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    基于16S rRNA V4區(qū)高通量測(cè)序的初治菌陽肺結(jié)核患者腸道菌群構(gòu)成與表型分析

    2021-09-07 06:03:24易一行喻容石國(guó)民馬小華肖四方稅劍范任華向延根
    中國(guó)防癆雜志 2021年9期
    關(guān)鍵詞:厚壁桿菌屬菌門

    易一行 喻容 石國(guó)民 馬小華 肖四方 稅劍 范任華 向延根

    結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群感染引起的慢性傳染性疾病,人類以結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染最常見。MTB感染機(jī)體后,因其專性需氧的特性,通常以肺部感染最常見,即引起“肺結(jié)核”。 MTB是單一病原體感染致死的主要原因之一,對(duì)人類健康與公共衛(wèi)生安全造成了極大的威脅[1],因此,采取有效的預(yù)防措施,減少宿主對(duì)MTB的易感性,對(duì)結(jié)核病的預(yù)防和控制具有重要意義。

    “肺-腸軸”理論的提出,揭示了腸道菌群與肺部疾病的發(fā)展有關(guān)[2],動(dòng)物實(shí)驗(yàn)揭示了腸道菌群與肺結(jié)核之間的相關(guān)性,Winglee等[3]發(fā)現(xiàn)MTB感染會(huì)使小鼠腸道菌群種類與豐富度顯著降低。宿主腸道菌群失調(diào)后,肺樹突狀細(xì)胞C型凝集素受體的表達(dá)下調(diào),降低了CD4+T細(xì)胞的活化水平,進(jìn)而增強(qiáng)了宿主對(duì)MTB的易感性[4]。獼猴的基線腸道菌群狀況與MTB感染后的病情嚴(yán)重程度相關(guān)[5],給腸道菌群失調(diào)的小鼠進(jìn)行糞便移植或者補(bǔ)充植物乳酸桿菌(Lactobacillusplantarum)能夠恢復(fù)小鼠的抗MTB免疫力[4],這表明宿主腸道菌群失調(diào)可能會(huì)影響人類MTB感染后的疾病進(jìn)展,以及導(dǎo)致宿主對(duì)MTB的易感性,但目前與之相關(guān)的臨床研究少有報(bào)道。

    高通量測(cè)序技術(shù)加速了人類對(duì)腸道微生態(tài)的理解,分析宿主在健康和患病狀態(tài)時(shí)腸道菌群的組成,可以識(shí)別與疾病有關(guān)的腸道菌群改變,為疾病的預(yù)防和治療提供新的干預(yù)措施。筆者基于臨床研究收集29例肺結(jié)核患者與28名健康對(duì)照者的糞便進(jìn)行高通量測(cè)序與生物信息學(xué)分析,對(duì)兩組樣本腸道菌群多樣性、結(jié)構(gòu)、細(xì)菌表型之間的差異進(jìn)行分析,以期為結(jié)核病的治療與預(yù)防提供新的方向。

    材料和方法

    一、 材料收集

    1.研究對(duì)象:采集2020年4月14日至12月28日就診于南華大學(xué)附屬長(zhǎng)沙中心醫(yī)院29名確診為初治菌陽肺結(jié)核患者(肺結(jié)核組)的糞便標(biāo)本。采集同期在本院進(jìn)行健康體檢的28名志愿者(對(duì)照組)糞便標(biāo)本。志愿者年齡、性別、居住地與納入患者匹配。兩組研究對(duì)象的一般資料見表1。

    表1 一般資料在肺結(jié)核組和對(duì)照組中的分布情況

    2.肺結(jié)核組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡18~60歲;(2)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)為《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[6],經(jīng)利福平耐藥基因檢測(cè)、分枝桿菌快速培養(yǎng)、MTB核酸檢測(cè)鑒定為MTB病原學(xué)陽性,結(jié)合胸部CT檢查確定為肺結(jié)核患者;(3)既往無抗結(jié)核治療史;(4)3個(gè)月內(nèi)未服用抗生素與益生菌產(chǎn)品;(6)同意入組,簽署知情同意書。對(duì)照組入組標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡18~60歲;(2)體檢結(jié)果提示身體健康且無胃腸道疾病史;(3)3個(gè)月內(nèi)未服用抗生素與益生菌產(chǎn)品;(4)同意入組,簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)孕婦或備孕者;(2)精神障礙患者;(3)嚴(yán)重心、肝、腎等疾病患者;(4)使用免疫抑制劑患者;(5)3個(gè)月內(nèi)參加其他藥物臨床實(shí)驗(yàn)患者。倫理學(xué)審核:該項(xiàng)目通過南華大學(xué)附屬長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理審批號(hào):R201956。

    二、 研究方法

    1. 糞便標(biāo)本采集:使用無菌棉簽,于清晨采集對(duì)照組與肺結(jié)核組新鮮糞便1~2 g置于細(xì)菌DNA保存液中,并立即轉(zhuǎn)入-70 ℃冰箱保存待檢。

    2.糞便標(biāo)本DNA提取與PCR擴(kuò)增:使用PowerMax DNA(MoBio實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州設(shè)備制備,批號(hào):20190952)分離試劑盒從糞便樣本中提取細(xì)菌全基因組DNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定所提取的細(xì)菌總DNA完整性后,使用NanoDrop?ND-1000分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)對(duì)所提取DNA進(jìn)行定量,將細(xì)菌總DNA主帶完整無污染的樣本進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。使用PCR擴(kuò)增引物 (正向引物515F: 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′,反向引物806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 對(duì)細(xì)菌總DNA中16S rRNA gene V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增建庫。采用Agencourt AMPure XP 60 ml Kit核酸純化試劑盒(美國(guó)貝克曼庫爾特有限公司)與Qubit dsDNA HS Assay Kit核酸定量檢測(cè)試劑盒(美國(guó)生命技術(shù)公司)對(duì)PCR進(jìn)行純化與量化。依據(jù)靶標(biāo)序列和引物序列獲得原始資料中單個(gè)樣本數(shù)據(jù),去除靶標(biāo)及引物序列后使用Vsearch(v2.4.4)對(duì)每份樣本的堿基序列進(jìn)行拼接,得到原始?jí)A基序列。同時(shí)對(duì)原始?jí)A基序列進(jìn)行質(zhì)量控制與過濾,去除低質(zhì)量序列的標(biāo)準(zhǔn)為:序列<150 bp,平均質(zhì)量低于20 bp,含有不明堿基序列,存在>80 bp的單核苷酸重復(fù)序列,去除嵌合體后最終獲得有效數(shù)據(jù)。Illumina Novaseq 6000平臺(tái)對(duì)純化后的細(xì)菌16S rRNA gene V4區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

    3. 生物信息學(xué)分析:基于Sliva128 數(shù)據(jù)庫,通過Vsearch對(duì)代表序列進(jìn)行物種注釋,獲得操作分類單位(operational taxonomic units,OTU)物種信息,測(cè)序數(shù)據(jù)分析主要使用R軟件包(v3.2.0)和QIIME軟件。QIIME軟件計(jì)算OTU水平α多樣性指數(shù)、β多樣性指數(shù),及門、屬水平的相對(duì)豐度,并生成OTU 水平豐度等級(jí)曲線(ranked abundance)。R軟件包 “VennDiagram” 生成韋恩圖。R語言ggplot 繪制屬水平氣泡圖。BugBase細(xì)菌表型預(yù)測(cè)工具,獲取微生物的7類表型信息,比較門水平下不同表型的細(xì)菌在各組的組成。

    注 a.折線越長(zhǎng)表明樣本OTU數(shù)目越多,曲線越平緩表明群落的均勻度越高;b.韋恩圖,反映兩組間共有與特有的OTU數(shù)目圖1 豐度等級(jí)曲線與韋恩圖

    注 紅色為對(duì)照組,藍(lán)色為肺結(jié)核組,每一個(gè)圓點(diǎn)代表一份樣本,點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離大小代表了樣本之間的相似性圖2 β多樣性分析

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    結(jié) 果

    一、 OTU聚類與統(tǒng)計(jì)

    57份糞便標(biāo)本細(xì)菌16S rRNA gene V4可變區(qū)擴(kuò)增測(cè)序,總共獲得7 432 960條有效序列 (clean reads),人均130 403條Clean reads。測(cè)序平均覆蓋度為(94.51±0.15) %,足以說明樣本所涵蓋的腸道菌群類別。以≥97%的相似序列聚類為1個(gè)操作分類單位,表征物種的豐富程度和均勻程度的OTU 豐度等級(jí)曲線與兩組間OTU韋恩圖共享情況見圖1。

    二、肺結(jié)核患者腸道菌群多樣性分析

    β多樣性利用主坐標(biāo)分析(principal,PcoA)的降維分析方法,將所有樣本置于差異可視化的二維坐標(biāo)系中,這種非限制性排序,以樣本的相似性距離為基礎(chǔ)分析,點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離遠(yuǎn)近代表樣本之間的差異大小,基于加權(quán)距離(weighted unifrac based PcoA)與非加權(quán)距離(unweighted unifrac based PcoA)觀察到兩組樣本各自聚類,PERMANOVA算法(R2=0.253,P=0.001)表明肺結(jié)核組與對(duì)照組腸道菌群構(gòu)成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖2。α多樣性指數(shù)是用以描述組間腸道菌群種類(多樣性)與數(shù)目(豐富度)的指標(biāo),其中香農(nóng)(Shannon)指數(shù)、辛普森(Simpson)指數(shù)反映群落的多樣性,Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反映群落的豐富度。對(duì)照組與肺結(jié)核組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表2。

    表2 α多樣性指數(shù)在肺結(jié)核組與對(duì)照組中的比較

    三、肺結(jié)核患者腸道菌群門水平構(gòu)成分析

    共檢測(cè)出17種菌門,其中擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、放線菌門(Actinobacteria)、TM7、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、軟壁菌門(Tenericutes)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)為隊(duì)列中豐度前10位的菌門。擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門,對(duì)照組中總占比為98.50%,肺結(jié)核組中為93.05%。擬桿菌門對(duì)照組中占比為42.74%,肺結(jié)核組中為44.84%;厚壁菌門對(duì)照組中占比為51.55%,肺結(jié)核組中為35.44%;變形菌門對(duì)照組中占比為4.21%,肺結(jié)核組中為12.77%,見圖3。其中,肺結(jié)核組腸道菌群中厚壁菌門(35.44%)明顯低于對(duì)照組(51.55%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.290,P<0.01)。

    圖3 門水平組間菌群構(gòu)成差異分析

    四、肺結(jié)核患者腸道菌群屬水平構(gòu)成分析

    共檢測(cè)到253種菌屬,其中肺結(jié)核組與對(duì)照組差異菌屬共12種,分別為雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、臭桿菌屬(Odoribacter)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、Anaerostipes、勞特氏菌屬(Blautia)、糞球菌屬(Coprococcus)、毛螺菌屬(Lachnospira)、羅氏菌屬(Roseburia)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、真桿菌屬(Eubacterium),見表3。

    表3 腸道菌群屬水平相對(duì)豐度在肺結(jié)核組與對(duì)照組的比較

    五、基于BugBase表型分類的腸道菌群功能預(yù)測(cè)

    與對(duì)照組比較,肺結(jié)核組患者腸道中厭氧菌(Anaerobic)基因相對(duì)豐度與革蘭氏陽性菌(Gram-positive)基因相對(duì)豐度均降低,兼性菌(Facultatively anaerobic)基因相對(duì)豐度與革蘭氏陰性菌(Gram-negative)基因相對(duì)豐度均增高,生物膜形成能力(Forms biofilms)的細(xì)菌基因相對(duì)豐度增高,腸道菌群氧化脅迫(stress tolerant)耐受能力增強(qiáng)。此外,需氧菌(Aerobic)基因相對(duì)豐度與具有移動(dòng)組件(Contains mobile elements)的細(xì)菌基因相對(duì)豐度升高,具有潛在致病性(Potentially pathogenic)細(xì)菌的基因相對(duì)豐度增加,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表4。

    表4 腸道菌群表型相對(duì)豐度百分比在肺結(jié)核組與對(duì)照組的比較

    討 論

    結(jié)核病作為一種慢性消耗性疾病,其疾病的預(yù)后與人體自身的營(yíng)養(yǎng)免疫狀況密切相關(guān),腸道作為人體最大的黏膜系統(tǒng),富含豐富的腸道菌群,腸道菌群通過黏膜免疫系統(tǒng),以及分泌代謝產(chǎn)物由血液循環(huán)到達(dá)全身各處,參與宿主的營(yíng)養(yǎng)免疫調(diào)節(jié),對(duì)宿主健康至關(guān)重要[7]。筆者應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)分析對(duì)肺結(jié)核患者腸道菌群總體組成與細(xì)菌表型進(jìn)行分析。腸道菌群多樣性研究結(jié)果表明,肺結(jié)核患者腸道菌群與健康對(duì)照者相比α多樣性下降,β多樣性存在明顯差異,這表明在肺結(jié)核感染的病理狀態(tài)下,患者出現(xiàn)明顯的菌群種類與豐度下降或者定植困難,其原因可能與病原體感染激活全身免疫系統(tǒng),機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而引起菌群種類與豐度下降有關(guān)[8]。

    腸道菌群構(gòu)成分析顯示,擬桿菌門與厚壁菌門為兩組的優(yōu)勢(shì)菌門,占總菌門數(shù)的85%以上,其次為變形菌門、梭桿菌門與放線菌門。其中,兩組間差異菌門為厚壁菌門,肺結(jié)核患者腸道內(nèi)厚壁菌門豐度明顯低于健康對(duì)照組,這與Wu等[9]對(duì)肺結(jié)核患者痰標(biāo)本菌群變化的研究結(jié)論一致。厚壁菌門是人類腸道菌群中豐度最高的菌門,占腸道菌群的20.5%~80%,大部分腸道短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)產(chǎn)生菌與益生菌均屬于厚壁菌門[10]。此外,健康人的腸道菌群厚壁菌門比例通常較高[11]。研究表明,若疾病狀態(tài)下機(jī)體腸道內(nèi)厚壁菌門比例降低,則會(huì)引起胃腸道代謝異常,并導(dǎo)致血液循環(huán)系統(tǒng)中SCFAs的濃度降低,進(jìn)而影響宿主免疫系統(tǒng)和全身炎癥因子的組成[12]。肺結(jié)核患者腸道菌群厚壁菌門豐度降低提示肺結(jié)核患者腸道菌群紊亂,可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能受損[10]。

    兩組間差異菌屬共鑒定出12種,其中雙歧桿菌屬屬于放線菌門,副擬桿菌屬與臭桿菌屬屬于擬桿菌門,梭狀芽胞桿菌屬、Anaerostipes、勞特氏菌屬、糞球菌屬、毛螺菌屬、羅氏菌屬、糞桿菌屬、瘤胃球菌屬、真桿菌屬均屬于厚壁菌門。雙歧桿菌是一種益生菌,研究表明雙歧桿菌在小鼠肺部肺炎克雷伯菌感染中具有促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生抗體和γ-干擾素(INF-γ),增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性的有益作用[13],除了對(duì)抗細(xì)菌感染,雙歧桿菌還可以通過誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生減輕哮喘小鼠模型的肺部病理改變[14],這表明肺結(jié)核患者腸道雙歧桿菌下降,可能不利于疾病的預(yù)后。差異菌屬中SCFAs產(chǎn)生菌包括:梭狀芽胞桿菌屬[15]、毛螺菌屬[16]、羅氏菌屬[16]、瘤胃球菌屬[16]、真桿菌屬[16]、糞桿菌屬[16]、勞特氏菌屬[17]、糞球菌屬[17]、Anaerostipes[18],其中只有Anaerostipes、真桿菌屬在肺結(jié)核組呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),其余菌屬均較健康對(duì)照組下降,因羅氏菌屬、毛螺菌屬、瘤胃球菌屬為人體腸道內(nèi)主要的SCFAs產(chǎn)生菌[19],推測(cè)肺結(jié)核組腸道內(nèi)SCFAs產(chǎn)生下降。文獻(xiàn)報(bào)道,SCFAs至少通過兩種機(jī)制作用于免疫和內(nèi)皮細(xì)胞:激活G蛋白偶聯(lián)受體和抑制組蛋白去乙?;?,其與各種類型的免疫細(xì)胞功能及宿主的免疫應(yīng)答相關(guān)[20],并可抑制腸道病原體定植,維持腸上皮屏障完整及為腸細(xì)胞提供能量[21-22]。在炎癥性腸病、結(jié)直腸癌和糖尿病等炎癥相關(guān)疾病患者的腸道菌群中也觀察到SCFAs產(chǎn)生菌豐度的降低[23]。結(jié)核病患者SCFA產(chǎn)生菌的下降可能表明全身炎癥加劇和全身免疫反應(yīng)受損,從而對(duì)肺結(jié)核患者產(chǎn)生不利影響。然而,Segal等[24]發(fā)現(xiàn),艾滋病患者口腔以及肺部的厭氧菌通過發(fā)酵SCFAs,從而誘導(dǎo)HIV感染患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)分化,以及抑制外周血單個(gè)核細(xì)胞中IFN-γ和IL-17A的產(chǎn)生,增加HIV感染患者對(duì)MTB的易感性。同樣,Lachmandas等[25]在肺結(jié)核與糖尿病共病患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn),丁酸鹽可降低MTB誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子反應(yīng),同時(shí)增加IL-10的產(chǎn)生,增加宿主感染結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)。因此,SCFAs可能在肺結(jié)核與其他疾病共病患者體內(nèi)發(fā)揮不利作用,SCFAs產(chǎn)生菌在肺結(jié)核患者,以及在肺結(jié)核與其他疾病共病患者體內(nèi)的具體作用還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

    BugBase是一種微生物表型預(yù)測(cè)工具,基于OTU物種信息可對(duì)人類腸道菌群的功能進(jìn)行預(yù)測(cè),本研究中BugBase分析結(jié)果顯示,肺結(jié)核患者腸道菌群生物膜形成能力增強(qiáng)、革蘭氏陰性菌比例增加、氧化脅迫耐受,綜合兩組的氧需求(需氧菌、厭氧菌、兼性菌)表型來看,肺結(jié)核患者腸道菌群厭氧菌減少,兼性菌增加,提示肺結(jié)核組患者腸道菌群氧耐受能力明顯提高,該能力的提高預(yù)示肺結(jié)核組患者腸道菌群處于紊亂狀態(tài)[26]。正常情況下,腸道是一個(gè)高強(qiáng)度的厭氧環(huán)境,腸道微生物主要由厭氧菌組成,當(dāng)腸道理化環(huán)境,如pH值、離子濃度、水分、腸道通透性等的改變會(huì)引起腸道氧氣增多,而人體腸道內(nèi)的條件致病菌氧耐受程度遠(yuǎn)大于腸道正常菌群[27],氧動(dòng)力學(xué)在調(diào)節(jié)腸道動(dòng)態(tài)平衡中起著核心作用,氧梯度的破壞是引起許多腸道疾病的原因,包括炎癥性腸病和大腸癌等[28]。肺結(jié)核患者腸道菌群中需氧菌及兼性厭氧菌豐度增高,提示肺結(jié)核患者的腸道微生態(tài)環(huán)境中氧含量的增加,這種改變可能是肺結(jié)核患者感染MTB的因素之一。

    本研究存在一定的局限性,僅初步發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者腸道菌群組成及表型與健康對(duì)照者存在區(qū)別,尚不能確定這種變化的發(fā)生是在MTB感染之前還是之后,后續(xù)仍需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證兩者之間的因果關(guān)系。并且受試者未進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化飲食,而飲食對(duì)個(gè)體腸道菌群具有一定的影響[29]。同時(shí),由于不是16S全長(zhǎng)測(cè)序,16S rRNA V4對(duì)菌群的分辨率較低,無法鑒定到種水平,且16S是存在于所有細(xì)菌中的一段序列[30],無法鑒定腸道微生物中寄生蟲、病毒、真菌,選擇宏基因組測(cè)序可以對(duì)樣本中所有微生物進(jìn)行鑒定。但細(xì)菌16S序列具有高度的相似性,對(duì)16S rRNA V4區(qū)測(cè)序,可以將腸道菌群鑒定到屬水平[31],且其測(cè)序成本遠(yuǎn)低于宏基因測(cè)序,目前仍廣泛應(yīng)用于鑒定疾病狀態(tài)下患者與健康對(duì)照者腸道菌群的差異性研究中。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)在疾病狀態(tài)下,肺結(jié)核患者存在腸道菌群組成及細(xì)菌表型改變,肺結(jié)核患者腸道菌群多樣性下降,菌群定植能力低于健康人。菌群組成水平上SCFAs產(chǎn)生菌相關(guān)的細(xì)菌豐度下降,目前已有研究證明補(bǔ)充益生菌能增強(qiáng)宿主的抗結(jié)核免疫力[4]。本研究為探索微生態(tài)療法在肺結(jié)核疾病中的治療提供了一定的研究思路。

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