紅螯螯蝦卵黃蛋白原VWD結(jié)構(gòu)域的原核表達及純化

文露婷 許藝蘭 童桂香 黃黎明 楊彥豪 杜雪松 黃光華 韋信賢 王瑞 楊慧贊

摘要：【目的】原核表達紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）卵黃蛋白原（Vg）VWD結(jié)構(gòu)域，為深入開展Vg的生物學功能研究和開發(fā)相應(yīng)的生物活性物質(zhì)提供技術(shù)支持，也為改進蝦類養(yǎng)殖催熟及獲取高質(zhì)量后代打下基礎(chǔ)?！痉椒ā吭贕enBank中搜索紅螯螯蝦卵Vg的mRNA序列（AF306784.1）及查找其VWD結(jié)構(gòu)域（2345～2491 aa），采用ExPASy ProtParam、ProtScale、InterProscan及TMHMM等在線軟件進行生物信息學分析及理論評估，結(jié)合大腸桿菌密碼子偏好優(yōu)化原始VWD氨基酸序列;然后通過全基因合成獲得目的基因，連接至載體pET-28a構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-VWD，挑取陽性克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（λDE3）感受態(tài)細胞及采用IPTG進行誘導表達，并以10% SDS-PAGE電泳和Wes-tern blotting檢測誘導表達的融合蛋白?！窘Y(jié)果】紅螯螯蝦VWD結(jié)構(gòu)域相對分子量為19692.11 Da，理論等電點（pI）為9.35，分子式為C855H1334N258O261S9，屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白，不含跨膜結(jié)構(gòu)域。延伸鏈和無規(guī)則卷曲是紅螯螯蝦VWD結(jié)構(gòu)域二級結(jié)構(gòu)的主要元件，其中，α-螺旋占7.73%，β-轉(zhuǎn)角占10.50%，延伸鏈占35.91%，無規(guī)則卷曲占45.86%。重組質(zhì)粒pET-28a-VWD經(jīng)大腸桿菌BL21（λDE3）感受態(tài)細胞誘導表達即獲得融合蛋白VWD，以2 mol/L鹽酸胍溶解和Ni-NTA親和層析純化及復性后，10% SDS-PAGE電泳和Western blotting檢測均在蛋白相對分子量約20.0 kD處出現(xiàn)1條清晰的特異性條帶，融合蛋白VWD表達形式以包涵體為主。融合蛋白VWD在BL21（λDE3）感受態(tài)細胞中高效表達的最佳誘導條件：當單克隆菌液OD600 nm達0.6時添加0.5 mmol/L IPTG，置于20 ℃下誘導培養(yǎng)16 h。純化后的融合蛋白VWD濃度為1.32 mg/mL?！窘Y(jié)論】通過全基因合成獲得的優(yōu)化紅螯螯蝦VWD基因能在大腸桿菌BL21（λDE3）感受態(tài)細胞中誘導表達出以包涵體為主要形式的融合蛋白，經(jīng)鹽酸胍溶解和Ni-NTA親和層析柱純化及復性即可獲得高純度的活性VWD蛋白，為后續(xù)開展紅螯螯蝦Vg生物學功能研究及開發(fā)相應(yīng)的生物活性物質(zhì)提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞： 紅螯螯蝦;卵黃蛋白原（Vg）;VWD結(jié)構(gòu)域;全基因合成;原核表達;包涵體

中圖分類號： S966.12? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）05-1378-09

Abstract：【Objective】Prokaryotic expression of the vitellogenin（Vg） VWD domain of red claw crayfish（Cherax quadricarinatus） not only provided technical support for further research on the biological function of Vg and the development of corresponding bioactive substances， but also laid? foundation for improving C. quadricarinatus culture， accelera-ting ripening and obtaining high-quality offspring. 【Method】The protein sequence of VWD domain（2345-2491 aa） was found according to the Vg mRNA sequence（accession number：AF306784.1） of C. quadricarinatus published in GenBank database. Bioinformatics analysis and theoretical evaluation were carried out by using online softwares such as ExPASyProtParam， ProtScale， InterProscan and TMHMM. Optimization of original VWD amino acid sequence combined with codon preference of Escherichia coli. Then the target gene was obtained by whole gene synthesis，and the recombinant plasmid E. coli pET-28a-VWD was constructed by connecting to vector pET-28a，and transformed into positive clone conversion BL21（λDE3） competent cells which were induced by IPTG. The induced fusion protein was detected by 10% SDS-PAGE electrophoresis and Western blotting.【Result】The relative molecular weight of VWD domain of C. quadricarinatus was 19692.11 Da， theoretical isoelectric points（pI）was 9.35， and the molecular formula was C855H1334N258O261S9. It was an unstable hydrophilic protein and did not contain a transmembrane domain. Extended chain and irregular curl were the main elements of the secondary structure of VWD domain in C. quadricarinatus， among which， α-helix accounted for 7.73%， β-turn accounted for 10.50%， the extended chain accounted for 35.91%， and the irregular curl accounted for 45.86%. The recombinant plasmid pET-28a-VWD expressed the fusion protein VWD by inducing the competent cells E. coli BL21（λDE3）. After dissolution with 2 mol/L guanidine hydrochloride and purification and renaturation on Ni-NTA affinity chromatography column， a clear specific band appeared at the relative molecular weight of the protein about 20.0 kD by 10% SDS-PAGE electrophoresis and Western blotting. The expression form of fusion protein VWD was mainly inclusion body. The best induction conditions for high expression of the fusion protein VWD in the competent cells BL21 （λDE3）： when the OD600 nm of the monoclonal bacterial solution reached 0.6， 0.5 mmol/L IPTG was added and cultured at 20 ℃ for 16 h. The concentration of purified fusion protein VWD was 1.32 mg/mL. 【Conclusion】The optimized VWD gene of C. quadricarinatus obtained by whole gene synthesis can be expressed in E. coli competent cells BL21（λDE3），and the expression form of fusion protein VWD is mainly inclusion body. After dissolving with guanidine hydrochloride and purifying and renaturating with Ni-NTA affinity chromatography column， high-purity active VWD protein can be obtained， which provides technical support for the subsequent research on the biological function of C. quadricarinatus Vg and the development of corresponding bioactive substances.

Key words： Cherax quadricarinatus; vitellogenin（Vg）; VWD domain; whole gene synthesis; prokaryotic expre-ssion;inclusion body

Foundation item： Guangxi Key Science and Technology Project（Guike AA17204095-5，Guike AA17204094-7）; Guangxi Natural Science Foundation（2019GXNSFAA185036）;Guangxi Key Research and Development Project（Guike AB182 21068）

0 引言

【研究意義】卵黃蛋白原（Vitellogenin，Vg）是卵黃蛋白（Yolk protein）的前體，是由若干個基因編碼的特異性高分子量蛋白，富含糖、磷、脂，存在于卵生和非哺乳類性成熟的動物血液中（Avarre et al.，2007;王加偉等，2016），可為動物胚胎發(fā)育提供和轉(zhuǎn)運氨基酸、脂肪、維生素、硫及鈣等營養(yǎng)物質(zhì)。除了已知的營養(yǎng)和運輸功能外，Vg在進入卵細胞的過程中還發(fā)揮著其他非營養(yǎng)性功能（盧建平和姜乃澄，2000;潘杰，2020）。在褐飛虱和煙粉虱等蟲體內(nèi)，Vg可被病原微生物所利用，實現(xiàn)入卵傳播（Cheng and Hou，2005;Wei et al.，2017）;在蚊子體內(nèi)，Vg通過調(diào)節(jié)含硫酯鍵蛋白（Thioester-containing protein 1）表達，而實現(xiàn)對瘧原蟲免疫清除的調(diào)控（Rono and Ceccarelli，2010）;在蜜蜂血淋巴中，Vg通過與病原微生物細胞壁的脂磷壁酸或脂多糖互作，介導昆蟲對病原微生物的免疫清除等（Salmela et al.，2015）。此外，Vg可作為一種雌激素和類雌激素的標志物，應(yīng)用于水環(huán)境中內(nèi)分泌干擾物、環(huán)境毒理與污染等狀況的調(diào)查研究（周慶祥和江桂斌，2003）。Vg具有豐富的生物功能和極高的研究價值，因此開展Vg外源表達及純化研究，對進一步挖掘其生物學功能及綜合利用開發(fā)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，關(guān)于Vg的研究主要集中在生物學功能（Li et al.，2009;Garcia et al.，2010）、分子結(jié)構(gòu)特征（Dalvin et al.，2011;Sun et al.，2013）及表達調(diào)控機制（Lu et al.，2016;Luo et al.，2017）等方面。大量研究表明，無論是在無脊椎動物還是在脊椎動物中，Vg的分子結(jié)構(gòu)及其功能均具有一定的相似性，同時又具有各自的獨特性。Vg一般含有3個非常保守的結(jié)構(gòu)域，分別是卵黃蛋白原N氨基端的結(jié)構(gòu)域（VitN）、羧基端的血管性血友病因子結(jié)構(gòu)域（VWD）及未知功能的結(jié)構(gòu)域（DUF）（Tufail and Takeda，2008）。VitN結(jié)構(gòu)域是Vg最主要的磷酸化位點，也是重要的蛋白修飾區(qū)域，包含Vg與卵黃蛋白原受體（VgRs）的互作位點，在Vg的剪切、Vg-VgRs識別及其所介導的營養(yǎng)運輸中發(fā)揮重要作用;VWD結(jié)構(gòu)域和DUF結(jié)構(gòu)域則具有與病毒或細菌等病原微生物互作的功能，能對病原微生物進行識別清除，并介導其垂直傳播（霍巖等，2018）。已有研究發(fā)現(xiàn)，通過干擾果蠅Vg與VgRs結(jié)合，能影響其體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒進入卵細胞（Leblanc et al.，2000;Brasset et al.，2006）。Li等（2009）研究發(fā)現(xiàn)魚類Vg對細菌的細胞壁脂多糖和磷脂壁酸具有識別功能，能促使細菌裂解。Huo等（2014）研究表明，雄性灰飛虱體內(nèi)Vg的DUF結(jié)構(gòu)域和VWD結(jié)構(gòu)域可與水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合，再通過與營養(yǎng)細胞表面的VgRs結(jié)合而進入卵母細胞內(nèi)，達到垂直傳播的目的。針對紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）Vg的相關(guān)研究，Abdu等（2002）通過克隆及測序分析紅螯螯蝦Vg基因全長cDNA序列，證實其編碼2584個氨基酸殘基，與其他甲殼類動物的Vg序列相似性在65%左右，靠近基因3'端的區(qū)域編碼一種帶負電荷且具有結(jié)合鈣能力的蛋白質(zhì)（P106）;Shechter等（2005）通過摘除雄性紅螯螯蝦的竇腺復合體（XO-SG）誘導Vg轉(zhuǎn)錄、翻譯和釋放，發(fā)現(xiàn)該過程與雌性個體的卵黃發(fā)生過程相似，Vg在紅螯螯蝦蛻皮間期未發(fā)生表達，但在脫殼后早期高表達?？梢姡鞔_Vg在內(nèi)分泌調(diào)控蛻皮甲殼類動物中的表達情況，可為研究甲殼類動物Vg表達和翻譯的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機制及揭示蛻皮與生殖內(nèi)分泌軸間的關(guān)系提供誘導模型?！颈狙芯壳腥朦c】至今，針對甲殼類動物Vg的研究主要集中在Vg表達調(diào)控、生物學功能及其機制方面，有關(guān)Vg單個結(jié)構(gòu)域具體功能及其作用機制的研究鮮見報道，尤其是VWD結(jié)構(gòu)域。Vg各結(jié)構(gòu)域的分子結(jié)構(gòu)及其生物學功能存在明顯差異，因此有必要對各結(jié)構(gòu)域進行單獨研究，以探明其具體的作用機制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對紅螯螯蝦Vg的VWD結(jié)構(gòu)域（2345～2491 aa）進行生物信息學分析及理論評估，設(shè)計并優(yōu)化其基因序列，采用全基因合成獲得優(yōu)化基因序列，并通過原核表達載體誘導表達VWD蛋白，為深入開展Vg的生物學功能研究和開發(fā)相應(yīng)的生物活性物質(zhì)提供技術(shù)支持，也為改進蝦類養(yǎng)殖催熟及獲取高質(zhì)量后代打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

大腸桿菌BL21（λDE3）感受態(tài)細胞由廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室保存提供。載體pET-28a、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Ni-NTA純化樹脂預裝柱非預染蛋白Marker、預染蛋白Marker、蛋白濃度定量試劑盒、TMB顯色試劑盒及IPTG等購自生工生物工程（上海）股份有限公司;兔抗His-Tag抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔IgG抗體購自德國Merck公司;Pfu高溫聚合酶、限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶購自美國Promega公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1. 2 VWD序列生物信息學分析

登錄GenBank搜索紅螯螯蝦Vg的mRNA序列（AF306784.1），導出其VWD結(jié)構(gòu)域（2345～2491 aa），利用NCBI ORFFinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）查找VWD基因的開放閱讀框（ORF）并推導其氨基酸序列。將推導的氨基酸序列提交至ExPASy數(shù)據(jù)庫（https：//www.expasy.org/），采用ProtParam、ProtScale、InterProscan和TMHMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）等在線分析軟件分別進行親/疏水性、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域及基本結(jié)構(gòu)等生物學信息進行分析和理論評估。

1. 3 序列優(yōu)化與全基因合成

根據(jù)VWD氨基酸序列的評估結(jié)果及大腸桿菌密碼子偏好性，通過OPTIMIZER（http：//genomes.urv.es/OPTIMIZER/）和DNAWORKS（https：//hpcwebapps.cit.nih.gov/dnaworks/）對原始VWD氨基酸序列進行密碼子優(yōu)化及序列改造，設(shè)計優(yōu)化目的片段的全基因合成方案：將優(yōu)化后目的片段分割成18段帶有重疊序列的寡核苷酸片段（F：5'-GACACGGATCCCT TACAACCGT-3';R：5'-GTGTCCTCGAGTTAGCCG GACGGAG-3'，下劃線部分分別為BamH I和Xho I酶切位點），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。全基因合成策略是將合成的18段寡核苷酸片段混合在一個體系中，通過第一輪PCR擴增的多個熱循環(huán)和退火實現(xiàn)目的片段的全長序列拼接，再利用首尾引物通過第二輪PCR進一步擴增和富集全長目的基因。第一輪PCR反應(yīng)體系50.0 ?L：18對引物Mix各0.5 ?L，dNTP（25 mmol/L）1.0 ?L，10×Pfu Buffer 5.0 ?L，Pfu高溫聚合酶（5 U/?L）0.4 ?L，ddH2O補足至50.0 ?L。擴增程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 22 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，進行20個循環(huán);72 ℃延伸5 min。以第一輪PCR產(chǎn)物為模板進行第二輪PCR擴增，反應(yīng)體系50.0 ?L：首尾引物各2.0 ?L（引物濃度同上），第一輪PCR產(chǎn)物（模板），dNTP（25 mmol/L）1.0 ?L，10×Pfu Buffer 5.0 ?L，Pfu高溫聚合酶（5 U/?L）0.4 ?L，ddH2O補足至50.0 ?L。擴增程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 22 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，進行22個循環(huán);72 ℃延伸5 min。第二輪PCR擴增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對特異性條帶進行純化回收。

1. 4 重組表達載體構(gòu)建與驗證

根據(jù)引物設(shè)計的酶切位點，利用BamH I和Xho I對純化回收得到的目的基因和載體pET-28a進行雙酶切。目的基因酶切體系50.0 ?L：純化回收的目的基因20.0 ?L（1.0 ?g），10×FD Buffer 5.0 ?L，BamH I和Xho I各1.0 ?L（10 U/?L），ddH2O 23.0 ?L。載體pET-28a酶切體系50.0 ?L：pET-28a 1.0 ?g，10×FD Buffer 5.0 ?L，BamH I和Xho I各1.0 ?L（10 U/?L），ddH2O補足至50.0 ?L。將上述2個酶切體系分別放入37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)2 h。將酶切后純化回收的目的DNA片段和pET-28a進行連接，連接體系20.0 ?L：目的片段酶切產(chǎn)物8.0 ?L，pET-28a酶切產(chǎn)物4.0 ?L，10×T4 DNA Ligase Buffer 2.0 ?L，T4 DNAigase 1.0 ?L（5 U/?L）， ddH2O補足至20.0 ?L。將上述連接混合液放入22 ℃的PCR儀內(nèi)反應(yīng)1 h，然后轉(zhuǎn)化BL21（λDE3）感受態(tài)細胞，均勻涂布于含卡拉霉素的LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，進行酶切驗證，反應(yīng)體系10.0 ?L：重組質(zhì)粒100 ng，10×FD Buffer 1.0 ?L，BamH I和Xho I各1.0 ?L（10 U/?L），ddH2O補足至10.0 ?L，置于37 ℃恒溫水浴鍋中消化2 h。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將陽性克隆接種至含卡拉霉素的LB肉湯培養(yǎng)基中，250 r/min搖床培養(yǎng)過夜，菌液送至北京華大基因科技有限公司測序。測序引物為載體pET-28a的T7啟動子和終止子通用引物（5'端測序引物5'-TAATACGACT CACTATAGGG-3'，3'端測序引物5'-GCTAGTTATT GCTCAGCGGG-3'）。

1. 5 VWD蛋白原核表達

成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pET-28a-VWD，挑取陽性克隆轉(zhuǎn)化BL21（λDE3）感受態(tài)細胞，熱激后涂布于含卡拉霉素的LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜;挑取單克隆菌落接種至含卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中進行37 ℃活化培養(yǎng)，當菌液OD600 nm達0.6時，添加一定濃度的IPTG，分別于16和20 ℃下培養(yǎng)16 h，再置于37 ℃下培養(yǎng)4 h，設(shè)未添加IPTG的為陰性對照。取菌液12000 r/min離心5 min，棄上清液，收集菌體沉淀，加入PBS（pH 7.4）進行懸浮，利用超聲波破碎儀使其充分溶解，離心后棄上清液，向沉淀中加入緩沖液A（8 mol/L Urea，50 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，pH 8.0）進行溶解，再次離心，向上清液和沉淀中分別加入等體積的2×Loading Buffer，煮沸后進行10% SDS-PAGE電泳，通過考馬斯亮藍（R250）染色確定蛋白表達量及純度，進而確定誘導表達所需的最佳IPTG濃度、誘導溫度及誘導時間。最后于最佳誘導條件下進行大量表達，菌液在4 ℃下3000 r/min離心10 min后，收集菌體沉淀。

1. 6 融合蛋白純化

向收集到的菌體中加入緩沖液B（8 mol/L Urea，50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，0.1% Triton X-100，pH 8.0），4 ℃靜置30 min后置于冰上進行200 W的多次間歇性超聲波破碎，待菌液澄清后，4 ℃下12000 r/min離心10 min，收集上清液粗蛋白（包涵體），加入2 mol/L鹽酸胍進行溶解。取5 mL的Ni-NTA親和層析柱，以5倍柱床體積的Binding Buffer清洗平衡柱，流速5 mL/min;將粗蛋白與平衡后的Ni-NTA親和層析柱填料孵育1 h;孵育后的產(chǎn)物上柱進行提純和復性，收集流出液;先用Binding Buffer清洗平衡柱，接著以Washing Buffer洗柱，收集流出液;用Elution Buffer再次洗脫，收集流出液。分別對粗蛋白、洗雜流出液及洗脫流出液進行處理，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后進行R250染色分析。將純度較高的6個組分分別加入到緩沖液C（50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，0.1% SKL，pH 8.5）中進行透析，透析結(jié)束采用PEG-20000進行濃縮，0.45 μm濾膜過濾后分裝為1 mL/管，-80 ℃保存。

1. 7 融合蛋白表達驗證

對復性且純化后的融合蛋白進行制樣，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后，在200 mA恒定電流及低溫條件下轉(zhuǎn)膜（PVDF）2 h，再以含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，將兔抗His-Tag抗體進行1∶2000稀釋，HRP標記羊抗兔IgG抗體進行1∶5000稀釋，常溫孵育過夜，洗膜3次，將TMB顯色液滴加到PVDF膜上顯色，進行Western blotting特異性驗證。

2 結(jié)果與分析

2. 1 紅螯螯蝦VWD結(jié)構(gòu)域生物信息學分析結(jié)果

2. 1. 1 紅螯螯蝦VWD結(jié)構(gòu)域的理化性質(zhì) 紅螯螯蝦VWD結(jié)構(gòu)域相對分子量為19692.11 Da，理論等電點（pI）為9.35，負電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為12個，正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為15個，共計2717個原子，分子式為C855H1334N258O261S9，不穩(wěn)定系數(shù)為40.74，大于40，即為不穩(wěn)定蛋白;其脂肪指數(shù)為63.98，親水性平均系數(shù)（GRAVY）為-0.367，ProtScale預測結(jié)果（圖1）也表明該蛋白的親水氨基酸數(shù)量分布明顯多于疏水氨基酸，故推測為親水性蛋白。經(jīng)TMHMM預測顯示，編碼VWD結(jié)構(gòu)域的181個氨基酸殘基全部位于細胞膜外，即不含跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2）。

2. 1. 2 紅螯螯蝦VWD結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特征 利用SOPMA對紅螯螯蝦VWD結(jié)構(gòu)域二級結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)果如圖3所示。紅螯螯蝦VWD結(jié)構(gòu)域二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋（Alpha helix）、延伸鏈（Extended strand）、β-轉(zhuǎn)角（Beta turn）及無規(guī)則卷曲（Random coil）4種類型構(gòu)成，其中，α-螺旋有14個（占7.73%），β-轉(zhuǎn)角有19個（占10.50%），延伸鏈有65條（占35.91%），無規(guī)則卷曲有83個（占45.86%），即延伸鏈和無規(guī)則卷曲是VWD結(jié)構(gòu)域二級結(jié)構(gòu)的主要元件。α-螺旋聚集在第20～40位氨基酸間，β-轉(zhuǎn)角則零星散布于整個氨基酸序列中。

紅螯螯蝦VWD結(jié)構(gòu)域三級結(jié)構(gòu)是以c6rbfA蛋白結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)進行同源建模，其中對齊殘基數(shù)為137個，覆蓋率為76%，一致性為17%，預測可信度為100%。紅螯螯蝦VWD結(jié)構(gòu)域三級結(jié)構(gòu)（圖4）由上下兩層Sheet片段通過長鏈卷曲相連接而成，其下層還包含一段螺旋結(jié)構(gòu)。

2. 2 重組質(zhì)粒pET-28a-VWD驗證結(jié)果

2. 2. 1 全基因合成驗證結(jié)果 通過全基因合成獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在450 bp附近出現(xiàn)單一、明亮的特異性條帶（圖5），與預期設(shè)計的目的基因大小相符，說明已成功合成獲得紅螯螯蝦VWD基因。

2. 2. 2 重組質(zhì)粒pET-28a-VWD鑒定結(jié)果? 提取重組質(zhì)粒pET-28a-VWD，經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切后進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果（圖6）顯示，酶切產(chǎn)物為2條大小約5300和450 bp的片段，與預期結(jié)果相符。對篩選出的陽性克?。ㄖ亟M質(zhì)粒pET-28a-VWD）進行增菌培養(yǎng)，菌液送至北京華大基因科技有限公司測序，其測序結(jié)果與NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）已公布紅螯螯蝦Vg基因的核苷酸序列（AAG17936.1）相似性為100.0%，而推導氨基酸序列與紅螯螯蝦Vg氨基酸序列（AAS68191.1）的相似性為75%，說明通過全基因合成并克隆轉(zhuǎn)化獲得的氨基酸序列即為紅螯螯蝦Vg的VWD結(jié)構(gòu)域，同時確認重組質(zhì)粒pET-28a-VWD構(gòu)建成功。

2. 3 融合蛋白VWD表達形式鑒定結(jié)果

為確定融合蛋白VWD的表達形式，將擴培菌液經(jīng)超聲波裂解后進行離心，收集上清液和菌體沉淀，分別采用10% SDS-PAGE電泳進行檢測，并進行R250染色分析，結(jié)果如圖7所示。在各誘導溫度下，菌體沉淀泳道均在蛋白相對分子量約20.0 kD處現(xiàn)出1條清晰的特異性條帶，而在上清液中檢測不到對應(yīng)的條帶，說明融合蛋白VWD的表達形式以包涵體為主。

2. 4 融合蛋白VWD分離及純化效果

向超聲波裂解獲得的包涵體中加入2 mol/L鹽酸胍溶解，經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化及復性后進行10% SDS-PAGE電泳，結(jié)果（圖8）顯示，在蛋白相對分子量約20.0 kD處出現(xiàn)1條明顯的特異性條帶，其大小與預期結(jié)果（19.7 kD）相符。采用不同濃度的咪唑（Imidazole）對分離獲得的融合蛋白VWD進行洗脫純化，結(jié)果表明，隨著洗脫液濃度的增加，純化產(chǎn)物的條帶越清晰，雜質(zhì)逐漸變少，其中以500 mmol/L咪唑的洗脫純化效果最佳。

2. 5 融合蛋白VWD表達驗證結(jié)果

融合蛋白VWD采用500 mmol/L咪唑進行洗脫層析，得到的純化融合蛋白VWD以10% SDS-PAGE電泳進行檢測，結(jié)果（圖9）顯示，在蛋白相對分子量約20.0 kD的相應(yīng)位置出現(xiàn)單一、清晰的特異性條帶，無雜帶，可初步確定融合蛋白VWD在復性的同時得到高效純化。Western blotting檢測結(jié)果（圖10）也發(fā)現(xiàn)，在約20.0 kD的相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯的特異性條帶，說明純化獲得的融合蛋白VWD即為紅螯螯蝦VWD結(jié)構(gòu)域的原核表達蛋白。采用非干擾型蛋白定量試劑盒測定純化融合蛋白VWD濃度，得知其濃度為1.32 mg/mL。

3 討論

Vg的VWD結(jié)構(gòu)域具有與病毒或細菌互作的特性，對病原微生物進行識別及介導其清除或垂直傳播均有密切聯(lián)系。Vg作為卵黃蛋白的前體，是卵生動物胚胎發(fā)育的主要營養(yǎng)來源（羅明坤等，2015;潘賢輝等，2018）;Vg作為卵內(nèi)的重要營養(yǎng)蛋白，除了已知的營養(yǎng)運輸功能之外，在進入卵細胞的過程中還發(fā)揮著其他非營養(yǎng)性功能（霍巖等，2018）。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Vg以多種功能參與宿主的免疫防御（Salmela et al.，2015），但不同Vg基因編碼的所有Vg蛋白是否都發(fā)揮免疫作用尚未明確，Vg不同結(jié)構(gòu)域與各種免疫功能的相關(guān)性也不清楚。Sun等（2013）從斑馬魚肝臟組織中提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用RACE克隆斑馬魚rDUF1943、rDUF1944和rVWD基因cDNA序列，然后構(gòu)建表達載體進行表達與純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導表達獲得的融合蛋白rDUF1943、rDUF1944和rVWD均能結(jié)合金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌等革蘭氏陽性菌及大腸桿菌和鰻弧菌等革蘭氏陰性菌，即DUF1943、DUF1944和VWD可能在Vg發(fā)揮模式識別受體功能時扮演著重要角色。本研究通過對紅螯螯蝦Vg的VWD結(jié)構(gòu)域進行單獨克隆、表達及純化，以期制備獲得VWD蛋白用于后續(xù)相關(guān)的生物學功能及機制研究。與Sun等（2013）的研究不同，本研究是基于NCBI已公布紅螯螯蝦Vg的VWD結(jié)構(gòu)域（2345～2491 aa）進行生物信息學分析及理論評估，并結(jié)合大腸桿菌密碼子偏好對原始VWD氨基酸序列進行優(yōu)化及改造，然后通過全基因合成獲得目的基因，省去了模板制備和文庫構(gòu)建的相關(guān)步驟。

全基因合成技術(shù)是通過對基因序列進行改造，優(yōu)化后的目的基因編碼序列更符合宿主細胞密碼子的偏好性，能有效解決原核生物和真核生物在翻譯前后修飾過程差異所造成真核生物無法在大腸桿菌上表達及正確折疊的問題，使目的基因在大腸桿菌中得以正確轉(zhuǎn)錄和翻譯（Papamichail et al.，2016）。本研究結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pET-28a-VWD在大腸桿菌BL21（λDE3）感受態(tài)細胞中高效表達的最佳誘導條件：當單克隆菌液OD600 nm達0.6時添加0.5 mmol/L IPTG，置于20 ℃下誘導培養(yǎng)16 h能獲得最大的融合蛋白表達量;獲得的融合蛋白VWD主要以包涵體形式表達，經(jīng)2 mol/L鹽酸胍溶解和Ni-NTA親和層析純化后可獲得高純度的活性VWD蛋白。大腸桿菌是目前用于重組蛋白異源表達最成熟的原核表達系統(tǒng)（謝磊等，2004），是借助胞質(zhì)將外源蛋白通過可溶性（活性肽）或非可溶性（包涵體）的形式進行表達（張永德等，2018）。大腸桿菌胞質(zhì)是一個還原性較強的環(huán)境，極易阻礙胞質(zhì)內(nèi)所表達外源蛋白或多肽中二硫鍵的正確形成，進而折疊形成不具生物活性的包涵體（Rosano and Ceccarelli，2014;張永德等，2018）。因此，要獲得活性蛋白用于生物學功能研究，可對目的基因進行改造，接入信號肽分子引導外源蛋白分泌到周質(zhì)空間進行折疊，或?qū)⒛康牡鞍着c大腸桿菌的外膜蛋白融合表達也可誘導其分泌到周質(zhì)空間中（Meng et al.，2011;Klint et al.，2013）。本研究通過密碼子優(yōu)化大量表達獲得融合蛋白VWD包涵體，后續(xù)使用2 mol/L鹽酸胍對包涵體進行溶解，以降低蛋白結(jié)構(gòu)柔韌性，干擾其聚集，接著采用攜帶His-Tag標簽的Ni-NTA親和層析柱對包涵體進行純化及復性，最后通過透析去除變性劑以促進折疊。

4 結(jié)論

通過全基因合成獲得的優(yōu)化紅螯螯蝦VWD基因能在大腸桿菌BL21（λDE3）感受態(tài)細胞中誘導表達出以包涵體為主要形式的融合蛋白，經(jīng)鹽酸胍溶解和Ni-NTA親和層析柱純化即可獲得高純度的活性VWD蛋白，為后續(xù)開展紅螯螯蝦Vg生物學功能研究及開發(fā)相應(yīng)的生物活性物質(zhì)提供技術(shù)支持。

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（責任編輯 蘭宗寶）