基于秀麗隱桿線蟲模型的去氫駱駝蓬堿衍生物1-（4-甲氧基）苯基-9-丁基-β-咔啉神經(jīng)毒性效應

鞏月紅，文麗梅，陳 蓓，高惠靜，耿 偉，趙 軍，王建華

（新疆醫(yī)科大學1.第一附屬醫(yī)院，2.省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011）

去氫駱駝蓬堿（harmine，HM）是新疆民間沿用已久的地方特色藥材駱駝蓬（Peganum harmala L.）籽提取物。HM屬三環(huán)β-咔啉類生物堿，具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性、細胞毒性及廣泛的抗腫瘤活性，同時顯示出殺蟲潛力［1-2］。本課題組前期研究表明，HM對離體包蟲具有良好的殺滅作用，而對寄生在宿主體內(nèi)的包蟲，殺滅效果不甚理想［3-4］。

鑒于此，本課題組根據(jù)HM母核β-咔啉芳香環(huán)上取代基及其位置的不同，對此類化合物的結(jié)構(gòu)進行修飾，獲得1000余種具有β-咔琳母核結(jié)構(gòu)的HM衍生物。藥效實驗結(jié)果表明，其中1-（4-甲氧基）苯基-9-丁基-β-咔啉（代號：DH-004）對離體包蟲的半數(shù)致死濃度（LC50）為（14.3±5.7）mg·L-1，優(yōu)于HM〔（48.3±17.8）mg·L-1〕；對小鼠體內(nèi)寄生的包蟲囊腫的生長抑制作用優(yōu)于HM［4］，提示DH-004是一種具有開發(fā)潛力的抗包蟲病新化合物，但其抗包蟲作用機制尚不清楚。

包蟲又稱包生絳蟲，是細粒棘球絳蟲的幼蟲，是我國西部地區(qū)較常見的寄生蟲，常以人和家畜為宿主，具有較強的致病性和潛在的致死風險［5-6］。迄今，包蟲在體外無法自行繁殖，寄生于宿主后生長周期長，較難獲得。加之包蟲自身結(jié)構(gòu)和寄生的復雜性，不便將其作為實驗對象進行藥物干預和觀察。而秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis Elegans，C.elegans，以下簡稱線蟲）結(jié)構(gòu)簡單、遺傳背景明確、生命周期短，具有細胞模型的簡易性，頭部雖不存在典型的腦結(jié)構(gòu)，但具有302個神經(jīng)元和56個膠質(zhì)細胞等結(jié)構(gòu)，每個神經(jīng)元都可被單獨識別［7-10］。此外，線蟲神經(jīng)系統(tǒng)中含有乙酰膽堿脂酶（acetyl?cholinesterase，AChE）、谷氨酸和多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)，控制其合成、代謝和傳遞的基因具有高度保守性，使線蟲具有類推和預測高等動物神經(jīng)毒性效應的潛力［11］。故本研究采用線蟲作為實驗對象，觀察DH-004的神經(jīng)毒性效應，并初步探討其毒性機制，為進一步研究新型抗包蟲藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

DH-004（化學結(jié)構(gòu)式見圖1），新疆華世丹藥業(yè)有限公司合成，純度≥93%，預先用DMSO配制成500 mmol·L-1的儲存液，臨用前稀釋；他克林，純度≥97%，北京華威銳科化工有限公司；DMSO，美國Sigma 公 司 ；NaCl，K2HPO4，KH2PO4，MgSO4和CaCl2，生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂、蛋白胨和瓊脂糖，英國Oxoid公司。膽固醇、吖啶橙、鹽酸四咪唑和丁二酮等，上海源葉生物科技有限公司；BCA法蛋白含量測定試劑盒和AChE活性檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

Fig.1 Chemical structure formula of DH-004.

SW-CJ-IFD超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；SPX-80A生化培養(yǎng)箱，上海恒躍醫(yī)療器械有限公司；VCX150組織球磨儀，北京六一生物科技有限公司；Ti-S倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；DK-8D恒溫水浴箱，上海一恒科技有限公司；Varioskan Flash全自動酶標儀和Legend RT+離心機，美國Thermo公司；MS3渦旋振蕩器，美國IKA公司。

1.2 動物

線蟲（N2野生型）和大腸桿菌OP50（E.coli OP50）（尿嘧啶滲漏突變型）由上海巴斯德所陳昌斌教授惠贈。將線蟲放置在涂布有E.coli OP50的線蟲生長培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM）的培養(yǎng)板上，置20℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。NGM含NaCl 3 g·L-1、蛋白胨2.5 g·L-1、瓊脂17 g·L-1和磷酸鉀緩沖液（pH6.0）25 μmol·L-1，滅菌后加入抽濾除菌的膽固醇溶液 5 mg·L-1，MgSO41 mmol·L-1和CaCl21 mmol·L-1。

1.3 線蟲的同步化處理

于超凈工作臺下，用M9緩沖液（g·L-1：Na2HPO4·12H2O 15.12，KH2PO43，NaCl 5，MgSO40.12，MgSO4·7H2O 0.25）沖洗并收集線蟲置15 mL離心管中，加入等體積的線蟲裂解液（將新鮮的5%次氯酸鈉溶液1 mL、5 mol·L-1NaOH溶液0.5 mL和雙蒸水3.5 mL混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配），渦旋振蕩裂解6 min，釋放出蟲卵，200×g離心2 min，棄上清。用M9緩沖液重懸沉淀蟲卵，200×g離心2 min后棄上清，重復洗滌3次。最后用M9緩沖液重懸蟲卵，置NGM培養(yǎng)板上，于20℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，獲得L1期和L4期線蟲幼蟲，用于后續(xù)實驗。

1.4 實驗分組

用DMSO將DH-004儲備液倍比稀釋，終濃度為0.0（溶劑對照，1.0% DMSO），12.5，25.0，50.0，100.0 和 200.0 μmol·L-1，分別均勻涂布至 NGM 培養(yǎng)板上。將線蟲隨機分為6組（n=30），各組分別移入涂布有不同濃度DH-004的NGM培養(yǎng)板上，于20℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.5 線蟲存活率測定

挑取經(jīng)同步化處理的L1期線蟲，給予不同濃度DH-004（藥物處理同1.4），每組30條。從藥物處理當天（實驗第0天）開始，連續(xù)5 d，每天記錄線蟲的死亡數(shù)和丟失數(shù)，計算藥物處理5 d內(nèi)線蟲存活率。存活率（%）=（受試線蟲總數(shù)-死亡數(shù)-丟失數(shù)）/（受試線蟲總數(shù)-丟失數(shù)）×100%。實驗重復3次，取平均值，繪制存活率-時間曲線。利用SPSS20.0軟件采用線性回歸法計算DH-004的LC50。為排除受試線蟲與其新產(chǎn)生幼蟲的混雜，每隔24 h將線蟲活體挑至新的涂有相同藥物濃度的培養(yǎng)板上繼續(xù)培養(yǎng)。線蟲死亡標準為蟲體喪失運動能力，多次觸碰無反應，呈僵直狀。

自供能電流變彈性體減振器的二維設計和實物圖，如圖2。電流變彈性體塊夾在兩銅電極板之間，分別用銅導線通過線槽與壓電發(fā)電模塊的上下壓板相連，壓電陶瓷因形變所產(chǎn)生的高電壓可為智能電流變彈性材料體提供較強的電場，且電壓幅值隨激振力的大小和頻率而改變，可使減振器能很好的適應振動環(huán)境，達到減振降噪的目的。

1.6 線蟲頭部擺動頻次測定

挑取經(jīng)同步化處理的L1期線蟲，給予不同濃度DH-004（藥物處理同1.4）分別連續(xù)處理3 d，每組每時間點30條。將線蟲移至滴加K液（mmol·L-1：KCl 32，NaCl 51，CaCl23，MgSO43）60 μL且不含E.coli OP50的NGM培養(yǎng)板上，待其恢復1 min后，記錄線蟲在20 s內(nèi)頭部擺動的次數(shù)（頭部從一側(cè)擺向另一側(cè)再擺回來記為1次）。實驗重復3次。

1.7 線蟲繁殖力測定

將每條經(jīng)同步化處理的L1期線蟲置于單獨的NGM培養(yǎng)板中連續(xù)飼養(yǎng)，DH-004處理同1.4，每組30條。每24 h將線蟲轉(zhuǎn)移至新的、含相同濃度DH-004的培養(yǎng)板中，直至線蟲喪失繁殖力。記錄每條線蟲的每日產(chǎn)卵數(shù)，并計算其有效產(chǎn)卵總數(shù)（即每日產(chǎn)卵數(shù)之和）。實驗重復3次。

1.8 線蟲感知能力測定

參考 Li等［12-13］、Bargmann 等［14］和Horvitz等［15］的方法以趨向和趨避行為反映線蟲的感知能力。

趨向行為：制備9 cm未加CaCl2、MgSO4和膽固醇的NGM培養(yǎng)板，在底部中線兩側(cè)分別標記圓心相距4 cm、半徑為1.5 cm的2個小圓，于其中一圓圓心處滴加1%丁二酮和1 mol·L-1疊氮化鈉各1 μL，于另一圓圓心處滴加1 μL疊氮化鈉0.5 mol·L-1作為對照（圖2A）。將L4期線蟲經(jīng)DH-004處理（藥物處理同1.4）2 d后，用M9溶液清洗3遍，滴加在距兩圓圓心3 cm處，每組約100條，靜置6 h后分別計數(shù)進入兩圓內(nèi)的線蟲數(shù)（不計壓線線蟲數(shù)）。趨向系數(shù)=（丁二酮側(cè)線蟲數(shù)-對照側(cè)線蟲數(shù)）/受試線蟲總數(shù)。實驗重復3次。

趨避行為：制備9 cm未加CaCl2、MgSO4和膽固醇的NGM培養(yǎng)板，在底部畫十字，將其分為4個象限，在Ⅱ和Ⅳ象限各滴加 25 μL CuSO4·5H2O（0.1 mol·L-1）涂布均勻，靜置1～2 h待其滲入培養(yǎng)基（圖2B），將經(jīng)DH-004處理（藥物處理同1.4）后的L4期線蟲用M9溶液清洗3遍，在Ⅰ和Ⅲ象限分別滴加50條線蟲，每組100條，靜置6 h后分別計數(shù)進入Ⅱ和Ⅳ象限內(nèi)的線蟲總數(shù)（不計壓線線蟲數(shù)）。趨避系數(shù)=含Cu+象限線蟲總數(shù)/受試線蟲總數(shù)。實驗重復3次。

Fig.2 Area division of trend test（A）and avoidance test（B）in Caenorhabditis elegans（C.elegans）.

1.9 線蟲攝食行為測定

挑取經(jīng)同步化處理的L1期線蟲，給予不同濃度的DH-004（藥物處理同1.4）分別處理1，2和3 d，每組每時間點隨機挑取30條置未涂布藥物的NGM培養(yǎng)板上，于熒光顯微鏡下拍攝30 s線蟲咽泵運動的視頻，以0.5倍慢速播放，記錄每條線蟲30 s內(nèi)咽部收縮次數(shù)。實驗重復3次。

1.10 吖啶橙染色法測定線蟲細胞凋亡

參照文獻［16］檢測線蟲細胞凋亡，每組隨機挑取經(jīng)同步化處理培養(yǎng)至L4期線蟲20條，藥物處理1 d（同1.4）后用M9緩沖液洗滌3～5次。將受試線蟲轉(zhuǎn)移至有吖啶橙染液的24孔細胞培養(yǎng)板中，置恒溫培養(yǎng)箱中20℃下避光染色2 h。吸出蟲體用M9緩沖液洗滌3～5次，再用苯四咪唑溶液麻醉，放置于2%的瓊脂糖玻片上，倒置熒光顯微鏡拍照。若出現(xiàn)均勻的淺綠色，則表明細胞未發(fā)生凋亡；若出現(xiàn)橙黃色或者亮黃色，則表明細胞已經(jīng)發(fā)生凋亡。采用Image軟件進行分析，以平均熒光強度反映細胞凋亡水平。

1.11 線蟲AChE活性的測定

1.12 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 DH-004對線蟲存活率的影響

實驗結(jié)果見圖3，溶劑對照組線蟲存活率在5 d內(nèi)無明顯變化，均為（100.0±0.0）%；與溶劑對照組相比，DH-004各濃度組處理1～5 d可濃度依賴性降低線蟲存活率（R2=0.949，P<0.01）。DH-004 12.5 μmol·L-1組處理 5 d（P<0.01）、25.0 μmol·L-1組處理 3～5 d（P<0.05，P<0.01）、50.0 μmol·L-1組處理2～5 d（P<0.01）及 100.0 和 200.0 μmol·L-1組處理 1～5 d（P<0.05，P<0.01）線蟲存活率均顯著降低。DH-004作用1～5 d的LC50分別為1045.8±14.8，921.7±10.1，135.9±5.9，39.0±1.8 和（19.7±0.6）μmol·L-1。

Fig.3 Effect of DH-004 on viability of wild-type C.elegans.C.elegans（L1）were treated with DH-004 0.0（solvent control，1.0% DMSO），12.5，25.0，50.0，100.0 and 200.0 μmol·L-1for 5 consecutive days，respectively.Vialility（%）=（total numbernumber of death-number of loss）/（total number-number of loss）×100%.±s，n=30.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with 0.0 μmol·L-1group.

2.2 DH-004對線蟲20 s內(nèi)頭部擺動次數(shù)的影響

實驗結(jié)果見圖4，與溶劑對照組相比，DH-004 25.0 μmol·L-1處理 3 d 組（P<0.01）、50.0 μmol·L-1處理1～3 d組（P<0.05，P<0.01）及100.0和200.0 μmol·L-1處理1～3 d組（P<0.01），線蟲20 s內(nèi)頭部擺動次數(shù)均顯著降低。

Fig.4 Effect of DH-004 on time of head thrashes of wild-type C.elegans within 20 s.C.elegans（L1）were treated with DH-004 0.0，12.5，25.0，50.0，100.0 and 200.0 μmol·L-1for 3 d.±s，n=30.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with 0.0 μmol·L-1group.

2.3 DH-004對線蟲繁殖力的影響

實驗結(jié)果見圖5，與溶劑對照組相比，DH-004 25.0，50.0，100.0 和 200.0 μmol·L-1組線蟲有效蟲卵總數(shù)均明顯減少（P<0.01）。

Fig.5 Effect of DH-004 on total numbers of effective eggs of wild-type C.elegans.C.elegans（L1）were treated with different concentrations of DH-004 until they lost their fecundity，respectively.±s，n=30.＊＊P<0.01，compared with 0.0 μmol·L-1group.

2.4 DH-004對線蟲感知能力的影響

趨向?qū)嶒灪挖叡軐嶒灒ū?）結(jié)果顯示，與溶劑對照組相比，DH-004 25.0，50.0，100.0和200.0 μmol·L-1組趨向系數(shù)顯著降低（P<0.05，P<0.01），趨避系數(shù)顯著增高（P<0.01）。

Tab.1 Effect of DH-004 on perception of wild-type C.elegans in trend test and avoidance test

2.5 DH-004對線蟲攝食行為的影響

實驗結(jié)果見圖6，與溶劑對照組相比，DH-004各濃度組處理1～3 d使線蟲咽部收縮次數(shù)均有不同程度降低。DH-004 12.5 μmol·L-1組處理2～3 d（P<0.01）及25.0，50.0，100.0和200.0 μmol·L-1組處理處理1～3 d（P<0.01）線蟲咽部收縮次數(shù)均顯著降低。

Fig.6 Effect of DH-004 on times of pumping in C.elegans.See Fig.4 for the C.elegan treatment.±s，n=30.＊＊P<0.01，compared with 0.0 μmol·L-1group.

2.6 DH-004對線蟲細胞凋亡水平的影響

線蟲細胞凋亡水平如圖7所示，與溶劑對照組相比，DH-004染毒處理24 h后50.0，100.0，200.0 μmol·L-1組平均熒光強度顯著增強（P<0.01）。

Fig.7 Effect of DH-004 on cell apoptosis in wild-type C.elegans.C.elegans（L4）were treated with DH-004 for 1 d.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=20.＊＊P<0.01，compared with 0.0 μmol·L-1group.

2.7 DH-004對線蟲組織勻漿中AChE活性的影響

AChE活性檢測結(jié)果如圖8所示，與溶劑對照組相比，DH-004和陽性對照藥他克林染毒處理后，線蟲體內(nèi)AChE活性抑制率均濃度依賴性增高，IC50分別為94.7±3.7和（82.7±4.1）μmol·L-1，R2分別為0.851和0.812（P<0.01）。

Fig.8 Effect of DH-004 and tacrine on acetylcholines?terase（AChE）activity in wild-type C.elegans.C.elegans（L4）were treated with tacrine and DH-004 for 4 d，respectively.Inhibition rate（%）=［absorbance A412 nmof 0.0 μmol·L-1group-A412 nmof drug group］/A412 nmof 0.0 μmol·L-1group×100%.±s，n=30.＊＊P<0.01，compared with 0.0 μmol·L-1group.

3 討論

線蟲具有易培養(yǎng)、無毒無害、繁殖力強、遺傳背景清晰、細胞譜系和分子通路清楚等優(yōu)點［18-19］，并具有神經(jīng)元結(jié)構(gòu)簡單、基因功能與哺乳動物同源、與哺乳動物類似的神經(jīng)遞質(zhì)（如乙酰膽堿和多巴胺等）的特點，因而在研究神經(jīng)毒理學方面具有極大優(yōu)勢［20-23］。

本研究采用線蟲對DH-004的神經(jīng)毒性效應進行了評價。結(jié)果顯示，隨處理濃度和時間的增加，DH-004顯著增加線蟲的死亡率和細胞凋亡水平，降低頭部擺動頻次和咽泵震動頻次，降低有效產(chǎn)卵量，表明DH-004對線蟲具有毒性效應。本研究利用線蟲具有趨向丁二酮和避開CuSO4溶液的特性進行了趨向和趨避實驗。結(jié)果顯示，隨著DH-004濃度的升高，線蟲的趨避系數(shù)增高，趨向系數(shù)減小，表明其感知能力下降，提示DH-004可能引起線蟲化學感應神經(jīng)元的損傷。線蟲的運動、感知以及咽部收縮次數(shù)主要受神經(jīng)系統(tǒng)控制，提示DH-004可能對線蟲神經(jīng)系統(tǒng)具有抑制作用。有研究認為，生物個體行為和生殖異?？赡芘cAChE的活性有關［24］。本研究結(jié)果表明，DH-004顯著抑制線蟲AChE活性。

綜上所述，DH-004對線蟲具有明顯的神經(jīng)毒性作用，其機制可能與促進細胞凋亡和抑制AChE活性有關，提示其對寄生包蟲的殺滅作用值得進一步深入探討。