16S rRNA測序揭示豬日增重與腸道微生物的關(guān)系

呂冬玲，司景磊，莫家遠(yuǎn)，李月月，田威龍，劉笑笑，梁晶,蘭干球

(廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004)

杜洛克豬原產(chǎn)于美國，因其瘦肉率高、生長速度快和飼料轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)勢，通常作為父本用來進(jìn)行品種間的雜交和選育。平均日增重(ADG)是豬在某段時間內(nèi)平均每日增加的重量，是衡量豬生長性狀的一個重要指標(biāo)。日增重高的豬能在更短的時間內(nèi)達(dá)到目標(biāo)市場體重，節(jié)省出欄時間，因此提高豬的日增重是豬場的育種目標(biāo)之一。近年來，腸道微生物的研究不斷發(fā)展，有研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物在營養(yǎng)加工和能量的獲取中起著至關(guān)重要的作用[1-2]。在單胃動物腸道中主要有3種微生物，分別是細(xì)菌、古菌和真核微生物，其中細(xì)菌是腸道中的優(yōu)勢微生物，尤其是厭氧細(xì)菌[3-4]。研究認(rèn)為在豬生長的關(guān)鍵階段，腸道微生物與其健康和生產(chǎn)性能具有很大關(guān)系[5-9]。HAN等[10]研究發(fā)現(xiàn)飼料效率較高的豬盲腸乳酸菌數(shù)量較飼料效率低的更多；Mach等[11]研究表明普氏菌與體重呈正相關(guān)，不同體重的豬，其腸道微生物在一定程度上有差異，例如，在門的水平上，厚壁菌和浮霉菌在體重較大的豬中富集，而擬桿菌富集在體重較小的豬中[12]。

目前對于杜洛克的腸道微生物與其日增重關(guān)系的研究報(bào)道較少，本試驗(yàn)利用高通量測序技術(shù)通過分析不同日增重杜洛克豬糞便微生物的多樣性，從而分析其腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)差異及其與日增重的關(guān)系，以期為利用微生物菌群提高豬日增重、縮短出欄時間從而提高養(yǎng)殖效率提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物和飼養(yǎng)管理

91頭杜洛克公豬來自廣西南寧某核心育種場，28日齡斷奶，于相同的保育條件飼養(yǎng)至70日齡，平均體重(27.61±4.65)kg，隨即進(jìn)入安裝有美國奧斯本自動喂料系統(tǒng)的測定站中進(jìn)行性能測定，每個測定站面積為20 m2，飼喂10～12頭，公母分欄飼喂，正式測定前將有10 d左右的適應(yīng)期，在體重約100 kg時結(jié)束測定。育肥舍為全封閉的欄舍結(jié)構(gòu)，配有濕簾風(fēng)機(jī)自動控溫系統(tǒng)、全自動溫控通風(fēng)設(shè)備及半漏縫水泥地板設(shè)計(jì)。試驗(yàn)期間飼喂相同的標(biāo)準(zhǔn)日糧，日糧成分及配方見表1，期間不添加抗生素、益生菌或藥物等，自由飲水。

表1 日糧成分及配方

1.2 樣品的收集與分組

調(diào)取奧斯本飼喂系統(tǒng)所記錄杜洛克公豬測定期間的每日采食量及體重?cái)?shù)據(jù)，利用FIRE軟件統(tǒng)計(jì)豬在90～160日齡的平均日增重。根據(jù)91頭豬的平均日增重大小，取10頭日增重最高的豬作為HADG組，日增重區(qū)間1.10～1.18 kg，平均日增重(1.13±0.03) kg；10頭日增重最低的作為LADG組，日增重區(qū)間 0.72～0.89 kg，平均日增重(0.80±0.07)kg。肛拭子法采集糞便，放入滅菌試管，并迅速放于液氮速凍后轉(zhuǎn)至-80 ℃保存，用于后續(xù)分析。

1.3 糞便微生物的提取及16S rRNA測序

參考Fast DNA SPIN soil kit(MP Biomedicals,Santa Ana,CA,USA)說明書提取2組共20頭豬的糞便DNA，紫外分光光度計(jì)測定其濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。用細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)的引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAG CA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對以上提取的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，選用20 μL PCR體系，PCR反應(yīng)體系參考胡宗福等[13]方法，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后由Illumina Miseq平臺進(jìn)行高通量測序并用以下軟件進(jìn)行微生物分析(見表2)。

表2 微生物分析方法

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007和SPSS 20.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，顯著性分析采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 豬糞便中微生物alpha多樣性

以Sobs, Shannon, Simpson, Ace, Chao, Coverage和Pd指數(shù)作alpha多樣性的參數(shù)(表3)，Coverage指數(shù)反映測序?qū)ξ锓N的覆蓋度，2組糞便微生物的Coverage均大于0.99(HADG組0.995 4，LADG組0.995 1)，證明數(shù)據(jù)是可靠的。Chao指數(shù)和Ace指數(shù)可衡量物種的豐富度，Shannon和Simpson指數(shù)可衡量物種的多樣性。發(fā)現(xiàn)HADG組和LADG組中alpha多樣性差異不顯著(P>0.05)。

表3 HADG和LADG組糞便微生物alpha多樣性的差異

2.2 豬糞便微生物類群的差異

在97%相似性的水平上，在門水平共檢測到14個菌群(圖1A)，其中有12個門是LADG與HADG組共有，厚壁菌門(Firmicutes, LADG組69.37%，HADG組66.90%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，LADG組27.10%，HADG組30.64%)是2組的優(yōu)勢菌門，螺旋菌門(Spirochaetes)為LADG組獨(dú)有(圖1C)。在屬水平，共檢測到114個菌群，其中107個是LADG與HADG組共有，4個LADG組獨(dú)有，3個HADG組獨(dú)有(圖1B)，屬水平上2組的優(yōu)勢菌群分別是普氏菌屬(Prevotella,LADG組16.90%，HADG組25.28%)和乳酸菌屬(Lactobacillus,LADG組12.81%，HADG組16.94%)(圖1D)。

利用主坐標(biāo)分析分別比較了HADG和LADG組微生物菌群在門水平和屬水平上的相對豐度及其差異(圖2)，在門水平上，發(fā)現(xiàn)LADG組的螺旋體門(Spirochaetes), 軟壁菌門(Tenericutes), WPS-2以及疣微菌門(Verrucomicrobia)4個菌群的豐度要顯著高于HADG組(P<0.05)(圖2B)；在屬水平上發(fā)現(xiàn)HADG組中的巨球型菌(Megasphaere)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)和韋榮氏菌(unclassified_f_Veilionellacece)3個菌群的豐度顯著高于LADG組；瘤胃菌(norank_f_Ruminococcaceae)和擬桿菌(unclassified_o_Bacteroidales,norank_o_Bacteroidales)等在LADG組中富集度顯著高于HADG組(圖3B)。

A.門水平Venn圖；B.屬水平Venn圖；C.門水平的群落結(jié)構(gòu)；D.屬水平的群落結(jié)構(gòu)

A.門水平的PCoA圖；B.門水平的差異菌群。其中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，下同

2.3 糞便微生物的功能預(yù)測和KEGG通路比較

PICRUSt對OTUs的豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并獲得相應(yīng)的KEGG信息及相應(yīng)的豐度值，然后用STAMP軟件(version 2.1.3)進(jìn)行代謝通路差異分析，以Welch’s雙尾檢驗(yàn)預(yù)測功能通路的差異性，顯著性閾值為P<0.05。結(jié)果表明高低組間的4條通路有顯著性差異(P<0.05)，其中LADG組中細(xì)胞運(yùn)動和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的豐度顯著高于HADG組(P<0.05)；Poorly characterized通路極顯著地富集在HADG組中(P<0.01)，代謝疾病通路的豐度顯著高于LADG組(P<0.05)(圖4A)。KEGG的三級代謝通路預(yù)測發(fā)現(xiàn)了LADG和HADG 2組有24條顯著差異的三級通路，其中HADG組中的無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、Ⅱ型糖尿病通路的豐度極顯著高于LADG組，脂類生物合成蛋白通路豐度LADG組極顯著地高于HADG組(圖4B)。

3 討論

下一代測序技術(shù)拓寬了遺傳育種的研究領(lǐng)域[9]。Mach等[11]提出早期腸道微生物的豐度對宿主的性狀至關(guān)重要，同時也有助于種豬的早期選擇。從公式：選擇進(jìn)展=選擇差×選擇強(qiáng)度/世代間隔[14]，可以看出選擇強(qiáng)度和選擇差的提高及世代間隔的減小均可增加選擇進(jìn)展，尤其是對遺傳力較低的一些性狀。

本研究將杜洛克公豬分為LADG和HADG 2組，并對2組豬的糞便微生物群落進(jìn)行對比分析和功能預(yù)測。以Sobs, Shannon, Simpson, Ace, Chao, Coverage和Pd指數(shù)作alpha差異分析的參數(shù)，Coverage指數(shù)反映測序?qū)ξ锓N的覆蓋度，2組糞便微生物的Coverage均大于0.99，證實(shí)了數(shù)據(jù)的可靠性。Chao指數(shù)和Ace指數(shù)可衡量物種的豐富度，Shannon和Simpson指數(shù)可衡量物種的多樣性[15]。alpha差異分析顯示2組微生物的豐富度都很高，HADG組Chao指數(shù)和Ace指數(shù)2個指數(shù)比LADG組高但并不顯著，說明一定程度上HADG組物種有更高蛋白豐富度；HADG組的Shannon指數(shù)比LADG組高，Simpson指數(shù)比LADG組低，但差異不顯著，說明一定程度上HADG組的微生物群落多樣性更豐富。

前人研究發(fā)現(xiàn)不同豬不同生長階段的腸道微生物組成有差異，這可能與其生長狀態(tài)等有關(guān)系，仔豬在出生后0～2 d和7 d～斷奶前的腸道微生物組成從以好氧和兼性厭氧菌為主(主要為葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌屬)過渡到嚴(yán)格厭氧菌為優(yōu)勢菌群(主要為厚壁菌群和擬桿菌群)[16]；Wang等[17]研究了仔豬從出生(0日齡)到上市(174日齡)的糞便微生物結(jié)構(gòu)群落，表明厚壁菌門和擬桿菌門是豬從出生到上市的優(yōu)勢菌門；Mach等[11]研究表明普氏菌與體重呈正相關(guān)；Pajarillo等[18]發(fā)現(xiàn)在門水平杜洛克、長白和大白3個豬種的微生物結(jié)構(gòu)是相似的，主要以厚壁菌門和擬桿菌門為主。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門和擬桿菌門是門水平的2個優(yōu)勢菌群，這與Si等[19]的研究結(jié)果一致；螺旋體門、軟壁菌門，WPS-2以及疣微菌門這4個菌群在LADG 組的豐度要顯著高于 HADG 組，表明這4個菌群的群落結(jié)構(gòu)可能對豬的日增重有負(fù)相關(guān)作用；在屬水平上2組的優(yōu)勢菌群均是普氏菌(Prevotella)和乳酸菌(Lactobacillus)，這一結(jié)果與楊慧[20]的結(jié)果相一致；HADG組中的巨球型菌(Megasphaere)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)和韋榮氏菌(unclassified_f_Veilionellacece)這3個菌群的富集顯著高于LADG組，推測這4個菌群可能與日增重有正相關(guān)作用，可促進(jìn)杜洛克豬的生長和發(fā)育；還發(fā)現(xiàn)一些菌群在LADG組中富集度顯著高于HADG組，例如瘤胃菌(norank_f_Ruminococcaceae)和擬桿菌(unclassified_o_Bacteroidales,norank_o_Bacteroidales)等，初步推測瘤胃菌和擬桿菌群的富集對豬的日增重有負(fù)相關(guān)作用。

A.屬水平的PCoA圖；B.屬水平的差異菌群

A.二級代謝通路；B.三級代謝通路

豬不同日增重的差異可能還與微生物的代謝途經(jīng)有關(guān)，KEGG的二級通路分析發(fā)現(xiàn)HADG組的疾病代謝和Poorly characterized通路的富集要顯著高于LADG組，表明HADG組相較LADG組有更強(qiáng)的疾病代謝能力；KEGG的三級通路分析發(fā)現(xiàn)HADG組的無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、谷胱甘肽的代謝、氨基糖和核苷酸糖的代謝、核黃素代謝、嘌呤代謝和亞硒化合物的代謝通路的富集度顯著高于LADG組，提示HADG組的營養(yǎng)物質(zhì)的代謝水平更高。核黃素即VB2，是機(jī)體生長發(fā)育必不可少的一種維生素，可以促進(jìn)機(jī)體碳水化合物、核酸等物質(zhì)的代謝，增加機(jī)體的抗氧化能力的同時降低心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險等[21]；嘌呤是核酸的重要組成成分，對機(jī)體的新陳代謝也有重要意義，大多數(shù)動植物細(xì)胞尤其在動物內(nèi)臟器官中都含有大量的嘌呤，嘌呤的大量堆積可能會導(dǎo)致尿酸的沉積，進(jìn)而引發(fā)痛風(fēng)等嘌呤代謝障礙性疾病[22-23]。三級通路中脂肪酸的生物合成、分泌系統(tǒng)通路富集LADG組顯著高于HADG組，病原體入侵宿主細(xì)胞會對宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響[24]，細(xì)菌可以利用宿主的分泌系統(tǒng)來破壞宿主的一些功能，Rapisarda等[25]通過對比革蘭陽性和革蘭陰性細(xì)菌各自分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成，發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)與其自身的毒性有關(guān)。推測糞便微生物與宿主的相互作用可能與其分泌系統(tǒng)的功能也有一定相關(guān)。

4 結(jié)論

厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)是LADG和HADG組的優(yōu)勢菌門，普氏菌屬(Prevotella)和乳酸菌屬(Lactobacillus)是這2組的優(yōu)勢菌屬。2組微生物在代謝通路上有差異：微生物在疾病代謝尤其是嘌呤代謝和核黃素代謝等通路高度富集在HADG組中；而微生物的分泌系統(tǒng)等通路高度富集在LADG組中。提示HADG組的代謝水平更高，LADG組的分泌系統(tǒng)較HADG組更發(fā)達(dá)。這一結(jié)果為理解早期宿主與豬腸道微生物相互作用提供了幫助，對仔豬的早期選育提供了新的思路。