=提取的透明質(zhì)酸質(zhì)量(g)/魷魚眼睛質(zhì)量(g)×100%,以干基計(jì)。

    4 結(jié)果與分析

    4.1透明質(zhì)酸提取的正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

    根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇浸提次數(shù)、浸提時(shí)間、料液比三因素,采用L9(33)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表1。

    在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的范圍內(nèi),最佳方案為A2B3C2,即提取3次,浸提時(shí)間3 h,料水比1:6。

    在以上得到的優(yōu)化工藝參數(shù)條件下,重復(fù)多次,透明質(zhì)酸的平均提取率為3.58%,。

    4.2脫蛋白工藝的確定

    實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),從魷魚眼睛中提取的透明質(zhì)酸溶液含有較多的蛋白質(zhì)雜質(zhì),因此,脫蛋白成為整個(gè)提取工藝的關(guān)鍵之處。當(dāng)pH值為4時(shí)脫蛋白效果最好,同時(shí),在實(shí)驗(yàn)過程中,也發(fā)現(xiàn)pH值=4時(shí)上清液澄清。所以,用等電點(diǎn)法除蛋白質(zhì),適宜pH值應(yīng)取4。

    4.3透明質(zhì)酸的質(zhì)量指標(biāo)

    根據(jù)上述工藝,所制備的產(chǎn)品主要為透明質(zhì)酸,每千克魷魚眼睛干原料可獲29.6g產(chǎn)品,產(chǎn)品的總得率達(dá)2.96%,產(chǎn)品純度為72.21%。

    4.4紫外光譜分析

    從紫外吸收光譜(見圖1)分析得,樣品在201~207 nm有很強(qiáng)的多糖吸收峰,而在280、260 nm處無強(qiáng)烈的吸收峰,說明制品透明質(zhì)酸中蛋白質(zhì)和核酸含量極少。

    4.5紅外光譜分析

    如圖2的紅外光譜圖譜所示,3407.95 cm-1出現(xiàn)強(qiáng)烈的O-H伸縮振動(dòng),表明存在多羥基結(jié)構(gòu);在2922.72 cm-1處出現(xiàn)的-CH伸縮振動(dòng),1613.19 cm-1和1409.33 cm-1強(qiáng)銳峰為羧基的反對稱及對稱伸縮振動(dòng)峰;1409.33 cm-1和1322.42 cm-1有-C-O-的伸縮振動(dòng)和-OH的彎曲振動(dòng)偶合產(chǎn)生的兩個(gè)吸收峰,表明存在著糖醛酸上解離羧基和多羥基結(jié)構(gòu);1148.79 cm-1、1043.86 cm-1、945.52 cm-1左右的吸收峰為糖的特征吸收峰。以上情況與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)品譜圖相吻合,表明產(chǎn)品樣呈較典型的透明質(zhì)酸紅外光吸收。

    5 結(jié)論

    魷魚眼睛中透明質(zhì)酸的最佳提取工藝參數(shù):浸提次數(shù)為3次,浸提時(shí)間為3 h,料液比為1:6;等電點(diǎn)除蛋白質(zhì)的最佳pH值為4。在此提取條件下,產(chǎn)品的總得率為2.96%,純度為72.21%。

    本實(shí)驗(yàn)采用等電點(diǎn)法脫雜蛋白,操作簡單,污染較少,成本較低,效果較佳。

    參考文獻(xiàn):

    [1] Meyer K, Palmer J W. The polysaccharide of the vitreous houmor[J].J Biol Chem,1934,107: 629~633.

    [2] 潘紅梅.透明質(zhì)酸的研究現(xiàn)狀綜述[J].四川食品與發(fā)酵,2003,2(1):5~9.

    [3] 閻家麒,賈定武,趙敏.透明質(zhì)酸生產(chǎn)菌菌種誘變選育及發(fā)酵工藝研究[J].中國醫(yī)藥工業(yè)志,1994,25(4):145~147.

    [4] 虞菊萍,高向東.透明質(zhì)酸精制方法的比較[J].藥學(xué)與臨床研究,2007,15(4):300~302.

    [5] 李薇,佟愛東,鄧兆勇.透明質(zhì)酸化學(xué)定量分析方法的研究[J].中國生化藥物雜志,1994,15(2):96~99.

    [6] 張惟杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù)[M].上海:上??茖W(xué)技術(shù)出版社,1987:283~290.

    [7] 肖凱軍,李琳.鯊魚軟骨粘多糖及其分離純化和應(yīng)用[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 1999,11(2):163~169.

    [8] 李建武.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M].第二版.北京:北京大學(xué)出版社,1994:125~165.

    [9] 羅曼,蔣立科,奚俊.牛眼透明質(zhì)酸的分離及性質(zhì)測定[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1999,26(6):596~600.

    [10] 樊東輝,吳蓓蓓,徐政,等.透明質(zhì)酸鈉的光譜學(xué)分析[J].中國生化藥物雜志,2006,27(01):22~25.

    [11] 史鵬. 發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸下游提取工藝方法的研究[D].西北大學(xué),2005.

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