干貝多糖的蛋白質脫除方式對抗氧化活性的影響

王思婷，薛 蕊，李欣怡，趙前程，2，3，李智博*，2，3

（1.大連海洋大學 食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023；2.遼寧省水產品分析檢驗及加工技術科技服務中心，遼寧 大連 116023；3.遼寧省水產品加工及綜合利用重點實驗室，遼寧 大連 116023）

海灣扇貝（Argopecten irradians）是一種重要的經濟類海洋貝類。海灣扇貝柱富含多種營養(yǎng)成分，蛋白質、脂肪、糖類質量分數(shù)分別占14.03%，1.20%和3.07%，其中的總糖質量分數(shù)顯著高于巖扇貝（1.9%）、蝦夷扇貝（1.79%）及櫛孔扇貝（0.45%）[1]，極具開發(fā)價值。據(jù)報道，扇貝多糖具有抗腫瘤、提高免疫力、抗氧化和抗凝血等活性[2-4]，已經成為重要的功能食品資源。

由于扇貝不易貯藏，干制成為扇貝儲藏的主要手段。由于多糖與蛋白質相連，而海洋貝類普遍具有高蛋白質的特性[5]，熱加工干制過程會加速兩者的結合，提取的多糖成分通常會含有蛋白質雜質。為減輕蛋白質對多糖結構和生物活性研究的干擾，脫蛋白質具有重要的意義。目前較普遍的蛋白質脫除 方 法 如：TCA法、Seveage法、酶 法 等，其 中，Seveage法不適合食品加工行業(yè)?，F(xiàn)階段對于扇貝多糖脫蛋白質的研究多集中于多糖得率和蛋白脫除率上，如李雪梅等[2]采用乙醇沉淀法結合TCA法脫除海灣扇貝多糖的蛋白質，脫除率達90%以上；劉禹等[6]的研究表明，一種新興的D-葡萄糖酸-δ-內酯（GDL）蛋白質脫除法，對蝦夷扇貝多糖的蛋白質脫除率可達99%，效果優(yōu)于TCA法。

蛋白質脫除方法在不同程度上都會影響到多糖的含量、得率或者活性，目前，關于蛋白質脫除方式對多糖結構、活性的影響鮮有報道。作者對干貝多糖進行不同方式的脫蛋白質處理，并比較了蛋白質脫除方式對干貝多糖結構和抗氧化活性的影響，以期找出干貝多糖的最佳脫蛋白質方法，為研究干燥過程對干貝多糖的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗原料為海灣鮮扇貝，由大連玉洋集團有限公司提供，鮮貝柱于50℃下烘干，自制為干貝柱，粉碎備用。

木瓜蛋白酶（1×105u/g）、堿性蛋白酶（2×105u/g）：上海瑞永生物科技有限公司產品；氫氧化鈉（分析純）：沈陽市聯(lián)邦試劑廠產品；三氯乙酸（TCA）：天津市科密歐化學試劑有限公司產品；濃硫酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司產品；D-葡萄糖酸-δ-內酯（GDL）：阿拉丁試劑（上海）有限公司產品；過氧化氫（分析純）、水楊酸（分析純）：北京化學試劑有限公司生產產品；FeSO4·7H2O（分析純）：天津市大茂化學試劑廠產品；苯酚、無水乙醇（分析純）：新光化工試劑廠產品；二苯基苦味肼基自由基（DPPH）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司產品。

1.2 儀器與設備

PAL-1便攜式折光儀：日本ATAGO公司產品；XH-C漩渦混勻儀：常州越新儀器制造有限公司產品；SYNERGY HI酶標儀：美國伯騰儀器有限公司產品；UDK152全自動凱氏定氮儀：意大利VELP公司產品；DY-200-BZ空氣浴振蕩搖床：廈門德儀設備有限公司產品；高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司產品；L-8900型氨基酸自動分析儀：日本HITACHI公司產品；GI21M湘儀離心機：上海醫(yī)療器械有限公司手術器械廠產品；FD-1型冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產品；Lambda 25紫外-可見分光光度計：美國PerkinElmer公司產品；Sigma300掃描電子顯微鏡：卡爾蔡司（上海）管理有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 干貝粗多糖的提取精確稱取適量干貝柱粉，以液料體積質量比為40 mL∶1 g加入去離子水，在80℃下熱水浸提4 h后超聲9 min。過濾濾渣，調整浸提液固形物質量分數(shù)至10%，添加質量分數(shù)2%的木瓜蛋白酶進行酶解，酶解時間3 h、溫度57.8℃、pH 7.1。離心取上清液，加入體積分數(shù)95%乙醇至乙醇最終體積分數(shù)為75%，4℃靜置12 h后，離心取沉淀，揮醇后凍干，得干貝粗多糖（DAMP）。將DAMP配制成質量濃度為50 mg/mL的粗多糖溶液備用。

1.3.2 堿酶法蛋白質脫除參照韓瑩等的方法[7]并略做改進。將粗多糖溶液pH值調至10，加入堿性蛋白酶使酶質量分數(shù)為2%，于50℃酶解3 h，沸水浴10 min滅酶，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，醇沉后冷凍干燥。

1.3.3 稀堿法蛋白質脫除參照陳利華等的方法[8]并略做改進。60℃下用0.1 moL/L的NaOH溶液提取3 h，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，醇沉后冷凍干燥。

1.3.4 TCA法蛋白質脫除參照李雪梅等的方法[2]并略做改進。將質量分數(shù)2%的TCA溶液與一定體積的粗多糖溶液等體積混合，震蕩反應3 h，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，醇沉后冷凍干燥。

1.3.5 GDL法蛋白質脫除參照劉瑀等的方法[6]并略做改進。向粗多糖溶液中加質量分數(shù)2%的GDL溶液，使GDL的終質量分數(shù)達到0.3%~0.5%。置于45℃的恒溫水浴鍋中反應3 h，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，醇沉后冷凍干燥。

1.3.6 蛋白質脫除率及多糖損失率的計算采用苯酚-硫酸法[9]測定多糖，采用凱氏定氮法[10]測定蛋白質質量分數(shù)，測定3組平行取平均值。蛋白質脫除率及多糖損失率的計算公式如下：

式中：X0為脫蛋白質前樣品中蛋白質量分數(shù)；X1為脫蛋白質后樣品中蛋白質量分數(shù)。

式中：m0為脫蛋白質前樣品提取物質量；m1為脫蛋白質后樣品提取物質量。

1.3.7 單糖組成分析采用PMP柱前衍生高效液相色譜法測定脫蛋白質純化后多糖的單糖組成，具體操作參考文獻[11]。

1.3.8 氨基酸組成分析使用氨基酸自動分析儀測定氨基酸種類與含量，氨基酸質量分數(shù)以mg/g表示。具體操作參考文獻[12]。

1.3.9 剛果紅試驗參照陳楊揚等的方法[13]并略做改進。稱取多糖樣品各1 mg，加入1 mL蒸餾水和80μmol/L剛果紅溶液2 mL，充分混勻后加入NaOH，使各組NaOH終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L，并用紫外全波段掃描，記錄不同NaOH濃度下的最大吸收波長。

1.3.10 掃描電鏡分析參照Wang等的方法[14]并略做改進。取適量經蛋白脫除的多糖樣品，鍍上導電金粉后將其放置于掃描電鏡下觀察。工作條件：加速電壓15 kV，觀測倍數(shù)分別選用200、1 000、10 000倍。

1.3.11 DPPH自由基清除能力的測定參照Odeleye等的方法[15]并略做改進。將待測樣品配制為30 mg/mL的樣液，用無水甲醇依次稀釋成2、4、6、8、10 mg/mL梯度。將2 mL樣液與2 mL 0.16 mmol/L DPPH-甲醇溶液（6.31 mg/dL）混合均勻。以VC作陽性對照，室溫下避光靜置30 min后于517 nm下用酶標儀測定吸光值。每個濃度梯度進行3組平行試驗。DPPH清除率計算方式為：

式中：A0為無水甲醇代替樣品的測得吸光度值；A1為樣品溶液的測得吸光度值；A2為無水甲醇代替DPPH測得的吸光度值。

1.3.12 羥基自由基清除能力的測定參照Liu等的方法[16]并略做改進。將待測樣品配制為30 mg/mL的原液，依次稀釋成2、4、6、8、10 mg/mL的溶液。將1 mL樣液與1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液和1 mL 8.8 mmol/L的H2O2溶液混合均勻，37℃水浴30 min，以VC作陽性對照于510 nm下測吸光值，清除率按下式計算：

式中：A3為去離子水代替樣品的測得吸光度值；A4為樣品溶液的測得吸光度值；A5為去離子水代替H2O2溶液測得的吸光度值。

1.3.13 數(shù)據(jù)處理實驗結果以（平均值±標準偏差）表示，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0軟件進行單因素ANOVA分析，顯著性水平設定為0.05。

2 結果與分析

2.1 干貝多糖蛋白質脫除的結果

本實驗中，在多糖提取物不被顯著降解的條件下去除結合的蛋白質，以提高多糖的質量分數(shù)是十分必要的。1.3.1中得到的DAMP的多糖質量分數(shù)為（53±0.58）%，蛋白質質量分數(shù)為（39.09±0.88）%。經4種蛋白質脫除方式處理后，多糖質量分數(shù)、蛋白質脫除率和多糖損失率見表1。多糖質量分數(shù)由高到低分別為：TCA法＞稀堿法＞堿酶酶解法＞GDL法。其中，TCA組多糖質量分數(shù)顯著高于其他3組。蛋白質脫除率及多糖損失率由高至低依次為：TCA法＞稀堿法＞堿酶法＞GDL法。結合多糖質量分數(shù)、蛋白脫除率與多糖損失率分析可得，TCA法脫蛋白質最有效，但多糖損失嚴重；DAMP經稀堿法與酶解法處理后，多糖質量分數(shù)無顯著差別，但稀堿組蛋白質脫除率及多糖損失率顯著高于酶解組；經GDL法處理后，多糖質量分數(shù)及蛋白質脫除率均顯著低于其他方式，多糖損失率也最少。

表1 蛋白質脫除方式對干貝多糖質量分數(shù)、蛋白質脫除率及多糖損失率的影響Table 1 Effects of deproteinization methods on polysaccharides content,protein removal rate and polysaccharide loss rate from dried adductor muscle

2.2 單糖組成分析

由表2可知，堿酶組多糖含有Man、GlcN、GalUA、Glc、Gal、Arb；稀堿組多糖含有GlcN、Glc、Gal；TCA組 多 糖 含 有GlcN、GalUA、Glc；GDL組 多糖含有Man、GlcN、Rha、GalUA、Glc。不同蛋白質脫除方式所得多糖的單糖組成略有差別，稀堿組和堿酶組多糖中的半乳糖醛酸在堿性環(huán)境中生成半乳糖，而TCA法和GDL法多糖中檢測到半乳糖醛酸，未檢測到半乳糖。各組數(shù)據(jù)中，葡萄糖質量分數(shù)均最高。據(jù)報道，海灣扇貝多糖組分為中性多糖和酸性多糖[2]，與本實驗結果一致。

表2 干貝多糖各組單糖質量分數(shù)Table 2 Monosaccharide contents of polysaccharides removed from dried adductor muscle%

2.3 氨基酸組成分析

為了明確不同脫除方式處理的扇貝多糖中殘留蛋白質的情況，以及這些蛋白質與抗氧化活性之間的關系，對4種方式脫蛋白后的干貝多糖進行了氨基酸組成分析，結果顯示：干貝多糖中的總氨基酸質量分數(shù)為15~160 mg/g，堿酶組和稀堿組均檢測出16種氨基酸，TCA組和GDL組均檢測出14種氨基酸，可見氨基酸種類齊全。由表4可知，堿酶組的親水氨基酸及極性氨基酸質量分數(shù)較高，非極性氨基酸及必需氨基酸質量分數(shù)較低，疏水性氨基酸質量分數(shù)最低；稀堿組的疏水氨基酸質量分數(shù)較低，其他4種氨基酸質量分數(shù)均最低；TCA組的疏水性氨基酸、非極性氨基酸與必需氨基酸質量分數(shù)最高，親水性氨基酸與極性氨基酸質量分數(shù)較低；GDL組的親水性氨基酸和極性氨基酸質量分數(shù)最高，疏水性氨基酸、非極性氨基和必需氨基酸質量分數(shù)較高。

2.4 剛果紅試驗分析

由圖1可知，在氫氧化鈉的濃度為0~0.1 mol/L時，對照組（剛果紅）的最大吸收波長逐漸減小，GDL組和堿酶組多糖與剛果紅結合生成的絡合物的最大吸收波長隨NaOH濃度的增大紅移明顯發(fā)生，表明GDL組和堿酶組多糖存在三螺旋結構；TCA組和稀堿組多糖不具有三螺旋結構[13]，可能是DAMP在堿液、酸液處理過程中，維持穩(wěn)定三螺旋結構作用的分子內、分子間氫鍵受到破壞，導致三螺旋結構變性[17]。

表3 干貝多糖的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of polysaccharides removed from dried adductor muscle mg/g

表4 不同蛋白質脫除方式的多糖中氨基酸分類與質量分數(shù)Table 4 Classification and content of amino acids in the components of polysaccharide prepared by different deproteinization%

圖1 4種蛋白質脫除方式的多糖-剛果紅絡合物在不同堿濃度中的最大吸收波長Fig.1 Maximum absorption wavelength of polysaccharide-Congo red complex extracted by four deproteinization methods under various concentration of NaOH

2.5 掃描電鏡分析

如圖2所示，堿酶組多糖放大200倍時，呈不規(guī)則塊狀，且有碎屑狀粗多糖散落，疏松多孔；放大粗糙面至1 000倍時，表面凹凸不平，散布致密圓形孔徑；10 000倍下，多糖表面略粗糙，有裂紋。稀堿組多糖放大至200倍時，呈大小不一的不規(guī)則片狀，表面光滑；1 000倍下，多糖切面平整；10 000倍時，多糖表面稍有圓形凸起和凹陷，棱角清晰。TCA組多糖放大至200倍，呈大小、形狀不一的塊狀；1 000倍條件下，多糖碎片上有條形溝紋和孔洞；放大至10 000倍時，觀察到孔洞深淺不一，比較光滑，并呈直線排列于溝紋凹陷中。GDL組多糖在200倍條件下，呈不規(guī)則片狀；放大粗糙面至1 000倍下，多糖表面有裂紋，不平整，有大小不一的圓孔；10 000倍條件下，觀察到圓孔內粗糙不平整，有疏散的細孔。由圖2可知，稀堿組多糖較光滑致密，分子排列較整齊，說明稀堿組多糖分子間相互作用較強[18]，其余3組多糖較疏松，多孔。所有多糖分子間隙均較大，可能是干貝柱多糖分子間的斥力導致分子之間有一定的距離。

圖2 不同蛋白質脫除方式的粗多糖表面結構Fig.2 Surface structures of crude polysaccharides purified by different deproteinization methods

2.6 體外抗氧化能力分析

如圖3所示，未脫蛋白的DAMP與4種蛋白質脫除方式得到的干貝多糖均有一定清除DPPH自由基的能力，但除了GDL組多糖，其他組多糖的DPPH自由基清除能力都不及VC。經GDL法純化的多糖顯示出明顯的DPPH自由基清除能力，并呈劑量依賴關系。當多糖質量濃度為10 mg/mL時，GDL組多糖的DPPH自由基清除率為80.56%。不同蛋白脫除方式對干貝多糖清除羥基自由基能力的影響見圖4，稀堿組多糖顯示出明顯的羥基自由基清除能力，并呈劑量依賴關系。當多糖質量濃度為10 mg/mL時，稀堿組多糖的羥基自由基清除率為93.64%，比較接近VC的清除能力（10 mg/mL，99.73%）。堿酶組及GDL組多糖的羥基自由基清除能力優(yōu)于TCA組多糖，可見，干貝多糖的抗氧化活性與多糖含量并不相關，而是與單糖組成、空間構象等諸多因素有關[19]。

圖3 不同蛋白質脫除方式對干貝多糖清除DPPH自由基的影響Fig.3 Effects of different deproteinization methods on the scavenging activities of polysaccharides from dried adductor muscle on DPPH radicals

圖4 不同蛋白質脫除方式對干貝多糖清除羥基自由基的影響Fig.4 Effects of different deproteinization methods on the scavenging activities of polysaccharides from dried adductor muscle on hydroxyl radicals

DAMP的抗氧化活性不高，可能是貝柱干燥過程中，水分的蒸發(fā)使水分子與貝柱多糖中的分子間氫鍵斷裂，引起多糖空間結構的破壞，進而影響抗氧化活性[20]。TCA組多糖對DPPH自由基及羥基自由基的清除能力均不理想，可能在TCA法脫蛋白質過程中，糖苷鍵在酸性條件下斷裂，造成多糖含量檢測偏高但活性較低。豐富的氨基酸與生理活性有緊密的聯(lián)系，總氨基酸含量與抗氧化活性呈正相關[21]，TCA組多糖總氨基酸含量不高，這與體外抗氧化試驗結果一致。稀堿組多糖表現(xiàn)出良好的羥基自由基清除能力，但DPPH自由基清除能力最弱，可見不同抗氧化活性與干貝多糖結構關系的聯(lián)系不盡相同。可能由于稀堿組多糖中的基團容易提供質子氫與羥基自由基反應[22]。稀堿組多糖含有較多的Asp和Glu，Asp和Glu具有抗氧化能力，因此推測稀堿組多糖較強的羥基自由基清除能力可能也與其含有的氨基酸有關[23]。GDL組多糖中，疏水性氨基酸、極性氨基酸與非極性氨基酸含量較高，葛曉鳴等[24]研究發(fā)現(xiàn)，疏水性氨基酸在DPPH自由基的清除中起到決定性的作用，而極性氨基酸和非極性氨基酸可通過協(xié)同作用促進DPPH自由基的清除，因此GDL組多糖表現(xiàn)出良好的自由基清除活性。聚糖鏈的構象與其生物活性密切相關[25]，GDL組及堿酶組多糖的抗氧化活性較好，也可能是其含有的三螺旋結構對多糖活性產生影響。有研究表明，分子間氫鍵作用是三螺旋結構剛性的主要動力[26]。據(jù)報道，剛性三螺旋結構具有抗腫瘤活性及免疫活性[27]，三螺旋葡聚糖與其他生物活性間的關系還待進一步研究。

3 結語

不同蛋白質脫除方式的多糖組分、結構和抗氧化活性不同。TCA法脫蛋白效果最顯著，脫蛋白質后多糖質量分數(shù)提高至（74.83±0.27）%，蛋白質脫除率為（86.36±1.01）%，但多糖抗氧化活性和總氨基酸含量最低，單糖組成簡單，不具有三螺旋結構，適用于以干貝多糖結構研究為目的的純化。GDL法脫蛋白質的效果次于其他3種方式，脫蛋白質后多糖質量分數(shù)提高至（62.51±0.71）%，蛋白質脫除率為（27.42±0.67）%，但綜合來看多糖抗氧化活性高于其他組多糖，總氨基酸質量分數(shù)最高，單糖組成豐富，具有三螺旋結構，該方法比較適合于獲取具有較好抗氧化活性的干貝多糖研究。堿酶法脫蛋白效果與稀堿法無顯著差別，但其總氨基酸含量高于稀堿組，單糖組成較稀堿組豐富，且具有三螺旋結構，多糖活性高于稀堿組多糖，稍次于GDL組多糖。作者希望獲得高含量高活性的多糖組分，故選擇堿酶法脫蛋白質。