Ⅰ群禽腺病毒套式PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

楊晶晶，金紅巖

(西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，西藏 拉薩 850000)

我國(guó)學(xué)者對(duì)于FAdV-Ⅰ的診斷方法己經(jīng)開展了部分研究，羅洋洋等[6]、劉琳等[7]均建立了血清4型FAdV-ⅠTaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法；朱余軍等[8]建立了FAdV-Ⅰ液相基因芯片檢測(cè)方法；袁萬(wàn)哲等[9]建立了血清4型FAdV-Ⅰ PCR檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了FAdV-Ⅰ感染的臨床準(zhǔn)確診斷。熒光定量PCR方法和液相基因芯片方法的敏感性非常高，但二者需要昂貴的儀器和試劑，對(duì)操作人員技術(shù)水平要求較高，不適合基層實(shí)驗(yàn)室使用；常規(guī)PCR方法不需要昂貴的儀器，檢測(cè)成本低，對(duì)操作人員技術(shù)水平要求不高，但常規(guī)PCR方法的敏感性有限。套式PCR方法是在常規(guī)的PCR方法基礎(chǔ)上增加1對(duì)檢測(cè)引物，通過(guò)2輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)，大大提高PCR擴(kuò)增的敏感性，其敏感性可與熒光定量PCR方法相當(dāng)，特別適合于基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室使用，對(duì)處于潛伏期感染的病毒和早期感染的病毒具有很好的檢出率，適用于疾病的早期診斷[10-11]。有研究表明，我國(guó)FAdV-Ⅰ的流行病毒株主要有血清4型、8a型、8b型、10型和11型[12-14]，因此有必要建立一種針對(duì)FAdV-Ⅰ眾多流行血清型的通用檢測(cè)方法。鑒于此，本研究在常規(guī)PCR方法的基礎(chǔ)上，增加1對(duì)檢測(cè)引物，通過(guò)套式PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立FAdV-Ⅰ套式PCR檢測(cè)方法，并將其應(yīng)用于臨床樣品檢測(cè)，以期為FAdV-Ⅰ的檢測(cè)提供一種通用、簡(jiǎn)單、敏感的方法。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞與病料來(lái)源

血清4型FAdV-Ⅰ(病毒含量TCID50為107.0/0.1 mL)、減蛋綜合征病毒病毒(EDSV)、雞痘病毒(APV)、馬立克病病毒(MDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、鴨瘟病毒(DEV)、H9亞型禽流感病毒(AIV-H9)、新城疫病毒(NDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)和雞肝癌細(xì)胞(LMH)均由西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院保存；91份臨床病料樣品分別于2017—2020年采集于西藏周邊養(yǎng)殖場(chǎng)病死雞、鴨臨床病料。

1.2 主要試劑

2×TaqMaster Mix、DL2000 DNA Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；病毒基因組RNA/DNA提取試劑盒為AXYGEN公司產(chǎn)品。

1.3 套式PCR引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上FAdV-Ⅰ不同血清型Hexon基因序列，利用生物學(xué)軟件Oigo6.0選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)內(nèi)、外2對(duì)特異性檢測(cè)引物(引物信息詳見表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 病毒基因組DNA的提取

利用病毒基因組提取試劑盒提取病毒基因組DNA。

1.5 外引物單重PCR的擴(kuò)增及檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系為：2×TaqMaster Mix 12.5 μL、核酸DNA(濃度為56 ng/μL)5 μL、外引物F1、R1(濃度為20 μmol/L)各0.5 μL、水6.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳觀察結(jié)果。

1.6 內(nèi)引物單重PCR的擴(kuò)增及檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系為：2×TaqMaster Mix 12.5 μL、核酸DNA(濃度為56 ng/μL)5 μL、內(nèi)引物F2、R2(濃度為20 μmol/L)各0.5 μL、水6.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳觀察結(jié)果。

對(duì)于250 MW的發(fā)電電動(dòng)機(jī)，槽電流最好控制在4 000～6 000 A左右，因此，最優(yōu)的支路數(shù)為4，此時(shí)槽電流為5 091 A。

1.7 套式PCR方法的建立

1.7.1 套式PCR的預(yù)設(shè)反應(yīng)條件

利用外引物對(duì)FAdV-ⅠDNA進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：2×TaqMaster Mix 12.5 μL、核酸DNA(濃度為56 ng/μL) 5 μL、外引物F1、R1(濃度為20 μmol/L)各0.5 μL、水6.5 μL；PCR反應(yīng)程序預(yù)設(shè)為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)。取第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL為模板，利用內(nèi)引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：2×TaqMaster Mix 12.5 μL、第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL、內(nèi)引物F1、R1(濃度為20 μmol/L)各0.5 μL、水10.5 μL；PCR反應(yīng)程序預(yù)設(shè)為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)。

1.7.2 套式PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

在相同的擴(kuò)增條件下，分別改變不同退火溫度(52、54、56、58和60 ℃)、不同模板DNA濃度(224、112、56、28和14 ng/μL)、不同引物濃度(80、40、20、10和5 μmol/L)，確定最佳退火溫度、最佳模板用量及最佳引物添加量。

1.8 特異性試驗(yàn)

分別提取FAdV-Ⅰ、EDSV、APV、MDV、ILTV、DEV、AIV-H9、NDV、IBV的核酸，利用優(yōu)化確定的最佳PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，確定套式PCR方法的特異性。

1.9 敏感性試驗(yàn)

利用滅菌水將FAdV-Ⅰ(病毒含量TCID50為107.0/0.1 mL)進(jìn)行10倍梯度系列稀釋，分別提取各稀釋度的病毒基因組DNA，按照最優(yōu)確定的套式PCR反應(yīng)條件分別對(duì)各稀釋度的病毒基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，確定套式PCR方法的敏感性。

1.10 重復(fù)性試驗(yàn)

批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：提取3個(gè)不同濃度(105.0TCID50、103.0TCID50、101.0TCID50)的FAdV-Ⅰ基因組DNA，按照最優(yōu)套式PCR反應(yīng)條件依次進(jìn)行檢測(cè)，每份樣品平行做3個(gè)重復(fù)，確定套式PCR方法的批內(nèi)重復(fù)性。

批間重復(fù)性試驗(yàn)：提取3個(gè)不同濃度(105.0TCID50、103.0TCID50、101.0TCID50)的FAdV-Ⅰ基因組DNA，按照最優(yōu)套式PCR反應(yīng)條件于3個(gè)不同時(shí)間分別進(jìn)行檢測(cè)，確定套式PCR方法的批間重復(fù)性。

1.11 符合性試驗(yàn)

FAdV-Ⅰ的分離鑒定方法：將采集的病死雞肝臟組織溶解于10倍體積滅菌PBS(pH=7.2)中，經(jīng)研磨、反復(fù)凍融3次后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾除菌后接種至長(zhǎng)成單層的LMH細(xì)胞，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至24～36 h，當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞變圓、聚集成不規(guī)則葡萄串狀等典型細(xì)胞病變時(shí)判為病毒分離鑒定結(jié)果為陽(yáng)性。利用套式PCR方法和病毒分離鑒定方法分別對(duì)22份臨床病料樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較分析2種檢測(cè)方法的陽(yáng)性樣品數(shù)和陰性樣品數(shù)，計(jì)算2種檢測(cè)方法的符合率，確定套式PCR方法的準(zhǔn)確性。

符合率=(2種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果相同樣品數(shù)/樣品總數(shù))×100%。

1.12 臨床應(yīng)用

利用建立的套式PCR檢測(cè)方法對(duì)2017—2020年采集的西藏部分養(yǎng)殖場(chǎng)疑似FAdV-感染的臨床病死雞、鴨病料樣品91份進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物全部送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，對(duì)測(cè)序結(jié)果通過(guò)Blast進(jìn)行在線比對(duì)分析，序列比對(duì)分析結(jié)果可以鑒定出陽(yáng)性樣品的血清型，評(píng)估套式PCR方法對(duì)檢測(cè)FAdV-Ⅰ的通用性，確定套式PCR方法的臨床適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR的擴(kuò)增

外引物對(duì)FAdV-Ⅰ可擴(kuò)增出約592 bp的特異性條帶(圖1A)，內(nèi)引物對(duì)FAdV-Ⅰ可擴(kuò)增出約356 bp的特異性條帶(圖1B)，利用套式PCR預(yù)設(shè)反應(yīng)條件對(duì)FAdV-Ⅰ可擴(kuò)增出約356 bp的特異性條帶(圖1C)，條帶大小均與試驗(yàn)預(yù)期相符。

M. DL2000 DNA Marker；1. FAdV-Ⅰ；2. 陰性對(duì)照

2.2 套式PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

在相同的反應(yīng)條件下，確定套式PCR方法第一輪的最佳退火溫度為56 ℃(圖2)，最佳模板DNA濃度為56 ng/μL(圖3)，上、下游引物最佳濃度為20 μmol/L(圖4)。確定套式PCR方法第二輪的最佳退火溫度為56 ℃(圖5)，上、下游引物最佳濃度為20 μmol/L(圖6)。

2.3 特異性試驗(yàn)

如圖7所示，利用建立的套式PCR檢測(cè)方法分別對(duì)FAdV-Ⅰ、EDSV、APV、MDV、ILTV、DEV、AIV-H9、NDV、IBV進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果只有FAdV-Ⅰ擴(kuò)增出356 bp的特異性條帶，與預(yù)期相符，而EDSV、APV、MDV、ILTV、DEV、AIV-H9、NDV、IBV擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，說(shuō)明套式PCR方法具有良好的特異性。

2.4 敏感性試驗(yàn)

如圖8所示，10-1～10-6倍梯度稀釋的FAdV-Ⅰ(病毒含量TCID50為107.0/0.1 mL)經(jīng)外引物單重PCR、內(nèi)引物單重PCR、套式PCR擴(kuò)增后，外引物單重PCR和內(nèi)引物單重PCR的檢測(cè)下限均為104.0TCID50，套式PCR的檢測(cè)下限為102.0TCID50，套式PCR方法比外引物單重PCR方法和內(nèi)引物單重PCR方法的敏感性均高出100倍，說(shuō)明套式PCR方法敏感性更強(qiáng)。

M. DL2000 DNA Marker；1～5. 退火溫度分別為52、54、56、58和60 ℃

M. DL2000 DNA Marker；1～5. 模板濃度分別為224，112，56，28和14 ng/μL

M. DL2000 DNA Marker；1～5. 引物添加量分別為80，40，20，10和5 μmol/L

M. DL2000 DNA Marker；1～5. 退火溫度分別為52、54、56、58和60 ℃

M. DL2000 Marker；1～5. 引物添加量分別為80，40，20，10和5 μmol/L

M. DL2000 DNA Marker；1. FAdV-Ⅰ；2. EDSV；3. APV；4. MDV；5. ILTV；6. DEV；7. AIV-H9；8. NDV；9. IBV

M. DL2000 DNA Marker；1. 106.0 TCID50；2. 105.0 TCID50；3. 104.0 TCID50；4. 103.0 TCID50；5. 102.0 TCID50；6. 101.0 TCID50

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

如圖9所示，批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)中FAdV-Ⅰ3個(gè)不同濃度(105.0TCID50、103.0TCID50、101.0TCID50)3個(gè)重復(fù)的檢測(cè)結(jié)果完全一致，批間重復(fù)性試驗(yàn)中FAdV-Ⅰ3個(gè)不同濃度(105.0TCID50、103.0TCID50、101.0TCID50)于3個(gè)不同時(shí)間檢測(cè)的結(jié)果完全一致，表明套式PCR方法具有良好的可重復(fù)性。

M. DL2000 DNA Marker；1～3. 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)中105.0 TCID50 FAdV-Ⅰ的3個(gè)重復(fù)；4～6. 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)中103.0 TCID50 FAdV-Ⅰ的3個(gè)重復(fù)；7～9. 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)中101.0 TCID50 FAdV-Ⅰ的3個(gè)重復(fù)；10～12. 批間重復(fù)性試驗(yàn)中105.0 TCID50、103.0 TCID50、101.0 TCID50 FAdV-Ⅰ的第1次檢測(cè)；13～15. 批間重復(fù)性試驗(yàn)中105.0 TCID50、103.0 TCID50、101.0 TCID50 FAdV-Ⅰ的第2次檢測(cè)；16～18. 批間重復(fù)性試驗(yàn)中105.0 TCID50、103.0 TCID50、101.0 TCID50 FAdV-Ⅰ的第3次檢測(cè)

2.6 符合性試驗(yàn)

22份臨床病料樣品經(jīng)套式PCR方法和病毒分離鑒定方法檢測(cè)的結(jié)果如表2所示，套式PCR方法共檢測(cè)出陽(yáng)性樣品14份，而病毒分離鑒定方法共分離鑒定出病毒12株，套式PCR方法相對(duì)于病毒分離鑒定方法的符合率達(dá)90.91%(20/22)。將2份病毒分離鑒定為陰性，而套式PCR方法檢測(cè)為陽(yáng)性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明2份陽(yáng)性樣品均為FAdV-4特異性核苷酸序列，說(shuō)明套式PCR方法的敏感性高于病毒分離鑒定方法，套式PCR方法具有良好的準(zhǔn)確性。

表2 符合性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

2.7 臨床應(yīng)用

利用建立的套式PCR檢測(cè)方法對(duì)2017—2020年采集的西藏部分養(yǎng)殖場(chǎng)疑似FAdV-Ⅰ感染的臨床病死雞、鴨病料樣品91份進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表3所示，共檢測(cè)出陽(yáng)性樣品58份，陽(yáng)性感染率達(dá)63.74%。58份陽(yáng)性樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定比對(duì)分析結(jié)果表明：臨床表現(xiàn)為心包積液的28份陽(yáng)性雞病料樣品均為血清4型；臨床表現(xiàn)為肝臟腫大、易碎的21份陽(yáng)性雞病料樣品中有5份為血清4型，8份為血清8a型，6份為血清8b型，2份為血清11型；臨床表現(xiàn)為肌胃糜爛的6份陽(yáng)性雞病料樣品中有2份為血清4型，1份為血清8b型，3份為血清11型；臨床表現(xiàn)為肝臟腫大、易碎的3份陽(yáng)性鴨病料樣品均為血清4型。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，我國(guó)現(xiàn)階段流行的FAdV-Ⅰ主要有血清4型、8a型、8b型和11型。

表3 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討論

FAdV-Ⅰ近幾年呈逐漸流行趨勢(shì)，由于FAdV-Ⅰ血清學(xué)型眾多，不同血清型引起的臨床癥狀差異較大，尤其是引起的包涵體肝炎、肌胃糜爛等臨床癥狀與禽白血病、戊型肝炎等疫病感染極其相似，臨床中通過(guò)臨床癥狀和病理剖檢很難進(jìn)行FAdV-Ⅰ感染的確診，鑒別診斷需要借助實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法進(jìn)行，目前FAdV-Ⅰ實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要有病毒分離鑒定、免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法[15]。病毒分離是最可靠的檢測(cè)方法，但病毒分離的周期較長(zhǎng)，不適合臨床快速診斷的需要。免疫學(xué)檢測(cè)方法具有一定的滯后性，無(wú)法檢測(cè)出早期感染的病毒。分子生物學(xué)檢測(cè)方法能夠特異性檢測(cè)FAdV-Ⅰ的核酸DNA，在疫病早期快速診斷方面具有病毒分離鑒定和免疫學(xué)方法無(wú)法比擬的優(yōu)越性，而套式PCR方法作為分子生物學(xué)中一種變異的PCR檢測(cè)方法，其使用2對(duì)PCR引物擴(kuò)增基因片段，第1對(duì)PCR引物擴(kuò)增和普通PCR方法相似，而第2對(duì)引物設(shè)計(jì)在第1次PCR擴(kuò)增片段的內(nèi)部，其對(duì)第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行又一輪擴(kuò)增，第2對(duì)引物的第2次擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)在于，如果第1次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第2次擴(kuò)增能在錯(cuò)誤片段中進(jìn)行引物配對(duì)的概率很低，因而降低錯(cuò)誤發(fā)生率，且經(jīng)過(guò)2次擴(kuò)增可大大提高擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏度，故套式PCR相對(duì)于常規(guī)PCR方法的敏感性和特異性均大大提高。禽腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白主要包括六鄰體蛋白(Hexon)、五鄰體蛋白(Penton)和纖維蛋白(Fiber)，其中Hexon蛋白含有中和抗原決定簇，可以誘導(dǎo)極強(qiáng)的中和反應(yīng)，且FAdV-Ⅰ的12個(gè)血清型中Hexon基因具有較高的保守性[16-17]，因此本研究將套式PCR擴(kuò)增的靶基因選擇在Hexon基因的保守區(qū)段上，通過(guò)對(duì)GenBank登錄的FAdV-Ⅰ不同基因型的Hexon基因進(jìn)行比對(duì)分析，選擇12個(gè)血清型FAdV-Ⅰ Hexon基因均高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)內(nèi)、外2對(duì)特異性檢測(cè)引物，通過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了FAdV-Ⅰ套式PCR檢測(cè)方法，其推廣應(yīng)用將大大提高了基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的FAdV-Ⅰ病原學(xué)檢測(cè)能力和技術(shù)水平。

FAdV-Ⅰ可以水平傳播，病毒廣泛存在于雞的糞便、氣管及鼻黏膜和腎臟中，病毒通過(guò)雞的各種分泌物和排泄物傳播，在糞便中有很高的病毒滴度，健康雞群通過(guò)接觸帶毒的糞便感染，在短時(shí)間內(nèi)就可以通過(guò)空氣傳播病毒，導(dǎo)致在整個(gè)雞群發(fā)生持續(xù)擴(kuò)散傳播；FAdV-Ⅰ也可以垂直傳播，在公雞的精液中也存在病毒，人工授精也可以將病毒擴(kuò)散，蛋雞在產(chǎn)蛋高峰期受到應(yīng)激和性激素的影響可以出現(xiàn)排毒期，導(dǎo)致種蛋將病毒傳播給下一代[18-19]。禽腺病毒感染一般在21 d后開始排毒，在感染的雞群中，有時(shí)可以分離到多個(gè)血清型的病毒[18-19]。鑒于FAdV-Ⅰ對(duì)雞群的綜合危害性較強(qiáng)，防控難度較大，加強(qiáng)FAdV-Ⅰ的病原學(xué)監(jiān)測(cè)和提高檢測(cè)方法的敏感性對(duì)本病的防控尤為重要。本研究建立的FAdV-Ⅰ套式PCR檢測(cè)方法能夠特異性擴(kuò)增FADV-Ⅰ，而檢測(cè)EDSV、APV、MDV、ILTV、DEV、AIV-H9、NDV、IBV均為陰性；該方法的檢測(cè)下限為102.0TCID50，其靈敏度是普通PCR方法的100倍；該方法在22份臨床病料樣品中，其相對(duì)于病毒分離鑒定方法的符合率達(dá)90.91%，而病毒分離鑒定為陰性的2份臨床病料樣品經(jīng)套式PCR方法檢測(cè)為陽(yáng)性，分析其原因可能為病毒分離鑒定方法受到細(xì)胞培養(yǎng)條件、病料中病毒含量、病料存儲(chǔ)和運(yùn)輸時(shí)間等外界因素的影響，其成功分離鑒定率降低，導(dǎo)致沒(méi)有成功分離到病毒，而套式PCR方法具有較高的敏感性，檢測(cè)到了2份病料中的核酸DNA；該方法在檢測(cè)91份臨床病料樣品中共檢測(cè)出血清4型、8a型、8b型和11型陽(yáng)性樣品分別為38份、8份、7份和5份，表現(xiàn)出了良好的特異性、敏感性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性，能夠用于FAdV-Ⅰ多種血清型的臨床診斷，將為FAdV-Ⅰ的臨床診斷、流行病學(xué)監(jiān)測(cè)、疫病防控和凈化提供技術(shù)支持。