不同栽培模式對人參根際土壤微生物多樣性的影響研究

王 勇，何 舒，熊冰杰，王慧玲，賈凌云，何霞紅*，施 蕊*

不同栽培模式對人參根際土壤微生物多樣性的影響研究

王 勇1, 2，何 舒1，熊冰杰1，王慧玲3，賈凌云2，何霞紅1*，施 蕊1*

1. 西南林業(yè)大學，西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，國家林業(yè)和草原局西南風景園林工程技術(shù)研究中心，云南功能性花卉及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心 云南 昆明 650224 2. 沈陽藥科大學中藥學院，遼寧 沈陽 110016 3. 云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，云南 昆明 650021

以不同栽培模式下的人參根際土壤為研究對象，分析紅松下種植人參、農(nóng)田土壤種植下的人參根際土壤微生物菌群落多樣性及群落功能特征的變化，探討環(huán)境土壤微生物對林下人參、大棚人參生長的影響。采用第三代測序技術(shù)，對不同種植模式人參根際土壤中的優(yōu)勢菌群和差異微生物進行分析。在林下參根際土壤中檢測到α-變形桿菌- 13-2-20CM-2-64-7、慢生根瘤菌屬的erythrophlei、SP-URHD0069、Lablabi、硝化螺旋菌SCGC-AG-212-E16、放線菌- 13-1-2CM-4-69-9為優(yōu)勢菌種，這些固氮菌在加強了林下人參的養(yǎng)分吸收，在增加森林碳匯方面起到積極作用，同時增強了林下人參的抗逆性。相同年限的大棚人參根際土壤中檢測出單胞菌、熒光假單胞菌、諾卡氏菌-SP-lS0805N、諾卡氏菌terrae、γ-變形桿菌-13-2-20CM-66-19顯著增多，其中氨化細菌，纖維素分解菌、硝化菌豐度較高，這與種植方式比如施肥，翻耕、農(nóng)藥使用有密切聯(lián)系。不同的栽培模式影響著人參根際土壤微生物菌群落多樣性，及菌群功能特征。為后期人參綠色種植提供理論依據(jù)，為人參農(nóng)林復合經(jīng)營的可持續(xù)發(fā)展提供參考。

林下人參；根際土壤；微生物多樣性；多樣性分析；栽培模式

人參C. A. Meyer為五加科人參屬植物，是我國重要的傳統(tǒng)中藥，也是歷史悠久的藥食兩用天然資源，人參中主要活性成分人參皂苷對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及腫瘤等疾病均具有較好的臨床應(yīng)用價值，已應(yīng)用于多種疾病的治療和預防，在中醫(yī)藥發(fā)展中有著重要的地位和作用[1-2]。然而人參生長周期長，連作障礙嚴重，隨著人們對人參需求的持續(xù)增長，人參資源供應(yīng)日趨緊張，解決人參供給問題，對于促進人參經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要性。近年來，中藥材的生態(tài)種植倍受關(guān)注，并迅速發(fā)展。2018年黃璐琦院士在全國中藥材生產(chǎn)形勢分析會上提出“八化發(fā)展”時明確指出“種植生態(tài)化”。郭蘭萍等[3-5]結(jié)合中藥材的特點，從生態(tài)農(nóng)業(yè)的視角提出了中藥生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展模式，林下種植通過對森林土地資源的利用以及借助于林蔭優(yōu)勢，可以大大提高林地的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益，對我國生態(tài)文明建設(shè)有著重要的現(xiàn)實意義據(jù)統(tǒng)計，世界人參總產(chǎn)量約8500 t，其中遼寧省產(chǎn)量為5000 t，約占世界總產(chǎn)量的60%，占全國的80%，遼寧山區(qū)自然資源豐富，植被主要是以闊葉次生林、人工針葉林（落葉松和紅松）以及灌木林為主，生態(tài)條件優(yōu)良，極其適合林下人參的種植，林下種植成為解決人參供不應(yīng)求問題的途徑之一[6-8]。

林下人參種植中，因地制宜以松林凋落物作為林下人參生長環(huán)境，一方面松林凋落物的分解使植物中的無機元素逐步歸還土壤，保持了土壤肥力；另一方面凋落物也給土壤生物提供了營養(yǎng)物質(zhì)。土壤微生物作為松林凋落物不可或缺的分解者，群落多樣性的改變能反應(yīng)土壤質(zhì)量的動態(tài)變化，其功能多樣性變化也能直接反映松林生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)狀況[9-11]。因此，微生物在林下人參生長及松林生態(tài)環(huán)境扮演著重要角色。

隨著分子生物學技術(shù)的廣泛應(yīng)用，本研究采用第三代測序技術(shù)，從林下人參、大棚人參根際土壤微生物菌群落多樣性，及群落功能特征的變化的角度，探討環(huán)境土壤微生物與對林下人參、大棚人參生長的影響，為林下人參健康土壤種植，及今后林下人參復合經(jīng)營的可持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大棚人參（NPS）樣本采集于遼寧省本溪市本溪滿族自治縣艾家堡子二號橋（124°1'5.12″ N，40°56'1.74″E）；林下人參（PS）樣本采集于遼寧省本溪市本溪滿族自治縣東營坊鄉(xiāng)南營坊村（124°7'25″ N、41°29'8″E）。沈陽藥科大學中藥學院中藥資源教學研究室賈凌云博士鑒定為人參C. A. Meyer。土壤樣本委托云南君維生物科技公司檢測。

2 方法

2.1 土壤的采集

PS、NPS根際土壤采集于2021年3月20日遼寧省本溪進行，土樣采樣采用分層取樣的方法。地表至10 cm為表層土、10～20 cm為根層、30 cm為底層，每個點取3份，3份混合到一起為一個樣本，其中隨機采集3個樣本林下人參根際土壤（PS1、PS2、PS3），3個樣本大棚根際土壤（NPS1、NPS2、NPS3）。將新鮮土樣裝入無菌自封袋，用冰盒迅速帶回實驗室，過篩采用尼龍篩（過100目篩），去除雜物后分為樣品經(jīng)冷凍干燥后，用于土壤分析。并采集各土壤樣本的人參植株，抖去根際土壤，測植株高度及質(zhì)量。分析不同栽培模式下人參生長狀況[12]。

2.2 基因測序

2.2.1 基因組DNA的提取和PCR擴增 采用CTAB方法對樣本的基因組DNA進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至10 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。引物對應(yīng)區(qū)域：16S V4區(qū)引物（341F和806R）：鑒定細菌多樣性；引物為341F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGC- AG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCT- AAT-3’）；ITS1區(qū)引物（ITS1F和ITS1R）：鑒定真菌多樣性；引物序列為ITS1F（5’-CTTGGTCATT- TAGAGGAAGTAA-3’）和ITS1R（5’-GCTGCGTT- CTTCATCGATGC-3’），此外，擴增區(qū)域還包括16S V3-V4/16S V4-V5/16SV5-V7；古菌16S V4-V5/古菌16S V8；18S V9和ITS2區(qū)。

2.2.2 PCR產(chǎn)物的混樣和純化 PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對目的條帶使用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

2.2.3 文庫構(gòu)建和上機測序 使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用NovaSeq6000進行上機測序。

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算Unifrac距離，構(gòu)建UPGMA樣本聚類樹。使用R軟件（Version 2.15.3）繪制PCA，數(shù)據(jù)采用SPSS v19.0進行統(tǒng)計分析和方差分析（LSD，＜0.05用Microsoft Excel 2013進行繪圖，LEfSe軟件估算每個組分（物種）豐度對差異效果影響的大小。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同栽培模式下人參根際土壤微生物群落組成分析

為了研究PS、NPS土壤微生物群落差異，對PS組繪制圓餅圖（圖1），在門水平，變形菌門（Proleobactera）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、綠彎菌門（Chloroflaxi）占比分別為44%、11%、11%、12%，其他占比為22%；在綱水平占比分別為52%、8%、12%、1%，其他占27%。對NPS組繪制圓餅圖（圖2），在門水平，變形菌門、綠彎菌門、疣微菌門占比分別為46%、8%、8%，其他占38%。在綱水平上占比分別為40%、2%、12%，其他占46%，在門水平下，對PS、NPS前10的優(yōu)勢菌群作柱形圖（圖3），分別是變形菌門、放線菌門、疣微菌門、酸桿菌門（Acidabactoria）、硝化螺旋菌門（Nitrospira）、綠彎菌門、擔子菌門（Basidiomycota）、藍菌門（Cyanobactoria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes），分析發(fā)現(xiàn)PS、NPS土壤微生物優(yōu)勢種群結(jié)構(gòu)相似，但各樣本土壤細菌豐度存在差異，其中放線菌門較高。在屬水平下，豐度前10的微生物柱形圖（圖4）發(fā)現(xiàn)，NPS2中假單胞菌豐度高，基于Bray-Curtis距離（圖5）對PS、NPS土壤微生物進行NMDS分析（圖6），分析結(jié)果表明，PS、NPS土壤微生物群落組成具有明顯差異，結(jié)果與柱形圖分析相互驗證，大量試驗證明，微生物產(chǎn)生的約8000種生物活性物質(zhì)中，近70%由變形菌門、放線菌、產(chǎn)生。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，變形菌、放線菌通過產(chǎn)生抗生素、生長調(diào)節(jié)劑、水解酶和生物堿等活性物質(zhì)，有效調(diào)節(jié)土壤微生物區(qū)系，改善土壤微域環(huán)境，進而誘導植物產(chǎn)生抗性，達到控制植株病害、促進生長的作用[13-15]。

圖1 PS根際微生物群落組成

圖2 NPS根際微生物群落組成

圖3 門水平下不同栽培模式人參豐度前10微生物群落結(jié)構(gòu)特征

圖4 屬水平下不同栽培模式人參豐度前10的微生物群落結(jié)構(gòu)特征

3.2 不同栽培模式下人參根際土壤微生物種水平豐度聚類、主成分分析

聚類分析是一種多元統(tǒng)計分析方法，在種水平對PS、NPS土壤微生物進行聚類分析后繪制熱圖，如圖7所示，顏色越接近紅色說明微生物在對應(yīng)樣本中的數(shù)量越高聚集越顯著，越接近于藍色含量越少，PS1、PS2、PS3中微生物種類聚集在左下角落。

NPS1、NPS2、NPS3中微生物種類聚集在右上角落，在聚類熱圖中PS與NPS中聚集的位置不同，PS與NPS 2組樣品之間存在明顯的差異。同時在種水平，對PS、NPS土壤微生物群落的多樣性進行分析（圖8），評估其群落組成相似性及差異性情況。從圖8-b看出，NPS中，2個要作用的微生物類群，其中變形桿菌豐度最大。NPS組主要是丙酸桿菌科的假單胞菌、未知型變形桿菌科、變形桿科的γ-變形桿菌-13 220CM-66諾卡氏科的諾卡氏菌-sp-Iso805N、傘菌綱、放線菌綱，其中丙酸桿菌科的假單胞菌、諾卡菌對其影響程度最大。結(jié)合進化分支圖（圖9）可知，PS組包括4門6綱9目9科8屬，NPS組包括2門5綱6目6科3屬。PS組內(nèi)有差異的標志物相對較多，各類菌群在PS、NPS的占比有所不同，且在其它豐度較低的菌群類別上也有所差別。

圖5 Bray-Curtis距離聚類樹結(jié)構(gòu)(a) 和在門水平上的物種相對豐度分布(b) 圖

圖6 PS and NPS組根際微生物門水平NMDS圖

3.3 不同栽培模式下人參根際土壤微生物顯著差異物種的聚類熱圖分析

基于上述LEfSe軟件篩選出的組間具有差異的物種，在屬水平對差異物種繪制聚類熱圖以反映這些差異物種在各樣品中分布情況?；诓町愇锓N的聚類熱圖展示結(jié)果如圖10所示。

圖7 PS、NPS根際微生物聚類熱圖(a) 和二維空間PCA (b)

PS1中，鞘脂單胞菌屬、新鞘脂菌屬高度聚集；黃色桿菌屬、屬是PS2中優(yōu)勢微生物、慢生根瘤菌屬、紅游菌屬在PS3廣泛存在、慢生根瘤菌屬是一種固氮菌，可以為植物和土壤微生物提供氮源，對植物生長有重要作用。這些特殊微生物群落可能與林下人參抗逆性，藥用成分積累有關(guān)，假單胞菌屬在NPS2組中豐度高度聚集。丙酸桿菌亞目諾卡氏菌屬、真菌屬在NPS中豐度較高。紅游動菌屬可能是引起PS根腐病生的關(guān)鍵菌群，后續(xù)研究應(yīng)重點關(guān)注。

3.4 不同栽培模式下人參生長狀況

不同種植方式人參生長狀況不同，如表1、2所示，其中NPS組平均株高（45.2 cm）明顯高于PS組平均株高（27.8 cm），NPS組平均根質(zhì)量（0.70 g）明顯重于PS組平均根質(zhì)量（0.20 g），NPS組根質(zhì)量與株高成正比。NPS組生長優(yōu)于PS組。

4 討論

研究表明，不同栽培模式下人參微生物群落的多樣性顯著不同。分析發(fā)現(xiàn)大棚人參土壤真菌數(shù)量增加，在綱的水平發(fā)現(xiàn)，NPS組綠彎菌綱高于PS組，特別是某些致病真菌的增加，導致土壤微生物出現(xiàn)從“細菌性”型，到“真菌型”的轉(zhuǎn)變。Dong等[16]發(fā)現(xiàn)三七連續(xù)種植體系下，死苗率與真菌多樣性顯著相關(guān)，致病群落豐度增加；白容霖等[17]在吉林省人參根腐病病原真菌種類的研究表明，在人參生長過程中多數(shù)病害的發(fā)生是由于真菌的感染導致的，真菌的增加也是是參地土壤性狀變劣的主要原因之一[18]。

大棚人參種植中連作障礙是常見的種植問題，連作障礙與微生物群落的動態(tài)變化、土傳致病微生物的增加、土壤的鹽分累積和酸化、營養(yǎng)失衡和植物化感作用等有關(guān)，其中土壤微生物群落多樣性、土壤致病菌的數(shù)量是連作障礙形成的幾個關(guān)鍵因素[19-23]。在NPS中，r-變形門假單胞屬細菌聚集，現(xiàn)有的研究表明，假單胞屬細菌在三七連作障礙的形成過程中具有較強的致病性，張子龍等[24]通過高通量 16S rRNA測序，研究三七健康與根腐病植株根際與根內(nèi)細菌發(fā)現(xiàn)，根際和根內(nèi)根腐病植株的假單胞屬多樣性均顯著高于健康植株。同時本研究還觀察到，在NPS組中，臨床耐藥相關(guān)的細菌諾卡氏菌-sp-Iso805N大量聚集，諾卡氏菌屬是土壤中發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陽性環(huán)境細菌。廣泛存在于水、土壤、塵埃、腐爛的植物以及動物的排泄物中[25-28]。耐藥細菌含有大量耐藥基因，據(jù)報道，一些致病細菌、sp.耐藥基因能通過根系吸收進入煙草體內(nèi)[7]。Demaneche等[29]研究發(fā)現(xiàn)blaTEM116基因在轉(zhuǎn)基因玉米（Bt176）中被頻繁檢出，耐藥基因長期積累對人體帶來很大的威脅和風險，諾卡氏菌屬等的耐藥基因是否隨食物鏈進入人體，這也是嚴重環(huán)境問題，這同時為指導大棚人參對農(nóng)糞使用及栽培方式的改變具有重要意義。

圖8 PS (a) 和NPS (b) 參根際微生物群落LDA值分布圖

圖9 PS、NPS根際微生物差異物種的進化分支圖

圖10 PS和NPS根際土壤顯著差異微生物群落聚類熱圖

表1 2年P(guān)S生長數(shù)據(jù)

表2 2年NPS生長數(shù)據(jù)

在PS組中α-變形菌綱慢生根瘤菌，放線菌是主要組成者，放線菌可以產(chǎn)生多種抗生素，前人研究表明，放線菌劑對人參連作障礙的修復具有重要的應(yīng)用價值，可以調(diào)控土壤微生物區(qū)系平衡，增加有益菌數(shù)量。同時，放線菌對人參也有促生作用，有利于人參根系干物質(zhì)積累，顯著提高參根人參皂苷Re含量[30]。近年來根瘤菌對植物土傳病害生物防治廣泛推廣，Whipps等[31]研究發(fā)現(xiàn)根瘤菌可以產(chǎn)生一種抗生素香草木樨毒素（Trifolitoxin）抑制病原菌的生長，根瘤菌在改善土壤理化性質(zhì)中扮演著重要重要角色，李艷等[32-33]選用了不同的豆科綠肥植物研究了它們對土壤修復的影響，發(fā)現(xiàn)長期種植紫花苜蓿和林生山黧豆的人工草地的土壤鹽分含量明顯降低，0～40 cm土層脫鹽最為強烈，脫鹽率達47.8%～48.8%，0～20 cm土層的有機質(zhì)、全氮含量分別提高了28.4%、42.5%和95.6%、69.8%[34]，碳氮含量直接影響土壤微生物豐度。目前對于多數(shù)根瘤菌的研究仍集中在豆科植物紫花苜蓿重金屬毒性、抗性機制等研究階段，在根瘤菌對五加科人參屬植物影響鮮見，這為人參林下種植及克服連作障礙提供新途徑。

不同種植方式影響土壤微生物豐度與結(jié)構(gòu)，在PS組根際土壤中變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、疣微菌門是主要的優(yōu)勢菌群，其中α-變形桿菌- 13-2-20CM-2-64-7、慢生根瘤菌、慢生根瘤-SP-URHD0069、慢生根瘤菌-Lablabi、硝化螺旋菌-SP-SCGC-AG-212-E16、放線菌-13-1- 2CM-4-69-9大量聚集，這些有益菌具有獨特的固氮能力，在土壤的碳氮循環(huán)中扮演重要的角色，與PS組抗逆性較高，不易感病的原因相關(guān)。NPS組根際土壤中假單胞菌、熒光假單胞菌、諾卡氏菌- SP-lS0805N、諾卡氏菌-terrae、γ-變形桿菌- 13-2-20CM-66-19大量聚集，其中氨化細菌、纖維素分解菌、硝化菌豐度較高，這與種植方式比如施肥、翻耕、農(nóng)藥使用有密切聯(lián)系。農(nóng)藥的使用是引起假單胞菌屬、諾卡菌屬增加的原因。大棚種植肥料使用，改變了根際土壤環(huán)境，提高了微生物數(shù)量，促進了根系的生長，這也是與相同年限PS相比，體積及質(zhì)量遠大于PS組原因。人參的生長與品質(zhì)與土壤健康密切相關(guān)，微生物在土壤健康中扮演重要角色。本實驗僅就種植方式對人參根際微生物差異進行分析，而關(guān)于種植方式影響土壤理化性質(zhì)缺乏詳細的分析，因此今后還有待于進一步探討。在大棚人參種植中，可通過篩選有益菌群，合理施肥，提高NPS抗蟲害能力及品質(zhì)，同時為人參種植回歸山林提供理論依據(jù)，為人參農(nóng)林復合經(jīng)營的可持續(xù)發(fā)展提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Studied on microbial diversity of rhizosphere soil from different cultivated

WANG Yong1, 2, HE Shu1, XIONG Bing-jie1, WANG Hui-ling3, JIA Ling-yun2, HE Xia-hong1, SHI Rui1

1. Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Utilization in the Southwest Mountains of China, Ministry of Education, Southwest Landscape Architecture Engineering Research Center of National Forestry and Grassland Administration, Southwest Forestry University, Kunming, 650224, China 2. College of Traditional Chinese Medicine, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, 110016, China 3. College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Kunming, 650201, China

The rhizosphere soil ofunder different cultivation modes which collected from Benxi, Liaoning Province were studied in this article. The diversity of rhizosphere soil and the changes in functional microbial communities were analyzed between under forestryand Greenhouses.Next generation sequencing technology was used to analyze the dominant flora and differential microorganisms in the rhizosphere soil ofunder different planting patterns.Alphaproteobacteria-bacterium-13-2-20CM-2-64-7, Bradyrhizobium-erythrophlei, Bradyrhizobium-SP-URHD0069, Bradyrhizobium-Lablabi, Nitrosomonas-sp-scGC-AG-212-E16 and actinomycetes-13-1-2 cm-4-69-9 were the dominant bacterias which detected from rhizosphere soil ofunder forest. These nitrogen-fixing bacteria enhanced the nutrient absorption of underforest, which played a positive role in increasing forest carbon sink, and enhanced the resistance of.In the same agedin greenhouse, there was a significant increase of Pseudomonadac、Pseudomonas-fluorescens,Nocardioides-sp-Iso805N,Nocardioides-terrae,Gammaproteobacteria-bacterium-13-2- 20CM-66-19 in its rhizosphere soil. Among them, ammoniating bacteria, cellulose decomposing bacteria and nitrification bacteria are abundant, by which related to planting methods such as fertilization, tillage and pesticide used.Different cultivation patterns affect the diversity and functional characteristics of rhizosphere soil microflora ofg,This study provides theoretical basis for greenplanting in the later stage and provides reference for the sustainable development of ginseng agroforestry.

C.A. Meyer; rhizosphere soil; microbial diversity; diversity analysis; cultivation patterns

R286

A

0253 - 2670(2021)17 - 5303 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.17.023

2021-07-06

國家重點研究計劃（2018YFD0201107）；云南省重大科技專項（2019ZG00901，202102AE090042）；國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-21-05B）；云南省千人計劃高端外國專家專項資助（2019013），2020年云南省級財政林業(yè)科技推廣示范專項（〔2020〕ts09號）

王 勇（1995—），男，碩士研究生，研究方向中藥學。E-mail: 3032657477@qq.com

何霞紅（1975—）博士，教授，博士生導師。E-mail: hexiahong@hotmail.com

施 蕊（1982—），女，沈陽藥科大學67期中藥學， 2004級中藥學碩士校友，博士，副教授。2020年云南省高層次人才培養(yǎng)支持計劃，2019年中國產(chǎn)學研合作創(chuàng)新獎二等獎，主要從事林下中藥材產(chǎn)業(yè)化研究。E-mail: shirui@swfu.edu.cn

[責任編輯 時圣明]