結(jié)核病重組蛋白亞單位疫苗研究進展

曹倩倩 祝秉東 牛紅霞

卡介苗(BCG)是唯一可用于臨床的結(jié)核病疫苗，但是其保護效果仍存在不確定性[1-2]。據(jù)報道，BCG可預(yù)防新生兒及兒童罹患結(jié)核性腦膜炎和粟粒性結(jié)核病等，但其對成人肺結(jié)核的保護效果欠佳[3]。全球結(jié)核病疫情仍然十分嚴(yán)峻[4]，迫切需要研發(fā)新型結(jié)核病疫苗。根據(jù)疫苗的組分或免疫策略，新型在研結(jié)核病疫苗分為結(jié)核分枝桿菌減毒活疫苗、重組BCG、病毒載體疫苗、結(jié)核分枝桿菌滅活疫苗和重組蛋白亞單位疫苗等類型[5]。其中，重組蛋白亞單位疫苗基于結(jié)核分枝桿菌保護性抗原蛋白及免疫佐劑構(gòu)建，其成分明確、安全性好，且可通過誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較多的中央記憶性T細胞提供長期免疫保護效果[6]。此外，重組蛋白亞單位疫苗還可作為治療性疫苗用于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的治療。筆者現(xiàn)將結(jié)核病重組蛋白亞單位疫苗的研究進展綜述如下。

一、結(jié)核分枝桿菌保護性抗原

應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組蛋白亞單位疫苗，首先需要篩選有效的結(jié)核分枝桿菌保護性抗原。結(jié)核分枝桿菌菌體成分復(fù)雜，含有大量脂質(zhì)、多糖及近4000種蛋白質(zhì)，不同成分均具有一定的免疫原性。根據(jù)抗原的不同特性分為以下幾種類型：

1.細胞壁及菌體表面抗原：結(jié)核分枝桿菌細胞壁和莢膜含有大量的糖脂，如索狀因子、脂阿拉伯甘露聚糖、脂甘露聚糖、葡萄糖單霉菌酸酯、磷脂酰肌醇甘露糖苷等[7]。其中，索狀因子是分枝菌酸與海藻糖結(jié)合所形成的一種糖脂，可以刺激巨噬細胞釋放促炎因子，提高機體體液免疫和細胞免疫應(yīng)答；脂阿拉伯甘露聚糖、脂甘露聚糖與葡萄糖單霉菌酸酯可激活T細胞免疫應(yīng)答，降低細菌載量[8-9]。由此可見，結(jié)核分枝桿菌的這些糖脂組分可作為結(jié)核病疫苗候選抗原或佐劑。但是，糖脂抗原難以用生物工程的方法進行制備，且分離純化單一組分困難，其在疫苗中的應(yīng)用還需更多探索。

結(jié)核分枝桿菌細胞壁和莢膜的脂蛋白和糖蛋白同樣具有免疫原性，也可作為疫苗的候選抗原[10-11]。肝素結(jié)合血凝素是菌體表面黏附素，幫助結(jié)核分枝桿菌黏附在宿主細胞表面，促進肺外感染的發(fā)生[12]。肝素結(jié)合血凝素不但能夠刺激機體產(chǎn)生血清抗體和呼吸道黏膜抗體，還能夠激活Th1和Th17型細胞免疫應(yīng)答[13]。結(jié)核分枝桿菌菌毛蛋白能夠與宿主細胞層粘連蛋白結(jié)合，在激活黏膜免疫應(yīng)答方面強于分泌性蛋白。因此，結(jié)核分枝桿菌菌體表面的這些脂蛋白和糖蛋白在重組蛋白亞單位疫苗研發(fā)中同樣具有重要意義[14]。

2.分泌性抗原：結(jié)核分枝桿菌可以分泌大量蛋白到菌體外，有些分泌蛋白抑制宿主免疫應(yīng)答促進免疫逃逸[15]，有些分泌蛋白則可以激活免疫信號通路誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[16]。據(jù)報道，結(jié)核分枝桿菌分泌的具有抗原性的蛋白有：Ag85復(fù)合物、早期分泌抗原靶6(ESAT-6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)、MPT64、Rv3841、MPT63、Mtb8.4、KatG、Mtb81、MTB48、MTB12等。Ag85復(fù)合物由3種分泌蛋白Ag85A、Ag85B和Ag85C組成，其作為毒力因子有助于病原菌對宿主細胞的黏附、侵襲和播散，在結(jié)核分枝桿菌的致病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。ESAT-6是一種低相對分子質(zhì)量、早期分泌具有免疫原性較強的抗原，可以在結(jié)核分枝桿菌感染期持續(xù)表達，誘導(dǎo)較強的T細胞免疫應(yīng)答。CFP-10是一種結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白，能夠有效激活 T細胞免疫應(yīng)答[18]。Mtb10.4屬于ESAT-6家族成員，在結(jié)核病患者和BCG接種人群中可以誘導(dǎo)強烈的T細胞免疫應(yīng)答[19]。分泌性抗原除了免疫原性強的優(yōu)勢外，還易于異源表達和制備，是理想的重組蛋白亞單位疫苗候選抗原。比如，Ag85B、ESAT-6和CFP-10在重組蛋白亞單位疫苗構(gòu)建中被廣泛應(yīng)用[15，20]，候選疫苗GamTBvac(Ag85A-ESAT-6-CFP-10/CpG ODN)處于Ⅱ期臨床試驗。

3.生長期抗原和休眠期抗原：結(jié)核分枝桿菌生長周期，根據(jù)不同的代謝狀態(tài)可分為復(fù)蘇期、復(fù)制期和休眠期多個階段。在不同的代謝狀態(tài)下，結(jié)核分枝桿菌表達的抗原譜不盡相同，即每個生長階段有不同的免疫優(yōu)勢抗原。據(jù)報道，結(jié)核分枝桿菌復(fù)蘇期優(yōu)勢表達抗原有Rv2787、Rv2450c、Rv1774、Rv1794等[21]；復(fù)制期優(yōu)勢表達抗原有Mtb10.4、Mtb8.4、ESAT6、Ag85B等[22]；休眠期優(yōu)勢表達抗原有HspX、Rv2626c、Rv2007c、Rv1738、Rv3130c等[23]。感染人體的結(jié)核分枝桿菌并不是單一代謝狀態(tài)，而是包含不同生長階段的結(jié)核分枝桿菌，并且不同代謝狀態(tài)的細菌在一定條件下會相互轉(zhuǎn)換[24]。因此，理想的重組蛋白亞單位疫苗應(yīng)該是包含不同代謝狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌優(yōu)勢抗原的多階段疫苗[25]。目前，多階段疫苗ID93(Rv2608-Rv3619-Rv3620-Rv1813)和H56(Ag85B-ESAT-6-Rv2660c)處于Ⅱ期臨床試驗階段，且顯示出較好的臨床保護效果。筆者課題組用休眠期抗原HspX和Rv2626，分別與復(fù)制期抗原Mtb10.4、ESAT-6、Mtb8.4、Ag85B融合，構(gòu)建了多階段疫苗MH(Mtb10.4-HspX)、LT69(ESAT-6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Hspx)和LT70(ESAT-6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c)，毒株攻擊實驗結(jié)果顯示多階段疫苗比單一復(fù)制期抗原所構(gòu)建疫苗具有更好的保護效果[26-28]。

4.BCG缺失區(qū)抗原：通過比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與牛分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株相比，BCG毒力降低的原因是缺失了編碼毒力因子的多個基因。這些缺失的基因組片段被稱為BCG缺失區(qū)(regions of deletion，RD)。結(jié)核分枝桿菌免疫保護性抗原ESAT-6、CFP-10、MPT64、Rv1978等都屬于BCG的RD區(qū)抗原[29]。此外，RD區(qū)抗原Rv3619c、Rv3620c、Rv3872、Rv3873、Rv1984、Rv3117、Rv2346c、Rv3425等也被發(fā)現(xiàn)具有較強的免疫原性。BCG保護效果不理想，可能與丟失的大量編碼保護性抗原基因相關(guān)[30]。因此，重組蛋白亞單位疫苗構(gòu)建時，應(yīng)關(guān)注BCG缺失區(qū)抗原。

二、佐劑

免疫佐劑是重組蛋白亞單位疫苗設(shè)計的關(guān)鍵成分。結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)寄生菌，體液免疫保護效果欠佳，需要誘導(dǎo)Th1和Th17型細胞免疫應(yīng)答來對抗其感染。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)激動劑可與蛋白或多肽結(jié)合，刺激機體產(chǎn)生有效的細胞免疫應(yīng)答[31-32]。目前，重組蛋白亞單位疫苗佐劑主要基于Toll樣受體激動劑，如IC31由陽離子抗菌肽KLKL5KLK和合成的TLR-9激動劑寡脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN1a)組成[33-34]；AS01是由單磷酰脂A(monophosphoryl lipid A，MPL)和皂角苷(QS-21)組成的油包水型乳劑，其中，MPL為多糖解毒衍生物可激活TLR-4介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答[35-36]。GLA-SE為含吡喃葡萄糖基脂質(zhì)(glucopyranosyl lipid adjuvant，GLA)的角鯊烯水包油型乳劑，GLA為TLR-4激動劑，可誘導(dǎo)樹突狀細胞成熟和增強Th1型細胞免疫應(yīng)答[37]。CpG ODN(CpG o1igodeoxynucleotides)是人工合成含有非甲基化胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脫氧核苷酸，其為TLR-9激動劑，可通過增強抗原遞呈提高體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答[38]。筆者課題組應(yīng)用二甲基三十六烷基銨(dimo-thy-lidioctyl ammonium bromide，DDA)和TLR-3激動劑聚肌胞苷酸(Poly Ⅰ:C)制備DDA-Poly Ⅰ:C(DP)佐劑。其中，DDA是一種陽離子脂質(zhì)體，可將蛋白抗原遞呈給抗原遞呈細胞誘導(dǎo)Th1型細胞免疫應(yīng)答；Poly Ⅰ:C是TLR-3激動劑，可誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。DP佐劑與結(jié)核分枝桿菌融合抗原聯(lián)合免疫小鼠，顯示出較好的佐劑效應(yīng)和安全性[39-40]。此外，干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)通路激活劑環(huán)二核苷酸可以誘導(dǎo)Th17型的細胞免疫應(yīng)答，且顯示較強的抗結(jié)核保護效果[41]。因此，可考慮基于STING通路激活劑開發(fā)更多的重組蛋白亞單位疫苗適用佐劑。

三、進入臨床試驗階段的重組蛋白亞單位疫苗及其保護效果

目前，全球至少有14種結(jié)核病疫苗進入臨床試驗階段，包括6種重組蛋白亞單位疫苗，分別是AEC/BC02、ID93/GLA-SE、GamTBvac、H56/IC31、H4/IC31和M72/AS01E。H4/IC31候選疫苗因保護效果不佳，已終止臨床試驗[5]。AEC/BC02是國內(nèi)第一個進入臨床試驗的結(jié)核病疫苗，主要用于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染人群的免疫預(yù)防，目前已經(jīng)完成Ⅰ期臨床試驗(NCT03026972)，正在開展Ⅰb期臨床試驗(NCT04239313)[42]。處于Ⅱa期臨床試驗的候選疫苗有：(1)ID93/GLA-SE：在南非多地對接種過卡介苗的結(jié)核病患者，開展免疫治療的臨床效果評價[43]。(2)GamTBvac：在一項包括180名接種過BCG的健康志愿者的臨床試驗中，評價該疫苗的安全性和免疫原性[44]。臨床試驗結(jié)果顯示，ID93/GLA-SE和GamTBvac候選疫苗均可在人體誘導(dǎo)持久的抗原特異性體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。處于Ⅱb期臨床試驗階段的疫苗有：(1)H56/IC31候選疫苗：該疫苗經(jīng)Ⅰ期臨床試驗評價，顯示出良好的安全性和較強的免疫原性[20]。Ⅱ期臨床試驗結(jié)果顯示，在感染和未感染結(jié)核分枝桿菌的成人中低劑量接種2次或3次，均可誘導(dǎo)持久的抗原特異性CD4+T細胞免疫應(yīng)答[45]。(2)M72/AS01E候選疫苗：Ⅱ期臨床試驗結(jié)果顯示，在18～50歲的HIV陰性的結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者中，該疫苗對活動性肺結(jié)核發(fā)病的保護率為54%(90%CI：14%～75%，P=0.04)[46-47]；但是，其3年的隨訪結(jié)果顯示保護率下降到49.7%(90%CI：12.1%～71.2%)[48]。上述疫苗在受試人群中可以誘導(dǎo)有效的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答，均沒有觀察到出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，少數(shù)不良反應(yīng)為局部炎癥反應(yīng)和輕微的肌肉酸痛等。綜上所述，重組蛋白亞單位疫苗具有很好的安全性，并可具有一定的保護效力。

四、重組蛋白亞單位疫苗應(yīng)用策略

BCG接種主要誘導(dǎo)機體產(chǎn)生效應(yīng)記憶性T細胞和效應(yīng)T細胞。然而，效應(yīng)記憶性T細胞不能夠提供長期的免疫保護[49]。中央記憶性T細胞在疫苗長期保護作用中發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用[50]。據(jù)報道，重組蛋白亞單位疫苗具有成分單一、安全性高，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較多的中央記憶性T細胞[51]，因此，可作為強化疫苗用于加強BCG的效應(yīng)。以重組蛋白亞單位疫苗H56為例，在小鼠和食蟹猴感染模型采用BCG初免、重組蛋白亞單位疫苗加強免疫策略，結(jié)果表明，加強免疫的長期保護效果明顯優(yōu)于BCG單獨免疫組[52-53]。BCG是我國免疫規(guī)劃預(yù)防接種疫苗，人群普遍接種，因此，重組蛋白亞單位疫苗作為強化疫苗應(yīng)用易被接受且符合我國國情。此外，重組蛋白亞單位疫苗LT69在小鼠體內(nèi)單獨免疫3次，在末次免疫后30周可提供與BCG相當(dāng)?shù)谋Ｗo效果[27]；H56在小鼠體內(nèi)單獨免疫3次，在末次免疫后24周可提供比BCG更好的保護效果[52]。因此，重組蛋白亞單位疫苗同樣具有單獨應(yīng)用替代BCG的應(yīng)用前景。

研究發(fā)現(xiàn)，在人和實驗動物中采用皮內(nèi)注射BCG保護效果不佳[54]。在恒河猴體內(nèi)，與其他注射途徑(皮內(nèi)、皮下或氣霧)相比，靜脈注射BCG能夠提供更好的保護效果[55-56]。重組蛋白亞單位疫苗接種劑量和加強次數(shù)也是影響免疫效果的關(guān)鍵。重組蛋白亞單位疫苗通常需要多次加強免疫才能獲得有效的免疫記憶，但并不是加強次數(shù)越多越好，強化免疫次數(shù)太多可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生，降低疫苗的保護效果[57]。重組蛋白亞單位疫苗接種策略通常為間隔2周或3周加強免疫，即0-2-4或0-3-6周的3次免疫方案。筆者課題組研究發(fā)現(xiàn)，0-4-12周加強免疫的方案誘導(dǎo)的中央記憶性T細胞的數(shù)量更多[6]。因此，重組蛋白亞單位疫苗的最佳免疫途徑及策略還有待進一步研究。

五、重組蛋白亞單位疫苗研究面臨的挑戰(zhàn)

建立有效動物模型將為疫苗評價提供關(guān)鍵支撐。結(jié)核病候選疫苗通常在小鼠模型中進行初步效果評價。此模型成本較低且易于基因改造獲得基因改造小鼠，但是小鼠和人的生理和免疫特征有較大的差距，不能模擬人類結(jié)核分枝桿菌感染的真實狀態(tài)。獼猴與人的親緣關(guān)系更近，常用于結(jié)核病疫苗臨床前保護效果的評價，但是其購買和飼養(yǎng)成本較高。豚鼠感染結(jié)核分枝桿菌后與人類感染具有相似的病理特征，是結(jié)核病疫苗研究的良好動物模型。但是該模型也存在可用的免疫檢測試劑有限、飼養(yǎng)條件要求高等缺點，因此，沒有作為結(jié)核病疫苗研究的主要動物模型使用。此外，人源化小鼠可克服上述動物模型的缺點，可用于評價結(jié)核病疫苗的動物模型的建立[58]。

γ-干擾素等Th1型的細胞因子通常作為結(jié)核病疫苗評價的免疫檢測指標(biāo)，但是其與疫苗的保護效果和保護周期的相關(guān)性還沒有確切的定論。目前認為，T細胞免疫記憶反應(yīng)，尤其是中央記憶性T細胞的數(shù)量和質(zhì)量決定疫苗的長期保護效果。此外，黏膜分泌的分泌型免疫球蛋白A抗體可以阻斷結(jié)核分枝桿菌與巨噬細胞及上皮細胞的結(jié)合，發(fā)揮保護性免疫作用[59]。因此，體液免疫，尤其是黏膜免疫在結(jié)核病疫苗保護中的作用也需關(guān)注。

六、總結(jié)與展望

BCG在臨床應(yīng)用有近百年的歷史，但是全球結(jié)核病疫情仍然十分嚴(yán)峻，提示結(jié)核病預(yù)防仍然缺乏高效的疫苗。在研的新型結(jié)核病疫苗中，重組蛋白亞單位疫苗可提供長期的免疫保護效果，且成分明確、安全性好，具有較好的應(yīng)用開發(fā)前景。隨著基因組學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，人們對結(jié)核分枝桿菌的保護性抗原及佐劑的認識進一步提高。目前，全球已有6種結(jié)核病重組蛋白亞單位疫苗正在開展不同階段的臨床試驗。雖然結(jié)核病重組蛋白亞單位疫苗的研究進展令人鼓舞，但是其接種途徑、免疫策略和遞送系統(tǒng)等方面還有很多問題需進一步探索。