鴿乳中產(chǎn)纖維素酶和脂肪酶微生物的分離鑒定

朱建國(guó)，嚴(yán)璐，劉雙倩，龔道清*，劉穎，謝鵬*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225125；2. 淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 淮安 223001)

鴿子屬于晚成雛鳥類，其嗉囊組織在結(jié)構(gòu)和功能方面與其他禽類不同，除儲(chǔ)存和軟化食物外，還承擔(dān)著類似于哺乳動(dòng)物乳腺的“泌乳”功能。剛孵化的幼鴿由于不具備覓食能力，必須依靠親鴿嗉囊形成的 “鴿乳(crop milk)”作為唯一營(yíng)養(yǎng)來源[1]。鴿乳是由親鴿嗉囊的上皮細(xì)胞層脫落形成，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、免疫球蛋白、促生長(zhǎng)因子等，對(duì)乳鴿的生長(zhǎng)發(fā)育、機(jī)體免疫力和腸道微環(huán)境等起重要作用[2-3]。早期鴿乳的主要成分為蛋白質(zhì)和脂肪，此外還包括少量的碳水化合物和礦物成分，隨著幼鴿日齡的增長(zhǎng)，其外觀形態(tài)和營(yíng)養(yǎng)成分均出現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，自然狀態(tài)下，0～5 d鴿乳為淡黃色乳酪狀，5～7 d開始變?yōu)榱髻|(zhì)性液體并帶有發(fā)酵軟化的半顆粒狀飼料[3]，乳鴿發(fā)育中后期飼料及碳水化合物的比例需不斷增加。研究表明：乳鴿采食鴿乳至3周齡，體重會(huì)增長(zhǎng)近22倍，然而幼雛剛出殼不久，胰腺及小腸黏膜自身分泌的消化酶活性較低，消化道發(fā)育尚不健全[4-7]。Shetty等[4]發(fā)現(xiàn)鴿乳中存在多種微生物，已有研究證實(shí)微生物可通過產(chǎn)生相關(guān)酶類來提高宿主的消化能力[8]，由此推測(cè)鴿乳中可能存在此類微生物，幫助雛鴿消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使其腸道能夠適應(yīng)高含量蛋白和脂肪的鴿乳[3]。此外，已發(fā)現(xiàn)鴿乳中富含半乳糖酶、亮氨酸氨肽酶、谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶，脂肪酶和蛋白酶等也在脫落的嗉囊上皮細(xì)胞中持續(xù)積累，幼鴿依靠這些酶類進(jìn)一步促進(jìn)自身消化功能的發(fā)育[4, 9]。雖然有關(guān)人工仿制鴿乳的研究多見報(bào)道，但大都并未取得良好的替代飼喂效果，除人工配制技術(shù)尚不成熟外，未充分了解微生物在其中的作用可能也是原因之一[10]。鑒于此，本試驗(yàn)將采集哺育期的鴿乳樣品，通過富集培養(yǎng)、初篩、復(fù)篩以及發(fā)酵培養(yǎng)，以期篩選出鴿乳中部分產(chǎn)酶微生物并對(duì)其進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取7、8日齡乳鴿各3只，鴿乳取樣方法參考文獻(xiàn)[11]，具體操作如下：用酒精擦拭消毒乳鴿嗉囊無血管處，使用手術(shù)刀片小心切開(手術(shù)刀消毒)，迅速收集鴿乳并裝入10 mL 無菌離心管中，迅速置于4 ℃冰箱保存。立即縫合乳鴿傷口并移入窩中，將采集的鴿乳充分混合并稱取5 g樣品，供產(chǎn)酶菌株分離用。

1.2 培養(yǎng)基制備

產(chǎn)纖維素酶微生物培養(yǎng)基包括：富集培養(yǎng)基、剛果紅培養(yǎng)基、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和保藏培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分參照文獻(xiàn)[12]；產(chǎn)脂肪酶微生物培養(yǎng)基包括：富集培養(yǎng)基、溴甲酚紫培養(yǎng)基、底物溶液、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分參照文獻(xiàn)[13]。以上培養(yǎng)基使用前均需121 ℃滅菌20 min；底物溶液：大豆油和2%聚乙烯醇體積比為1∶3，混合后4 ℃靜置1 h后高速勻漿5 min，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品處理

將采集的鴿乳樣品加入到盛有45 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，置于搖床中，150 r/min，振蕩l h，讓鴿乳與生理鹽水均勻混合，使產(chǎn)酶微生物懸浮于生理鹽水中，振蕩結(jié)束后靜置15 min，備用。

1.4 產(chǎn)纖維素酶微生物的初篩、復(fù)篩及發(fā)酵

選用剛果紅篩選培養(yǎng)基，利用菌周圍出現(xiàn)透明圈現(xiàn)象來判斷該菌種是否為產(chǎn)纖維素酶的菌種，其透明圈面積大小可以反映其產(chǎn)酶能力的高低。吸取5 mL振蕩完畢的懸浮液，無菌接種到盛有45 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，35 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)1～2 d，期間觀察培養(yǎng)基的富集程度，然后稀釋涂布于剛果紅篩選培養(yǎng)基，35 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，期間觀察菌落的生長(zhǎng)狀況，挑選符合預(yù)期的菌種進(jìn)行復(fù)篩與純化。

選取透明圈明顯的菌種復(fù)篩劃線培養(yǎng)2～3次，隨后挑選明顯的單菌落，無菌操作挑取菌落，一半接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(斜面保種)，另一半繼續(xù)劃線于篩選培養(yǎng)基并使其傳代5次以上。隨后采用測(cè)量相對(duì)酶活的方法來評(píng)估其是否產(chǎn)酶，對(duì)能產(chǎn)生透明圈且酶活性較高的菌落進(jìn)行鑒定。

挑取復(fù)篩分離菌種的單菌落，無菌操作挑入盛有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，150 r/min，37 ℃震蕩培養(yǎng)48 h，隨后測(cè)定產(chǎn)酶活性。

1.5 產(chǎn)脂肪酶微生物的初篩、復(fù)篩及發(fā)酵

采用溴甲酚紫顯色培養(yǎng)基，根據(jù)菌種周圍出現(xiàn)黃色透明圈，以此判斷其為產(chǎn)脂肪酶菌種。吸取5 mL懸浮液，無菌接種到盛有45 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)24 h，隨后稀釋至10-4，各取0.2 mL涂布于溴甲酚紫顯色培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48～72 h。觀察菌落的生長(zhǎng)情況及有無透明圈，并記錄。

挑取初篩平板上透明圈明顯的菌株進(jìn)行復(fù)篩，劃線培養(yǎng)2～3次，觀察菌落生長(zhǎng)狀況，選取周圍仍有透明圈的菌種測(cè)定酶活力，對(duì)能產(chǎn)生透明圈且有較高酶活力的菌落標(biāo)號(hào)，并鑒定。

挑選復(fù)篩分離菌的單菌落至裝有5 mL種子培養(yǎng)基的試管中，編號(hào)，在上述1.4條件下培養(yǎng)18 h之后，取0.5 mL接于4.5 mL發(fā)酵培養(yǎng)基試管中，混合均勻并標(biāo)號(hào)，150 r/min，37 ℃，培養(yǎng)48 h后測(cè)定脂肪酶酶活。

1.6 酶活力的測(cè)定

1.6.1 羧甲基纖維素(CMC)酶活力的測(cè)定

CMC酶活力測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[12]：發(fā)酵酶液0.5 mL， 1%的CMC 0.5 mL為底物(40 ℃預(yù)熱10 min)，40 ℃保溫反應(yīng)30 min，加入3, 5二硝基水楊酸(DNS)3 mL，沸水浴5 min，冷卻后在540 nm下測(cè)定吸光值，取3個(gè)平行樣品(3支樣品管、1支空白管)OD值的平均值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]求出葡萄糖含量。1 h內(nèi)催化底物CMC-Na形成1 mg還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。公式：

其中，M：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出產(chǎn)生葡萄糖含量(mg)；N：酶液的稀釋倍數(shù);T：反應(yīng)時(shí)間。

1.6.2 濾紙酶活力的測(cè)定

取1 mL發(fā)酵酶液，分別加入pH值為4.8、0.1 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液1 mL，0.05 g濾紙，40 ℃預(yù)熱5 min后再保溫反應(yīng)1 h，之后加入DNS 3 mL，沸水浴10 min，流水冷卻后在540 nm下測(cè)定吸光值，同時(shí)滅活發(fā)酵液做空白對(duì)照；根據(jù)吸光值參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)的葡萄糖含量，按公式計(jì)算：

其中，X：濾紙酶酶活力，單位U/mL；W：葡萄糖的濃度；N：酶液稀釋總倍數(shù)；T：反應(yīng)時(shí)間；M：樣品的體積。

1.7 脂肪酶(LPS)活力測(cè)定

LPS活力方法按照LPS試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)說明書測(cè)定，以U/gprot表示酶活。具體操作如下：分光光度計(jì)于420 nm處，1 cm光徑玻璃比色皿，用Tris鹽酸緩沖液調(diào)零；將底物緩沖液37 ℃預(yù)溫5 min以上；在相應(yīng)編號(hào)的試管中加入50 μL待測(cè)發(fā)酵液，吸取已預(yù)溫好的底物緩沖液2 mL沖入試管中，快速混勻，并計(jì)時(shí)；迅速倒入比色皿中，在分光光度計(jì)420 nm處比濁，30 s時(shí)讀取吸光度值A(chǔ)1；將此比色液倒入原試管中置37 ℃準(zhǔn)確水浴10 min，再迅速倒入比色皿中，10 min 30 s時(shí)讀取吸光度值A(chǔ)2；求出2次吸光度差值(ΔA=A1-A2)。

標(biāo)準(zhǔn)管吸光值(As)：樣品緩沖液2 mL，生理鹽水50 μL，420 nm處比濁，讀取吸光值，此值相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)管濃度(454 μmol/L)的吸光值。

單位定義：在37 ℃條件下，每1 mL發(fā)酵液在本反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為一個(gè)酶活力單位。計(jì)算公式：

1.8 PCR擴(kuò)增及同源性分析

引物設(shè)計(jì)及測(cè)序工作均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。提取各菌株的基因組DNA，PCR擴(kuò)增其16S rDNA片段，切膠回收并純化PCR產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序得到各菌株的16S rDNA序列，在GenBank中作同源性檢索并利用MEGA4.0軟件分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.9 數(shù)據(jù)分析

酶活力測(cè)定結(jié)果取3個(gè)樣品重復(fù)的平均值，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)酶菌落的形態(tài)觀察

在篩選培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)了多個(gè)生長(zhǎng)良好的菌落，通過復(fù)篩，最終挑選了4種菌落形態(tài)不同且酶活力較高的菌株作為目的菌株，編號(hào)XIAN1，XIAN3，XIAN2，XIAN4；產(chǎn)脂肪酶挑選ZHI1作為目的菌株。XIAN1菌落邊緣薄中間厚，中間呈白色，不透明，形狀圓形或橢圓形，山丘狀(圖1A)；XIAN2的菌落因聚集剛果紅而呈現(xiàn)出紅色或淡紅色，菌落呈顆粒狀(圖1B)；XIAN3在剛果紅選擇培養(yǎng)基上并不明顯，菌落色澤略呈淡黃色(圖1C)；XIAN4菌落呈白色實(shí)心狀，圓形，表面光滑，油滴狀(圖1D)；ZHI1在溴甲酚紫培養(yǎng)基上略呈藍(lán)白色，菌落較小(圖1E)。

A～D. XIAN1、XIAN2、XIAN3、XIAN4的剛果紅培養(yǎng)基觀察；E. ZHI1的溴甲酚紫培養(yǎng)基觀察

2.2 菌株產(chǎn)酶活力

對(duì)篩選分離的產(chǎn)纖維素酶及產(chǎn)脂肪酶共5個(gè)菌株分別進(jìn)行了酶活力測(cè)定。結(jié)果如表1所示，篩選出的5種菌都具有較好的產(chǎn)酶能力。

表3 酶活力結(jié)果

2.3 菌株的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增其16S rDNA片段，得到大小1 100 bp左右的DNA片段，如圖2所示。

2.4 產(chǎn)酶菌株的測(cè)序及同源性比較

結(jié)果如圖3所示:XIAN1為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，XIAN2為大腸桿菌(Escherichiacoli)，XIAN3為吉氏庫(kù)特菌(Kurthiagibsonii)，XIAN4為克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，ZHI1為變棲克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)。

M. Marker; 1. XIAN1;2. XIAN2;3. XIAN3;4. XIAN4;5. ZHI1

注：比例尺表示該遺傳距離下序列之間的差異度為2%，黑色邊框?yàn)榉蛛x的產(chǎn)酶菌

3 討論

微生物在動(dòng)物生長(zhǎng)代謝的過程中扮演了十分重要的角色，不僅在調(diào)節(jié)宿主腸道微生物組成和能量攝入方面起著重要作用，其代謝產(chǎn)物還可以調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)代謝平衡、改善宿主腸道內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)水平以及增強(qiáng)腸上皮屏障功能[14-15]。親鴿將嗉囊內(nèi)的鴿乳飼喂給幼鴿的過程中將相關(guān)微生物傳遞給幼鴿，從而有助于幼鴿腸道微生物的建立[3]。人類嬰幼兒腸道微生物的建立得益于母乳中的益生元，而 Shetty 等[16]檢測(cè)到了在第7天的鴿乳中亦存在一類潛在的益生元，并通過試驗(yàn)證實(shí)其可使雞盲腸乳酸菌群發(fā)生變化，此外，IgA、IgG等免疫球蛋白廣泛存在于鴿乳中，由此可以推測(cè)，幼鴿是通過攝入鴿乳建立與調(diào)節(jié)體內(nèi)的微生物種群及提高免疫能力。

鴿乳是由哺育期親鴿的嗉囊上皮細(xì)胞脫落所形成的乳酪狀物質(zhì)，并以4 h為周期不斷往復(fù)形成，隨著雛鴿的發(fā)育，鴿乳外觀及營(yíng)養(yǎng)成分比例會(huì)出現(xiàn)較大變化。本試驗(yàn)篩選分離的產(chǎn)纖維素酶菌種，酶活力相對(duì)較低。作者認(rèn)為這是由于早期鴿乳成分主要為蛋白質(zhì)和脂肪，以及碳水化合物含量很低的原因，而哺育期后期，其比例逐漸增加[9]，產(chǎn)纖維素酶微生物種類和酶活力可能出現(xiàn)不同，這有待于后續(xù)進(jìn)一步研究。而哺育期前期因脂肪含量較高，所以產(chǎn)脂肪酶分離菌的酶活力相對(duì)較高。

本試驗(yàn)分離出的XIAN1、XIAN4、XIAN2均為條件致病菌[17]。XIAN1為銅綠假單胞菌，革蘭陰性好氧菌，主要通過種蛋污染、皮膚劃傷、呼吸道及消化道途徑感染宿主，并在一定條件下使其發(fā)病[18]，如羊群的化膿性肺炎、雞的敗血癥等，死亡率在1%～90%以上[19]；XIAN4為肺炎克雷伯氏菌，革蘭陰性桿菌，兼性厭氧，主要通過消化道傳播，可引起哺乳動(dòng)物肺炎、子宮炎、腹瀉等疾病[20]；XIAN2為大腸桿菌，是一種自然界常見的腸道寄居菌，在特定條件下可誘發(fā)多種動(dòng)物的腸道感染，尤其雞、豬對(duì)此最為敏感[21]，可通過糞便途徑傳播。21世紀(jì)以來，隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模的日益擴(kuò)大，由條件致病菌引起的疾病有愈發(fā)嚴(yán)重的趨勢(shì)，尤其是幼年動(dòng)物，由于其免疫抵抗能力較弱，更容易感染此類菌，因此，在養(yǎng)殖過程中要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，及時(shí)清掃糞便，加強(qiáng)對(duì)環(huán)境的消毒，保持圈舍清潔衛(wèi)生，采用優(yōu)質(zhì)飼料，保證飼料安全衛(wèi)生等。

本試驗(yàn)篩選出的產(chǎn)酶菌多為條件致病菌，但在樣品來源地實(shí)際生產(chǎn)中尚未發(fā)現(xiàn)疾病案例。上述產(chǎn)酶菌可能通過酶解底物為自身生存提供必要的能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也促進(jìn)了宿主的消化吸收能力。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)纖維素酶分離菌的報(bào)道以芽孢桿菌居多，如朱亞靜[22]、張慶芳等[23]分別從鵝腸道及牛瘤胃中分離出高產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌；韓生義等[24]從牦牛瘤胃中分離出高產(chǎn)脂肪酶的沙雷氏菌，同樣為條件致病菌。此外已有研究發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯氏菌能夠產(chǎn)菊粉酶、果膠酶、普魯蘭酶等[25-27]，可見該菌產(chǎn)酶種類具有多樣性，而變棲克雷伯氏菌除具有脂肪酶活性之外還具備固氮酶活性[28]，雖同屬于克雷伯氏菌,但其產(chǎn)酶種類并不完全相同，不同亞種之間基因序列的差異可能是導(dǎo)致這種變化的原因。吉氏庫(kù)特氏菌具有產(chǎn)纖維素酶能力則為本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)。此外，本試驗(yàn)測(cè)序過程中發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、變棲克雷伯氏菌具有多個(gè)突變位點(diǎn)，其產(chǎn)酶能力可能由此致使。

綜上，本次試驗(yàn)中所分離出4種產(chǎn)纖維素酶和1種產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌，其中銅綠假單胞菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、變棲克雷伯氏菌均為條件致性病菌，對(duì)乳鴿的生長(zhǎng)發(fā)育是否有益及其具體作用還有待于進(jìn)一步研究，本試驗(yàn)研究將為鴿子腸道微生物種類以及產(chǎn)酶微生物的研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。