干擾FOXC1逆轉(zhuǎn)非小細胞肺癌吉非替尼耐藥的作用

彭聰 李盼 楊明強 陳丹揚 黃淵鋒

肺癌的發(fā)病率和死亡率均居我國惡性腫瘤首位[1]。肺癌依據(jù)其組織形態(tài)和臨床特征可分為小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），NSCLC占肺癌的80%左右[2]。表皮生長因子受體（epidermal growth factot receptor, EGFR）屬于跨膜受體酪氨酸激酶家族，是NSCLC最重要的驅(qū)動基因，靶向EGFR已經(jīng)成為NSCLC臨床治療的主要手段之一[3]。以吉非替尼（Gefitinib）為代表的EGFR小分子抑制劑已成功應(yīng)用于NSCLC患者的臨床治療，可顯著延長患者無進展生存期[4]。然而，大部分接受治療的患者在治療9個月-12個月后不可避免會出現(xiàn)程度不同的治療耐受，使得NSCLC總生存率難以獲得明顯提高[5]。因此，探索EGFRTKIs耐藥機制、尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的途徑成為了亟待解決的問題。

叉頭框蛋白C1（forkhead box protein C1, FOXC1）是叉頭框蛋白家族重要成員，參與正常的胚胎發(fā)育[6]。研究[7,8]表明FOXC1在多種腫瘤中異常表達，在腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)FOXC1在NSCLC高表達，且與患者的預(yù)后不良密切相關(guān)[9]，敲除FOXC1能夠抑制NSCLC的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。然而，迄今對于FOXC1在NSCLC EGFR-TKI靶向治療耐藥中的作用及機制尚不明確。本研究擬探討FOXC1促進NSCLC吉非替尼耐藥的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、Trizol試劑（Thermo Fisher公司）； FOXC1、SOX2、Nanog、β-actin抗體以及HRP標記山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG（CST公司）；Annexin-APC細胞凋亡檢測試劑盒（聯(lián)科生物公司）；RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)公司）；ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒（Pierce公司）；Quick Start Bradford蛋白定量試劑（Bio-Rad公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR（PrimeScript RT-PCR）試劑盒（TaKaRa公司）；PCR引物（上海生工公司）；Gefitinib、嘌呤霉素（Sigma公司），其余試劑均為國產(chǎn)分析純以上。

1.2 細胞培養(yǎng) 人NSCLC吉非替尼敏感細胞株HCC827及其吉非替尼耐藥細胞株HCC827/GR均由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院研究所保藏。采用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素），于37oC、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)飽和濕度培養(yǎng)。

1.3 FOXC1穩(wěn)定干擾細胞系和過表達細胞系的篩選FOXC1 shRNA干擾質(zhì)粒購自吉凱基因，F(xiàn)OXC1 shRNA干擾質(zhì)粒及對照質(zhì)粒的靶向序列分別為：shFOXC2-1：5'-CCAGTGCAGCATGCGAGCGAT-3'；shFOXC2-2：5'-CCAGTGCAGCATGCGAGCGAT-3'；shControl：5'-AGAACATCATGACCCTGCGAA-3'。pCMV-FOXC1過表達質(zhì)粒購自O(shè)rigene公司。取對數(shù)生長期的細胞，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，37oC、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將相應(yīng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞中。培養(yǎng)48 h后，采用嘌呤霉素分別篩選穩(wěn)定干擾FOXC1和穩(wěn)定過表達FOXC1的細胞株。

1.4 新型四氮唑鹽比色法檢測（Methyl-thiazolyldiphenylsulfophenyl-tetrazolium bromide assay, MTS）實驗 取對數(shù)生長期的HCC827及HCC827/GR細胞，胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，以1×104個/mL接種細胞到96孔板中培養(yǎng)過夜。向?qū)?yīng)試驗孔中加入不同濃度的吉非替尼，培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL MTS溶液（Promega公司），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。采用酶標儀測定490 nm波長下的光密度（optical density, OD）值。每組濃度設(shè)立3個復(fù)孔， 獨立重復(fù)實驗3次。

1.5 細胞凋亡檢測 以3×105個/孔接種HCC827及HCC827/GR細胞至6孔板，培養(yǎng)過夜，加入吉非替尼處理細胞48 h。收集細胞，按照Annexin V-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒（聯(lián)科生物公司）的說明書，先后加入Annexin V-APC和7-AAD，避光、室溫孵育10 min后，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.6 實時熒光定量PCR 利用Trizol試劑提取細胞總RNA，按Primescript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，Real-time PCR反應(yīng)體系及條件參照 SYBR Premix Ex TapTM試劑盒（TaKaRa），2–△△CT法計算mRNA的相對表達量，以GAPDH作為內(nèi)參。每個實驗組重復(fù)3次。SOX2上游引物序列：5'-CCCACCTACAGCATGTCCTACTC-3'，下游引物序列：5'-TGGAGTGGGAGGAAGAGGTAA-3'；Nanog上游引物序列：5'-ヰCCCTCCTCCATGGATCTG-3'，下游引物序列：5'-TGTTTCTTGACTGGGACCTTGTC-3'；OCT4上游引物序列：5'-TTCAGCCAAACGACCATCTG-3'，下游引物序列：5'-CACGAGGGTTTCTGCTTTGC-3'；CD133上游引物序列：5'-TTACGGC-ACTCTTCACCT-3'，下游引物序列：5'-TATTCCACAA-GCAGCAAA-3'；GAPDH上游引物序列：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物序列：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。

1.7 Western blot PBS洗滌細胞2次，加入RIPA裂解液冰上放置30 min，收集裂解液，4oC 12,000 rpm離心20 min，取上清，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。等量蛋白質(zhì)樣品經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗FOXC1（1:1,000稀釋），SOX2（1:1,000稀釋），Nanog（1:1,000稀釋）和β-actin（1:1,000稀釋），4oC孵育過夜；PBST洗滌3次，每次10 min，加入HRP標記的特異性二抗（1:5,000稀釋），室溫孵育1 h；PBST洗滌3次，每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光檢測顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.8 微球體形成實驗 配制微球體培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)基（含20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF及10 μL/mL B27），取對數(shù)生長期的細胞，胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，以1×103/mL細胞接種至低粘附的6孔板，每孔2,000個細胞，放37oC、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4天加適量的培養(yǎng)基，2周后觀察拍照，計算微球體形成的個數(shù)。

1.9 免疫組化實驗 選取2016年1月-2018年12月我院收治的EGFR基因突變NSCLC并采用EGFR-TKIs藥物作為一線治療的耐藥患者15例，并選取同期于我院治療的非耐藥患者15例為對照組。

病理組織切片經(jīng)脫蠟和水化處理，采用0.3%過氧化氫阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性，用0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液進行高壓修復(fù)。山羊血清室溫下封閉1 h，加入FOXC1抗體4oC孵育過夜；PBS洗滌3次，二抗室溫孵育30 min，PBS洗滌3次；DAB顯色、蘇木素復(fù)染之后，脫水封片。按半定量積分方法，每例均隨機觀察5個高倍視野（×400），相差顯微鏡下評估FOXC1的表達。按陽性細胞比例計分：≤25%為1分，26%-50%為1分，51%-75%為2分，≥76%為3分；按照染色強度分別計0分-3分；兩者乘積為FOXC1免疫組化得分：0分-2分為陰性，3分-5分為陽性，6分-9分為強陽性。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，采用GraphPad Prism 7.0軟件進行分析，組間差異比較采用t檢驗分析。采用Pearson r檢驗分析基因表達的相關(guān)性。P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 FOXC1在HCC827/GR細胞和耐藥組織中高表達 首先，采用MTS實驗對人NSCLC細胞的耐藥性進行分析，結(jié)果如圖1A所示，相比HCC827敏感細胞，吉非替尼對耐藥細胞HCC827/GR的增殖抑制作用明顯減弱（P<0.05）。采用Western blot檢測FOXC1在吉非替尼耐藥細胞HCC827/GR中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXC1在HCC827/GR細胞中的表達水平顯著高于其在HCC827細胞中的表達水平（P<0.05，圖1B）。免疫組化檢測FOXC1在NSCLC吉非替尼耐藥組織和敏感組織中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXC1在吉非替尼耐藥組織中的表達高于敏感組織（圖1C，圖1D），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.042,3）。

圖 1 FOXC1在吉非替尼耐藥細胞和組織中高表達。A：MTS實驗檢測HCC827/GR細胞的增殖能力（*P<0.05）；B：Western blot檢測FOXC1在HCC827/GR細胞的表達情況；C：免疫組化檢測FOXC1在NSCLC吉非替尼耐藥組織中的表達情況；D：箱線圖分析FOXC1在NSCLC耐藥組織表達的得分情況。Fig 1 FOXC1 is over-expressed in HCC827/GR cells and human NSCLC tissues with gefitinib-resistance. A: MTS assays were used to detect cell viability of HCC827/GR cells (*P<0.05); B: Western blot was used to detect FOXC1 expression in HCC827/GR cells; C: IHC assays were performed in human NSCLC tissues with gefitinib resistance; D: Box-plot showed that FOXC1 expression scores in human NSCLC tissues with gefitinib resistance.

2.2 干擾FOXC1增加HCC827/GR細胞對吉非替尼的敏感性 為考察FOXC1是否介導(dǎo)NSCLC吉非替尼耐藥，采用兩個FOXC1 shRNA干擾質(zhì)粒分別干擾HCC827/GR耐藥細胞中FOXC1的表達。Western blot結(jié)果顯示兩個干擾質(zhì)粒均能顯著下調(diào)HCC827/GR耐藥細胞中FOXC1的表達（圖2A）。進一步采用MTS分析干擾FOXC1對吉非替尼耐藥性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾FOXC1的HCC827/GR細胞在吉非替尼的誘導(dǎo)下的增殖能力較HCC827/GR細胞有所降低（P<0.05，圖2B）。干擾FOXC1后的HCC827/GR細胞的半數(shù)抑制濃度（50% inhibitory concentration, IC50）值較對照組細胞顯著降低（P<0.01，圖2C）。同時，MTS檢測分析穩(wěn)定過表達FOXC1的HCC827細胞。結(jié)果如圖2E所示，與對照組細胞相比，過表達FOXC1的HCC827細胞在吉非替尼誘導(dǎo)下的增殖能力有所提高（P<0.05）；過表達FOXC1的HCC827細胞IC50值較對照組細胞顯著升高（P<0.01，圖2F）。上述結(jié)果表明，干擾FOXC1能明顯增加HCC827/GR耐藥細胞對吉非替尼的敏感性。

圖 2 干擾FOXC1增加HCC827/GR細胞對吉非替尼的敏感性。A：Western blot驗證FOXC1的干擾效果；B：MTS實驗檢測干擾FOXC1對HCC827/GR細胞增殖能力的影響（*P<0.05）；C：HCC827/GR細胞IC50值的計算（**P<0.01）；D：Western blot驗證FOXC1的過表達效果；E：MTS實驗檢測過表達FOXC1對HCC827細胞增殖能力的影響（*P<0.05）；F：HCC827細胞IC50值的計算（**P<0.01）。Fig 2 Knockdown of FOXC1 increased gefitinib sensitivity of HCC827/GR cells. A: Western blot was used to detect the interference effect of FOXC1 shRNA; B: MTS assays were used to detect cell viability of HCC827/GR cells with FOXC1 knockdown (*P<0.05); C: The IC50 of HCC827/GR cells were calculated (**P<0.01); D: Western blot was used to detect the expression of FOXC1; E: MTS assays were used to detect cell viability of FOXC1-overexpressing HCC827 cells (*P<0.05); F: The IC50 of HCC827 cells were calculated (**P<0.01). MTS: Methyl-thiazolyldiphenyl-sulfophenyl-tetrazolium bromide; IC50: 50% inhibitory concentration.

2.3 干擾FOXC1增加吉非替尼誘導(dǎo)的HCC827/GR細胞凋亡 為明確FOXC1對吉非替尼耐藥細胞凋亡的作用，采用Annexin V-APC/7-AAD凋亡試劑盒檢測干擾FOXC1的HCC827/GR細胞凋亡情況。如圖3A和圖3B所示，在無吉非替尼誘導(dǎo)的情況下，干擾FOXC1沒有對HCC827/GR細胞凋亡產(chǎn)生影響；而HCC827/GR細胞經(jīng)濃度為3 μmol/L吉非替尼的處理，干擾FOXC1使耐藥細胞的凋亡比率明顯升高（P<0.05）。上述結(jié)果表明，干擾FOXC1能夠增加吉非替尼誘導(dǎo)的HCC827/GR細胞凋亡。

圖 3 干擾FOXC1增加吉非替尼誘導(dǎo)的HCC827/GR細胞凋亡。A：流式細胞術(shù)檢測干擾FOXC1對HCC827/GR細胞凋亡的影響；B：柱狀圖分析干擾FOXC1后HCC827/GR細胞發(fā)生凋亡的比例（*P<0.05）。Fig 3 Knockdown of FOXC1 increased gefitinib-induced cell apoptosis of HCC827/GR cells. A: The effect of FOXC1 knockdown in HCC827/GR cells on apoptosis was analyzed by flow cytometry; B: The histogram analysis showed the proportion of apoptosis cells (*P<0.05).

2.4 干擾FOXC1抑制HCC827/GR細胞的腫瘤干細胞特性 已有研究表明，獲得腫瘤干細胞（cancer stem cells,CSCs）特性是EGFR-TKI獲得性耐藥的重要機制[11]。qRTPCR結(jié)果顯示HCC827/GR細胞中CSCs標志物CD133的mRNA表達量明顯高于敏感細胞（P<0.05，圖4A），而干擾FOXC1能夠抑制HCC827/GR細胞CD133 mRNA的表達（圖4B）。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果分析可見，干擾FOXC1能下調(diào)CD133的蛋白表達水平（圖4C）。緊接著，采用微球體形成實驗分析FOXC1對HCC827/GR細胞微球體形成的影響，從而判斷其干細胞特性之自我更新能力的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾FOXC1的HCC827/GR細胞中微球體形成數(shù)量少于對照組（P<0.05，圖4D，圖4E）。上述結(jié)果提示，干擾FOXC1抑制HCC827/GR細胞的干細胞特性。

圖 4 干擾FOXC1抑制HCC827/GR細胞的腫瘤干細胞特性。A：qRT-PCR檢測HCC827/GR細胞CD133的mRNA表達水平（*P<0.05）；B：qRT-PCR檢測干擾FOXC1后HCC827/GR細胞CD133的mRNA表達水平（*P<0.05）；C：流式細胞術(shù)檢測干擾FOXC1后HCC827/GR細胞CD133的蛋白表達情況；D：微球體形成實驗分析干擾FOXC1對HCC827/GR細胞干細胞特性之自我更新能力的影響；E：柱狀圖分析微球體形成數(shù)量（*P<0.05）。Fig 4 Knockdown of FOXC1 inhibited cancer stem cell properties of HCC827/GR cells. A: The mRNA level of CD133 in HCC827/GR cells was detected by qRT-PCR (*P<0.05); B: The mRNA level of CD133 in HCC827/GR cells with FOXC1 knockdown was detected by qRT-PCR (*P<0.05); C: The protein level of CD133 in HCC827/GR cells with FOXC1 knockdown was analyzed by flow cytometry; D: The stem cell self-renewal of HCC827/GR cells with FOXC1 knockdown was detected by microsphere formation experiments; E: The histogram analysis showed the number of microspheres (*P<0.05).qRT-PCR: quantitative real-time PCR.

2.5 干擾FOXC1抑制HCC827/GR細胞SOX2的表達 為明確FOXC1如何抑制HCC827/GR細胞的干細胞特性，我們首先檢測了CSCs的轉(zhuǎn)錄因子SOX2、OCT4和Nanog的表達情況。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，HCC827/GR細胞中SOX2和Nanog的mRNA表達水平顯著高于HCC827細胞（P<0.01），OCT4 mRNA表達則沒有明顯變化（圖5A）。在HCC827/GR細胞中，干擾FOXC1能夠明顯下調(diào)HCC827/GR細胞SOX2的mRNA和蛋白表達水平（圖5B，圖5C）。然后，對干擾FOXC1的HCC827/GR細胞轉(zhuǎn)染過表達SOX2的質(zhì)粒，Western blot結(jié)果顯示SOX2的表達水平升高（圖5D）。MTS實驗檢測發(fā)現(xiàn)，干擾FOXC1的HCC827/GR細胞在過表達SOX2后的增殖能力相比未過表達SOX2的細胞有所提高（P<0.05，圖5E）。同時，l-1-2干擾FOXC1的HCC827/GR細胞過表達SOX2后相比表達SOX2前的IC50值也有所升高（P<0.05，圖5F）。上述結(jié)果表明，干擾FOXC1能夠抑制HCC827/GR細胞SOX2的表達。

圖 5 干擾FOXC1抑制HCC827/GR細胞SOX2的表達。A：qRT-PCR檢測HCC827/GR細胞SOX2、OCT4和Nanog的mRNA表達水平（**P<0.01）；B：qRTPCR檢測干擾FOXC1后HCC827/GR細胞SOX2、OCT4和Nanog的mRNA表達水平（**P<0.01）；C：Western blot檢測干擾FOXC1后HCC827/GR細胞SOX2和Nanog的蛋白表達水平；D-F：使用干擾FOXC1的HCC827/GR細胞，構(gòu)建穩(wěn)定過表達SOX2的細胞株；D：Western blot檢測SOX2和FOXC1的蛋白表達水平；E：MTS檢測細胞增殖能力（*P<0.05）；F：計算IC50值（*P<0.05）。Fig 5 Knockdown of FOXC1 inhibits the expression of SOX2 in HCC827/GR cells. A: The mRNA levels of SOX2, OCT4 and Nanog in HCC827/GR cells were detected by qRT-PCR (**P<0.01); B: The mRNA levels of SOX2, OCT4 and Nanog in HCC827/GR cells with FOXC1 knockdown were detected by qRT-PCR (**P<0.01); C: The protein levels of SOX2 and Nanog in HCC827/GR cells with FOXC1 knockdown were detected by Western blot; D-F:HCC827/GR cells with FOXC1 knockdown were stably transfected with pCMV-SOX2 and with an empty vector as a control; D: The protein levels of SOX2 and FOXC1 were detected by Western blot; E: MTS assays were used to detect cell viability (*P<0.05); F: The IC50 of cells were calculated (*P<0.05).

2.6 FOXC1、SOX2和CD133在吉非替尼耐藥組織中表達的相關(guān)性 為進一步從體內(nèi)驗證FOXC1、SOX2和CD133表達的關(guān)系，采用免疫組化檢測15例吉非替尼耐藥組織和15例吉非替尼敏感組織中FOXC1、CD133和SOX2的表達情況。SOX2和CD133在NSCLC吉非替尼耐藥組織中的表達均顯著高于敏感組織（P<0.01，圖6A）。FOXC1高表達的NSCLC組織中，同時伴隨著SOX2與CD133的高表達；FOXC1低表達的組織中，SOX2與CD133的表達量則偏低（圖6B，圖6C）。同時，選取了癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）數(shù)據(jù)庫中肺腺癌患者組織FOXC1、CD133和SOX2表達的數(shù)據(jù)，探討三個基因的相關(guān)性。如圖6D所示，F(xiàn)OXC1、SOX2和CD133的表達均兩兩呈正相關(guān)（P<0.05）。以上結(jié)果表明，F(xiàn)OXC1、SOX2和CD133在吉非替尼耐藥組織中表達兩兩呈正相關(guān)。

圖 6 FOXC1、CD133和SOX2在吉非替尼耐藥組織中的表達相關(guān)性分析。A：箱線圖分析SOX2和CD133在NSCLC耐藥組織表達的得分情況；B：同一NSCLC組織中FOXC1、SOX2和CD133的表達情況；C：NSCLC組織中FOXC1、SOX2和CD133表達差異的分布情況；D：基于TCGA數(shù)據(jù)庫的肺腺癌數(shù)據(jù)集，分析FOXC1、SOX2和CD133表達的相關(guān)性。Fig 6 Correlations of the expressions of FOXC1, CD133 and SOX2 were assessed in NSCLC tissues with gefitinib resistance. A: SOX2 and CD133 expression scores in NSCLC tissues with gefitinib resistance; B: Representative examples of the FOXC1, SOX2 and CD133 staining in the same NSCLC tissue set; C: Differences of expressions of FOXC1, SOX2 and CD133 in NSCLC tissues; D: Correlations of the expressions of FOXC1, CD133 and SOX2 with each other in lung adenocarcinoma samples from TCGA database.

3 討論

EGFR-TKI靶向治療以其選擇性作用強，療效顯著，毒副作用小等優(yōu)勢在臨床NSCLC治療中越來越受到重視。吉非替尼是首個口服的EGFR-TKI，研究[12]發(fā)現(xiàn)對于EGFR突變陽性的NSCLC患者，吉非替尼一線治療優(yōu)于標準方案化療。然而吉非替尼的有效維持時間僅為8個月-10個月，且多數(shù)患者容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，提示此類藥物存在較嚴重的獲得性耐藥。目前有關(guān)EGFR-TKIs獲得性耐藥的主要機制包括T790M突變[13]、c-MET癌基因擴增[14]、上皮間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化[15]等，然而TKI耐藥是多因素參與的復(fù)雜過程，仍有約30%患者的耐藥原因尚不明確。

FOXC1是叉頭框蛋白家族重要成員，參與調(diào)節(jié)多種生物過程，包括發(fā)育、分化、增殖、遷移和腫瘤發(fā)生等。近年來，F(xiàn)OXC1被證實在多種癌癥如乳腺癌、肝癌、前列腺癌中扮演癌基因的角色。本研究首次發(fā)現(xiàn)FOXC1在NSCLC吉非替尼耐藥細胞和組織中顯著高表達。MTS結(jié)果可見，在吉非替尼的作用下，干擾FOXC1能夠明顯抑制耐藥細胞HCC827/GR的增殖能力（P<0.05），且IC50值也發(fā)生顯著降低，表明干擾FOXC1能夠增加HCC827/GR細胞對吉非替尼敏感性。以上結(jié)果提示，F(xiàn)OXC1的過表達可能是導(dǎo)致NSCLC患者對吉非替尼發(fā)生耐藥的原因之一。

有研究[11]表明，腫瘤細胞中存在一小部分分化程度低、自我更新能力和成瘤能力強的CSCs，參與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和耐藥。EGFR-TKI耐藥與CSCs密切相關(guān)[16]，在NSCLC患者的靶向治療過程中，CSCs富集可能是獲得EGFR-TKI耐藥性的重要原因[17]。研究[18]發(fā)現(xiàn)NSCLC吉非替尼耐藥細胞具有CSCs特性，高表達CSCs相關(guān)基因，自我更新能力強。CD133是人NSCLC中CSCs的特定表面標記[19]。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行分析，人肺腺癌組織中FOXC1與CD133表達呈正相關(guān)。我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾FOXC1能夠抑制HCC827/GR細胞CD133的表達，說明FOXC1參與了對CSCs特性的調(diào)控。此外，微球體形成實驗表明干擾FOXC1能夠使HCC827/GR細胞的自我更新能力受到抑制。OCT4、NANOG和SOX2是干性相關(guān)的調(diào)控基因，可幫助NSCLC維持CSCs樣特性[20,21]，而干擾FOXC1可顯著降低SOX2的表達。再者，HCC827/GR細胞干擾FOXC1之后過表達SOX2，SOX2表達水平升高且細胞增殖能力增強，進一步說明FOXC1通過調(diào)節(jié)SOX2表達來促進NSCLC吉非替尼耐藥細胞的CSCs樣特性，維持細胞耐藥性。Cao等[22]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1通過促進β-catenin表達進而增強NSCLC的CSCs樣特性。另有研究[23]指出，SOX2是受β-catenin調(diào)控的靶基因。因此，我們推斷β-catenin介導(dǎo)FOXC1對SOX2的表達調(diào)控。以上結(jié)果表明，F(xiàn)OXC1可能通過調(diào)控CSCs樣特性促進NSCLC吉非替尼耐藥。

總之，我們研究發(fā)現(xiàn)FOXC1在NSCLC吉非替尼耐藥中起到重要作用，是逆轉(zhuǎn)NSCLC吉非替尼耐藥的有效靶點。而FOXC1對CSCs的調(diào)控作用可能是其促進NSCLC吉非替尼耐藥的重要機制。

Author contributions

Peng C and Huang YF conceived and designed the study.Peng C, Li P and Yang MQ performed the experiments. Li P and Yang MQ analyzed the data. Peng C and Chen DY contributed analysis tools. Chen DY and Huang YF provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.