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    白樺脂酸對異氟醚誘導的發(fā)育期大鼠神經(jīng)細胞損傷的保護作用

    2021-09-07 01:09:18王東偉劉海萍王慶東劉思洋胡玉紅臧榮佳
    中國藥理學與毒理學雜志 2021年6期
    關鍵詞:發(fā)育期神經(jīng)細胞海馬

    王東偉,劉海萍,王慶東,赫 赤,劉思洋,胡玉紅,陳 萍,臧榮佳

    (佳木斯大學附屬第一醫(yī)院1.麻醉科,2.婦產(chǎn)科,黑龍江 佳木斯 154002)

    異氟醚(isoflurane,Iso)是一種臨床常用的吸入性全身麻醉藥,其可誘導新生動物的大腦神經(jīng)細胞出現(xiàn)凋亡,嚴重者可能影響腦功能[1],且該影響可長期存在,導致神經(jīng)突觸數(shù)量減少甚至消失,引起永久腦損傷,可表現(xiàn)為新生大鼠發(fā)育成熟后行為功能障礙[2]。白樺脂酸(betulinic acid,BC)是五環(huán)羽扇烷型三萜化合物。Ma等[3]研究認為,BC能通過血紅素氧合酶1/核因子E2相關因子2/NF-κB信號通路抑制糖尿病模型小鼠的認知障礙。Jiao等[4]研究顯示,BC能抑制腦缺血缺氧誘發(fā)的小鼠海馬神經(jīng)損傷,具有神經(jīng)保護作用。本研究以發(fā)育期大鼠為研究對象,探討B(tài)C對Iso誘導的發(fā)育期神經(jīng)損傷的保護作用,為臨床尋找能夠有效減輕或消除Iso導致的發(fā)育期神經(jīng)損傷的藥物提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 藥品、試劑和主要儀器

    Iso(江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司,批號:20172831);BC(中國科學院成都生物研究所,批號:18032423);活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒和丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒(上海亨代勞生物科技公司);線粒體膜電位(mito?chondrial membrane potential,MMP)檢測試劑盒和Ca2+熒光探針檢測試劑盒(BestBios生物科技有限公司);Annexin Ⅴ-Biotin,Annexin Ⅴ-FITC和Annexin Ⅴ-PE(美國BD公司)。Fabius麻醉機(德國Drager公司);流式細胞儀(美國Beckman公司);熒光酶標儀(芬蘭Thereto實驗儀器公司);麻醉箱(上海玉研科學儀器公司);MindrayT8監(jiān)護儀(深圳邁瑞公司);Morris水迷宮實驗系統(tǒng)(美國National Instruments公司);血氣分析儀(普朗公司);分光光度計(V-1000,翔藝儀器上海有限公司)。

    1.2 實驗動物、分組和樣本制備

    7日齡SPF級SD大鼠80只,雌雄各半,體重17~20 g,佳木斯大學基礎醫(yī)學院動物中心提供,生產(chǎn)許可證號:SYXK(黑)2016-014。幼鼠在通風良好、室溫20~24℃和濕度50%~60%的環(huán)境飼養(yǎng)于清潔籠具中,12 h晝夜交替光照。自由進食、進水。

    大鼠隨機分為4組:正常對照組、Iso組和Iso+BC 100和200 mg·kg-1組,每組20只,雌雄各半。除正常對照組外,其余各組大鼠置恒溫水槽上的麻醉箱內(nèi)吸入1.5% Iso 6 h進行全身麻醉[5],麻醉箱內(nèi)溫度37~38℃。Iso麻醉前1 h,正常對照組和Iso組ip給予0.9%生理鹽水,Iso+BC組分別ip給予BC 100或200 mg·kg-1預處理。處置完畢后對大鼠進行血氣分析,然后每組隨機取10只大鼠立即處死,每只大鼠取部分海馬組織,剪碎后用胰蛋白酶消化,并用200目孔徑尼龍網(wǎng)過濾,450×g離心5 min,棄上清,加PBS重懸后反復柔和吹打,制備成1×108L-1的單細胞懸液,用于檢測細胞凋亡率、ROS、MMP和神經(jīng)細胞內(nèi)游離Ca2+濃度。取部分海馬組織剪碎,按質(zhì)量比1∶9加入預冷的生理鹽水,用勻漿器制成勻漿,626×g,4℃離心15 min,取上清,-20℃保存用于檢測MDA含量。余下10只返回飼養(yǎng)籠中喂養(yǎng)至6周后進行Morris水迷宮實驗。

    1.3 流式細胞術檢測大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率

    取1.2制備的大鼠海馬單細胞懸液,按照試劑盒說明操作,向細胞懸液中加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC標記抗體,室溫避光孵育20 min,再加入5 μL 0.1 g·L-1的PI細胞核染料混勻,室溫避光孵育10 min,用流式細胞儀分析細胞凋亡。

    1.4 DCFH-DA探針檢測大鼠海馬神經(jīng)細胞ROS水平

    按照試劑盒說明書進行操作,取1.2制備的大鼠海馬單細胞懸液,加DCFH-DA(終濃度10 μmol·L-1)37℃孵育30 min后,用PBS洗滌2次,用熒光酶標儀(激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長525 nm)測讀,以相對熒光單位(relative fluorescence unit,RFU)反映細胞內(nèi)ROS水平。

    1.5 硫代巴比妥酸縮合法檢測大鼠海馬組織MDA含量

    按照試劑盒說明書進行操作,取1.2制備的海馬組織勻漿,加3 mL 20%三氯乙酸,再加入1 mL 0.67%硫代巴比妥酸,用旋渦混合器混勻30 s,95℃水浴40 min,取出后流水冷卻,800×g離心10 min,取上清液,用分光光度計在波長532 nm處測定吸光度值,以反映MDA含量。

    1.6 Fluo-3/AM探針檢測大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+濃度

    按照試劑盒說明書進行操作,取1.2制備的大鼠海馬單細胞懸液,加入Fluo-3/AM探針工作液,在37℃細胞培養(yǎng)箱中避光孵育20 min。加入5倍體積的含有1%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液(Hanks balanced salt solution,HBSS),繼續(xù)孵育40 min。用HBSS洗滌細胞2~3次后重懸細胞,37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育10 min,用熒光酶標儀(激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長526 nm)測讀,以RFU反映細胞內(nèi)Ca2+濃度。

    1.7 JC-1法檢測大鼠海馬神經(jīng)細胞MMP

    取1.2制備的大鼠海馬單細胞懸液,按照試劑盒操作說明加入 JC-1染色液 10 μmol·L-1,37℃孵育 30 min,626×g,4℃離心 3~4 min,棄上清,用JC-1染色液洗滌2次后重懸細胞,在熒光顯微鏡下觀察JC-1單體(激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長530 nm,綠色)及JC-1聚合物(激發(fā)波長525 nm,發(fā)射波長590 nm,紅色)的熒光圖像。用熒光酶標儀檢測熒光強度值(fluorescence intensity,F(xiàn)I),用FI綠/FI紅表示MMP水平(△ψm)。

    1.8 Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力

    經(jīng)1.2處理的另10只大鼠返回飼養(yǎng)籠中繼續(xù)飼養(yǎng)至6周后進行Morris水迷宮實驗[6]。Morris水迷宮模型由圓柱型水池和可移動位置的平臺2部分組成。水池高60 cm,直徑120 cm,平臺(直徑10 cm)淹沒固定在水池的4個象限之一。連續(xù)4 d,每天4次將大鼠從水池邊放入水中進行訓練。觀察大鼠在水中找到平臺并爬上平臺的時間,記為逃避潛伏期。如果在120 s內(nèi)不能找到平臺,則人為將其引導到平臺,停留10 s,并將逃避潛伏期記為120 s;當大鼠自行到達平臺時,可被允許在上面休息30 s。記錄第4天4次訓練的平均逃避潛伏期。第5天,去除平臺后進行空間探索實驗,記錄120 s內(nèi)大鼠穿過原平臺位置的次數(shù)和在原平臺象限的探索時間。實驗數(shù)據(jù)由計算機軟件自動記錄。

    1.9 統(tǒng)計學分析

    2 結(jié)果

    2.1 BC對Iso暴露大鼠血氣指標的影響

    血氣分析結(jié)果(表1)顯示,與正常對照組比較,各組大鼠血液pH值、pO2和pCO2均無統(tǒng)計學差異。

    Tab.1 Effect of betulinc acid(BC)on arterial blood gas indexes in isoflurane(Iso)exposure rats

    2.2 BC對Iso暴露大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡的影響

    Iso組大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率顯著高于正常對照組(P<0.01),Iso+BC 100和200 mg·kg-1組海馬神經(jīng)細胞凋亡率低于Iso組(P<0.05),Iso+BC 200 mg·kg-1組大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率低于Iso+BC 100 mg·kg-1組(P<0.05)(圖1)。

    Fig.1 Effect of BC on hippocampal neuron apoptosis of Iso exposure rats.See Tab.1 for the rat treatment.±s,n=10.**P<0.01,compared with normal control group;#P<0.05,compared with Iso group;△P<0.05,compared with Iso+BC 100 mg·kg-1group.

    2.3 BC對Iso暴露大鼠海馬神經(jīng)細胞ROS水平和MDA含量的影響

    Iso組大鼠海馬組織中MDA含量和海馬神經(jīng)細胞內(nèi)ROS的水平明顯高于正常對照組(P<0.01);與Iso組相比,Iso+BC 100和200 mg·kg-1組大鼠海馬組織中MDA含量及海馬神經(jīng)細胞內(nèi)ROS水平明顯減少(P<0.05),且Iso+BC 200 mg·kg-1組對ROS的抑制作用強于Iso+BC 100 mg·kg-1組(P<0.05)(圖2)。

    2.4 BC對Iso暴露大鼠海馬神經(jīng)細胞Ca2+濃度和MMP的影響

    實驗結(jié)果如圖3所示,Iso組大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)游離Ca2+濃度明顯高于正常對照組(P<0.01),Iso+BC 100和200 mg·kg-1組大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)游離Ca2+濃度較Iso組減少(P<0.05),Iso+BC 200 mg·kg-1組低于Iso+BC 100 mg·kg-1組(P<0.05)(圖3A)。與正常對照組相比,Iso組大鼠海馬神經(jīng)細胞MMP明顯降低(P<0.05),Iso+BC 100和200 mg·kg-1組大鼠海馬神經(jīng)細胞MMP明顯高于Iso組(P<0.05),且Iso+BC 200 mg·kg-1組高于Iso+BC 100 mg·kg-1組(P<0.05)(圖3B)。

    Fig.3 Effect of BC on Ca2+concentration(A)and mito?chondrial membrane potential(MMP,B) in hippo?campal neurons of Iso exposuer rats.See Tab.1 for the rat treatment.FI:fluorescence intensity.±s,n=10.**P<0.01,compared with normal control group;#P<0.05,compare with Iso group;△P<0.05,compared with Iso+BC 100 mg·kg-1group.

    2.5 BC對Iso暴露大鼠學習記憶的影響

    與正常對照組相比,Iso組大鼠訓練第4天逃避潛伏期明顯延長(P<0.01),穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.01),平臺探索時間明顯縮短(P<0.01);與Iso組相比,Iso+BC 100和200 mg·kg-1組大鼠訓練第4天逃避潛伏期均明顯縮短(P<0.05),穿越平臺次數(shù)明顯增加(P<0.05),平臺探索時間明顯延長(P<0.05);Iso+BC 100 mg·kg-1組與Iso+BC 200 mg·kg-1組間上述指標未見明顯差異(圖4)。

    Fig.4 Effect of BC on learning and memory behavior in Morris water maze test in Iso exposure rats.See Tab.1 for the rat treatment.±s,n=10.**P<0.01,compared with normal control group;#P<0.05,compared with Iso group.

    3 討論

    大量研究表明,Iso易導致神經(jīng)損傷或認知障礙[7],但影響神經(jīng)系統(tǒng)的機制尚不明確。本研究結(jié)果顯示,Iso暴露可引起大鼠海馬組織中MDA和神經(jīng)細胞中ROS水平明顯升高,胞內(nèi)鈣超載和神經(jīng)細胞MMP明顯降低,進而促進大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡;而BC預處理能改善Iso暴露誘導的發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)細胞氧化損傷,穩(wěn)定MMP,進而減少大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡。Zhao等[8]報道,Iso可增加海馬神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+濃度,誘導神經(jīng)毒性。細胞內(nèi)Ca2+升高是細胞損傷的較早期事件,Iso通過下調(diào)N-甲基-D-天冬氨酸受體或過度激活γ-氨基丁酸受體可能導致Ca2+過多進入,引起線粒體超載,線粒體膜電位去極化,胱天蛋白酶激活,導致神經(jīng)細胞凋亡[9]。研究表明,氧化應激與腦神經(jīng)損傷密切相關[10],過量的ROS可以引起細胞內(nèi)Bax/Bcl-2比例失調(diào),激活胱天蛋白酶3,引起細胞凋亡[11]。Iso引起的細胞內(nèi)ROS蓄積是其產(chǎn)生神經(jīng)毒性的原因之一。

    本研究應用Morris水迷宮實驗檢測Iso暴露及BC干預對發(fā)育期大鼠遠期學習記憶能力的影響。據(jù)文獻報道,性激素水平影響大鼠水迷宮實驗反應性和敏感性[12]。本研究選擇雌雄各半大鼠,以排除激素水平對實驗結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常對照組比較,Iso組大鼠潛伏期明顯延長,穿越平臺次數(shù)和平臺象限探索時間明顯減少,表明Iso暴露可損傷發(fā)育期大鼠遠期學習記憶能力,該結(jié)果與Jevtovic-Todorovic 等[13]和 Stratmann 等[14]的研究結(jié)果一致。本研究同時發(fā)現(xiàn),Iso暴露前給予BC 100和200 mg·kg-1可使大鼠潛伏期明顯縮短,穿越平臺次數(shù)明顯增多,表明BC對Iso暴露誘導的發(fā)育期大鼠神經(jīng)細胞毒性具有保護作用,能有效改善Iso暴露誘導的發(fā)育期大鼠空間記憶功能障礙。

    本研究結(jié)果表明,BC在受試劑量下對Iso暴露誘導的發(fā)育期大鼠神經(jīng)細胞毒性有保護作用,但其在其他給藥時間、給藥途徑及劑量下的作用有待進一步系統(tǒng)研究。

    綜上所述,BC對Iso誘導的發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)細胞損傷具有保護作用,表現(xiàn)為BC預處理能夠抑制Iso暴露誘導的發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡和氧化損傷,并能夠改善Iso暴露誘導的發(fā)育期大鼠學習記憶功能障礙。

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