高氨誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中凋亡相關(guān)LncRNA表達(dá)譜的變化

楊薈玉，張遠(yuǎn)英，周恩慧，龔美源，孔令建，劉冰熔

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)華大基因?qū)W院 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450052

肝功能衰竭(肝衰竭)是嚴(yán)重的進(jìn)行性肝病。肝衰竭時(shí)大量肝細(xì)胞壞死、凋亡，殘存的肝細(xì)胞不能滿足機(jī)體需求，導(dǎo)致相關(guān)代謝功能紊亂，紊亂的代謝產(chǎn)物在體內(nèi)堆積對(duì)肝細(xì)胞造成二次損傷，即“二次打擊”學(xué)說，這被認(rèn)為是肝衰竭發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一[1-2]。高氨血癥是肝衰竭最常見的代謝紊亂[3]。我們前期的研究[4-6]結(jié)果表明，血氨升高可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而致肝細(xì)胞損傷，對(duì)肝細(xì)胞造成“二次打擊”，但機(jī)制尚不完全清楚，因此迫切需要新的策略進(jìn)行機(jī)制研究，從而為治療奠定理論基礎(chǔ)。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，LncRNA)長(zhǎng)度通常超過200個(gè)核苷酸，無蛋白編碼能力。越來越多的證據(jù)[7-8]表明，LncRNA參與了許多重要的生物學(xué)過程，其表達(dá)失調(diào)已被證明與許多人類疾病相關(guān)。我們應(yīng)用人凋亡通路LncPathTM芯片篩選出高氨誘導(dǎo)肝細(xì)胞中的差異表達(dá)LncRNA，通過GO和KEGG通路分析預(yù)測(cè)這些差異表達(dá)LncRNA的生物學(xué)作用和涉及的信號(hào)通路，并對(duì)LncRNA及與其相關(guān)的mRNA進(jìn)行整合分析，探究差異表達(dá)LncRNA在高氨誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源及分組人正常肝細(xì)胞LO2購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。氯化銨購自上海生工生物工程有限公司。細(xì)胞用含青/鏈霉素、體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。然后將細(xì)胞分為3組：對(duì)照組按上述方法常規(guī)培養(yǎng)；高氨1組、高氨2組參考文獻(xiàn)[9]的方法分別用10 mmol/L氯化銨溶液誘導(dǎo)24、48 h，以制備高氨肝細(xì)胞模型。

1.2 差異表達(dá)LncRNA和mRNA的篩選應(yīng)用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)分別常規(guī)提取3組細(xì)胞的總RNA，使用NanoDrop2000對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行定量分析。人凋亡通路LncPathTM芯片由上海康成生物科技有限公司制作并測(cè)序完成：使用安捷倫芯片平臺(tái)，用Arraystar Flash RNA標(biāo)記擴(kuò)增總RNA并轉(zhuǎn)錄，將產(chǎn)物雜交到人凋亡通路LncPathTM芯片上，用Axon GenePix 4000B微陣列掃描儀掃描芯片，記錄LncRNA或mRNA表達(dá)變化比值(FC)。應(yīng)用R limma軟件包對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分位數(shù)歸一化處理，然后采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較兩組間LncRNA或mRNA的表達(dá)水平。以log2FC≥2且P<0.05為差異表達(dá)。

1.3 3組細(xì)胞中部分差異表達(dá)LncRNA表達(dá)水平的檢測(cè)隨機(jī)挑取在3組中均差異表達(dá)的5個(gè)LncRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。采用Primer Express 5.0(美國Applied Biosystems)對(duì)所選差異表達(dá)LncRNA和管家基因GAPDH進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，序列見表1,由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列

第一鏈cDNA合成試劑盒及PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司。PCR反應(yīng)體系：2×Master Mix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。 采用ABI 7 PCR系統(tǒng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃10 s，60 ℃60 s,40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，95 ℃10 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s，建立熔解曲線。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。3組間目的基因表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

1.4 GO注釋和KEGG通路分析應(yīng)用GO注釋(http://www.geneontology.org)和KEGG通路分析(http://www.genome.jp/kegg/)探索3組細(xì)胞中差異表達(dá)LncRNA和mRNA參與的生物學(xué)過程及通路。

1.5 LncRNA與mRNA整合分析通過平行量化LncRNA及其潛在靶基因，得到具有共表達(dá)關(guān)系的LncRNA-mRNA關(guān)系對(duì)，從中篩選受到共同差異表達(dá)miRNA調(diào)控的LncRNA-mRNA關(guān)系對(duì)，使用Cytoscope構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)LncRNA和mRNA的篩選LncRNA和mRNA的表達(dá)變化散點(diǎn)圖見圖1。3組間差異表達(dá)的LncRNA有8個(gè)，差異表達(dá)的mRNA有13個(gè)，見圖2、表2和表3。

圖2 3組間差異表達(dá)的LncRNA(A)和mRNA(B)

表2 3組差異表達(dá)LncRNA

表3 3組差異表達(dá)mRNA

2.2 差異表達(dá)LncRNA表達(dá)的驗(yàn)證5個(gè)差異表達(dá)LncRNA XLOC_008935、MEG3、DKFZP43410714、AC006978.6和SNAR-A2的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致，表達(dá)水平見表4。

表4 LncRNA XLOC_008935、MEG3、DKFZP434I0714、AC006978.6和SNAR-A2在3組細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 GO注釋和KEGG通路分析見圖3。GO注釋結(jié)果顯示，3組的差異表達(dá)LncRNA及mRNA主要參與了細(xì)胞凋亡、細(xì)胞程序性死亡、細(xì)胞死亡、細(xì)胞程序性死亡負(fù)調(diào)控、生物過程負(fù)調(diào)控、凋亡過程調(diào)控等生物學(xué)過程。KEGG分析結(jié)果顯示，3組的差異表達(dá)mRNA參與的信號(hào)通路包括孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和MAPK信號(hào)通路；差異表達(dá)mRNA MAPK12和RPS6KA3均參與了這4條通路。

圖3 GO注釋(左)和KEGG通路分析(右)結(jié)果

2.4 LncRNA與mRNA整合分析結(jié)果高氨1組與對(duì)照組差異表達(dá)的LncRNA有60個(gè)，差異表達(dá)的mRNA有84個(gè)；其中LncRNA靶向的mRNA有63個(gè)，mRNA對(duì)應(yīng)的LncRNA有39個(gè)。高氨2組與對(duì)照組差異表達(dá)的LncRNA有87個(gè)，差異表達(dá)的mRNA有66個(gè)；其中LncRNA靶向的mRNA有33個(gè)，mRNA對(duì)應(yīng)的LncRNA有33個(gè)。高氨2組與高氨1組差異表達(dá)的LncRNA共153個(gè)，差異表達(dá)的mRNA有114個(gè)；其中LncRNA靶向的mRNA有62個(gè)，mRNA對(duì)應(yīng)的LncRNA有65個(gè)。ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖見圖4。3組細(xì)胞中，LncRNA BAIAP3與MAPK12 mRNA關(guān)聯(lián)。

長(zhǎng)方形代表LncRNA，三角形代表miRNA，橢圓代表蛋白質(zhì)

3 討論

肝衰竭可引起肝細(xì)胞大量壞死和凋亡，由于“殘留”的肝細(xì)胞不能滿足機(jī)體的需要，機(jī)體會(huì)出現(xiàn)一系列代謝功能障礙，其中最常見的是血氨增高。D氨基半乳糖和脂多糖誘導(dǎo)的急性肝衰竭大鼠模型顯示，肝細(xì)胞凋亡是模型大鼠重要的病理改變，降低血氨可以預(yù)防肝細(xì)胞損傷和凋亡[10]。研究[9]發(fā)現(xiàn)10 mmol/L氯化銨溶液是體外高氨肝細(xì)胞模型建模的理想濃度；氯化銨能明顯誘導(dǎo)人肝細(xì)胞凋亡，但對(duì)其他細(xì)胞類型影響不大，可能與氨能顯著影響肝細(xì)胞RHCG、AQP8的表達(dá)有關(guān)。

在本研究中，我們用10 mmol/L氯化銨溶液誘導(dǎo)24、48 h建立高氨肝細(xì)胞模型，以分析高氨誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡過程中LncRNA表達(dá)譜的變化。 結(jié)果顯示，對(duì)照組、高氨1組(誘導(dǎo)24 h)和高氨2組(誘導(dǎo)48 h)共有8個(gè)LncRNA和13個(gè)mRNA表達(dá)有顯著差異。與對(duì)照組相比，高氨1組LncRNA AF520792、CYCSP55、DKFZP434I0714、AC006978.6表達(dá)下調(diào)，而其在高氨2組表達(dá)上調(diào)；MEG3在高氨1組表達(dá)上調(diào)，而在高氨2組表達(dá)下調(diào)；兩組SNAR-A2表達(dá)均下調(diào)，XLOC_008935、CRNDE均上調(diào)。與對(duì)照組相比，高氨1組RPS6KA3、BUB1B、SON、USP9X mRNA表達(dá)下調(diào)，而其在高氨2組表達(dá)上調(diào)；SSTR3、EDAR、CRYAB、DCC、TNFSF12、SST mRNA在高氨1組表達(dá)上調(diào)，而在高氨2組表達(dá)下調(diào)；兩組MAPK12 mRNA表達(dá)均下調(diào)，TSC22D3、DHCR24 mRNA表達(dá)均上調(diào)。這些結(jié)果表明，隨著氯化氨處理時(shí)間的變化，肝細(xì)胞LncRNA和mRNA的表達(dá)譜也隨之發(fā)生變化。短期的氯化銨誘導(dǎo)后，肝細(xì)胞開始啟動(dòng)防御機(jī)制，防止細(xì)胞凋亡；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，防御被破壞，肝細(xì)胞凋亡加?。贿@也與早期降氨治療肝衰竭患者預(yù)后良好相對(duì)應(yīng)。我們選出5個(gè)失調(diào)的LncRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)了芯片測(cè)序的結(jié)果。本研究結(jié)果提示LncRNA SNAR-A2、XLOC_008935、CRNDE和MAPK12、TSC22D3、DHCR24 mRNA可能在高氨誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡中起重要作用。

我們對(duì)篩選出的LncRNA及相關(guān)的mRNA進(jìn)行了GO注釋和KEGG通路分析。結(jié)果顯示，在這些基因參與的多條信號(hào)通路中MAPK12和RPS6KA3這兩個(gè)基因均有異常表達(dá)，表明MAPK12和RPS6KA3可能在高氨誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡中起重要作用；氨可能通過靶向MAPK12對(duì)肝細(xì)胞造成損傷。ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明LncRNA BAIAP3與MAPK12 mRNA關(guān)聯(lián)，提示LncRNA BAIAP3可能通過靶向MAPK12參與MAPK信號(hào)通路，從而在高氨誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，其確切機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。

本研究?jī)H對(duì)肝細(xì)胞模型進(jìn)行了分析，具有一定的局限性，肝衰竭患者血液和肝臟中的整體LncRNA和mRNA變化還需進(jìn)一步的研究確定，以更準(zhǔn)確地反映高氨誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的病理生理機(jī)制。