LC-MS/MS法測(cè)定大鼠血漿中EGCG及其藥動(dòng)學(xué)研究

喬妙 朱朋艷 趙云麗 黃艷蘋(píng) 吳凡 高文分 盛軍 袁文娟 王宣軍

摘要 [目的]建立一種LC-MS/MS測(cè)定大鼠血漿中EGCG濃度的方法，進(jìn)而研究其藥動(dòng)學(xué)。[方法]選用Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-水（90∶10）為流動(dòng)相，等度洗脫，ESI離子源，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)，負(fù)離子掃描;以香草醛為內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)法定量。[結(jié)果]EGCG和內(nèi)標(biāo)不受基質(zhì)干擾;定量限分別為10 ng/mL（EGCG）和5 ng/mL（香草醛），血漿樣品批內(nèi)和批間精密度（RSD）≤11.5%，準(zhǔn)確度在92.0%～118.9%，萃取回收率≥92.7%，基質(zhì)效應(yīng)為95.3%～115.3%，大鼠腹腔注射20 mg/kg EGCG后的血漿動(dòng)力學(xué)符合二室模型，消除半衰期較長(zhǎng)，表觀分布容積（Vd）大于總體水體積。[結(jié)論]該方法重現(xiàn)性好、分析時(shí)間短，能滿(mǎn)足EGCG在大鼠血漿中濃度的檢測(cè)要求，并符合《中國(guó)藥典》2015年版對(duì)生物樣品分析的要求，可用于大鼠血漿中EGCG的濃度測(cè)定和藥代動(dòng)力學(xué)研究。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;EGCG;大鼠血漿;濃度;藥代動(dòng)力學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào) R 285 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）14-0172-04

Abstract [Objective] To establish a LC-MS/MS method to determine the concentration of EGCG in rat plasma and to study its pharmacokinetics.[Method]Choose Agilent SB-C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm），acetonitrile-water （90∶10） as mobile phase，isocratic elution，ESI ion source，multireactive ion monitoring，negative ion scanning.Vanillin was used as the internal standard，and the internal standard method was used for quantification.[Result] In this method，detection of EGCG and IS were not interfered by the matix，LOQ were 10 ng/mL （EGCG） and 5 ng/mL（vanillin） respectively，the intraassay and interassay precision （RSD） of plasma samples was ≤11.5%，the accuracy was 92.0%-118.9%，and the extraction recovery rate ≥92.7%，ME was 95.3%-115.3%.After injection of 20 mg/kg EGCG，the plasma dynamics of EGCG was in accordance with the two compartment model，the apparent volume of distribution （Vd） values of EGCG was larger than total body water volume.[Concusion]This method has good reproducibility and short analysis time，can meet the detection requirements of EGCG concentration in rat plasma，and meets the requirements for the analysis of biological samples in the 2015 edition of the Chinese Pharmacopoeia，which can be applied to the pharmacokinetic study of EGCG in rats.

Key words HPLC-MS/MS;EGCG;Rat plasma;Concentration;Pharmacokinetic

基金項(xiàng)目

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32060084）;云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2019FB119）;國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃支持項(xiàng)目（202010676050）。

作者簡(jiǎn)介 喬妙（1997—），女，貴州畢節(jié)人，碩士研究生，研究方向：功能食品。*通信作者：袁文娟，副主任藥師，博士，從事食品藥品研究;王宣軍，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事食品研究與開(kāi)發(fā)工作。

收稿日期 2021-01-04

EGCG是綠茶中含量最高、活性較強(qiáng)的多羥基酚類(lèi)化合物，占40%以上，屬于兒茶素中的一類(lèi)[1- 4]，具有抗氧化和自由基清除的功能，有助于治療和清除某些類(lèi)型的癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病和肥胖[5-10]。因此，EGCG作為茶中重要的多酚類(lèi)物質(zhì)具有重要的研究?jī)r(jià)值。

目前，EGCG的研究是綠茶開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)[11-15]，但多集中在生物活性的研究上，國(guó)內(nèi)外關(guān)于EGCG藥動(dòng)學(xué)的研究較少，且集中在茶多酚、給藥途徑為口服的研究上，檢測(cè)方法多為HPLC-UV和HPLC-RID，這2種方法靈敏度低、專(zhuān)屬性差，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確[16]。云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期致力于EGCG的研究，此次試驗(yàn)建立一種簡(jiǎn)單、可靠、重現(xiàn)性好的檢測(cè)方法，對(duì)其非臨床藥動(dòng)學(xué)研究、毒動(dòng)學(xué)研究具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器。LC-30A液相色譜系統(tǒng)（配有四元梯度泵、在線脫氣機(jī)，日本島津公司）;API 5500型液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子化源（ESI源），美國(guó)AB公司）;BS224S分析天平（德國(guó)Sartorius）;LX-500型旋渦混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）;ST-16R高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher公司）;SK-18TC超聲波發(fā)生器 （上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.1.2 試藥。EGCG（批號(hào)180705，含量>99.0%，HPLC法測(cè)定，含量按100%計(jì)，上海友思生物技術(shù)有限公司）;香草醛（AR，含量>99.0%，批次20191020，aladdin）;（+）-L-抗壞血酸（VC，含量99%，批次LC80Q50，北京百靈威科技有限公司）;乙二酸四乙胺二鈉（EDTA-2Na，AR級(jí)，批次20191020，天津市大茂化學(xué)試劑廠）;乙酸乙酯（EtoAc，分析純）;甲醇（CH3OH，分析純）;乙腈（CH3CN，HPLC級(jí)，美國(guó)TEDIA公司）;水為純凈水;其余試劑均為分析純。

1.1.3 動(dòng)物。SPF級(jí)SD大鼠10只，雌雄各半，體重180～200 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川）2015-030。飼養(yǎng)條件：室溫（25±2） ℃，相對(duì)濕度為（50±10）%，每日交替12 h光照，自由飲水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)。大鼠10只，試驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水，給藥前用無(wú)菌生理鹽水配制成適當(dāng)濃度的EGCG溶液，腹腔注射，給藥劑量20 mg/kg。于給藥前及給藥后5、10、20、45、90、120、180、360 min，從大鼠眼后靜脈叢取血，置肝素化1.5 mL離心管中，低溫離心，分離得血漿樣品。于-80 ℃凍存，備用。

1.2.2 血液樣品預(yù)處理。取大鼠血漿樣品50 μL，精密加入0.2%VC-0.005%EDTA-2Na 10 μL、香草醛（5.0 μg/mL）10 μL，混勻，分別用乙酸乙酯200、100 μL漩混1 min，萃取2次，4 ℃低溫離心5 min，合并乙酸乙酯層，45 ℃以下吹干，用10%乙腈水溶液200 μL，漩混1 min，低溫離心5 min，取上清液進(jìn)行LC-MS分析。

1.2.3 溶液的配制。

1.2.3.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液及工作液的配制。精密稱(chēng)取EGCG標(biāo)準(zhǔn)品適量，置100 mL容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得0.218 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，取EGCG儲(chǔ)備液，用甲醇梯度稀釋?zhuān)玫较盗袑?duì)照品工作液，EGCG濃度分別為109.000、87.200、4.360、2.180、0.872、0.218、0.109 μg/mL;儲(chǔ)備液置于-20 ℃保存，工作液臨用時(shí)現(xiàn)配，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.3.2 內(nèi)標(biāo)香草醛（IS）溶液的配制。精密稱(chēng)取香草醛標(biāo)準(zhǔn)品適量，置100 mL容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得0.500 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，再用甲醇稀釋100倍得5.0 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.4 色譜條件與質(zhì)譜條件。色譜柱為Agilent SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;柱溫30 ℃;流動(dòng)相為乙腈-水（90∶10）;流速0.5 mL/min;進(jìn)樣量1 μL;柱溫為室溫;離子源為ESI;負(fù)離子掃描，MRM監(jiān)測(cè);電噴霧電壓-40 eV;用于定量分析的離子反應(yīng)： m/z ?457.3→168.9（EGCG）， m/z ?150.9→135.6（內(nèi)標(biāo)香草醛），見(jiàn)圖1。

1.2.5 方法學(xué)考察。

1.2.5.1 專(zhuān)屬性考察。取大鼠空白血漿50 μL，用甲醇10 μL代替內(nèi)標(biāo)溶液，按“1.2.2”方法進(jìn)行提取，按“1.2.4”色譜條件測(cè)定得空白血漿質(zhì)譜圖;另取空白血漿50 μL，精密加入EGCG對(duì)照品溶液（1.09 μg/mL）和內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，按“1.2.2”方法進(jìn)行提取，按“1.2.4”色譜條件測(cè)定得相應(yīng)質(zhì)譜圖;另取腹腔注射后空白血漿50 μL，按“1.2.2”方法進(jìn)行提取，按“1.2.4”色譜條件測(cè)定得相應(yīng)質(zhì)譜圖。

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和定量限、檢出限。精密量取50 μL大鼠空白血漿7份，分別加入109.000、87.200、4.360、2.180、0.872、0.218、0.109 μg/mL EGCG標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10 μL，IS溶液（內(nèi)標(biāo)，5 μg/mL）10 μL，按“1.2.2”方法進(jìn)行提取，按“1.2.4”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以EGCG的濃度為橫坐標(biāo) （x）、 EGCG與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo) （y）， 用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重為1/ x2）進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。以S/N>10、S/N>3 分別測(cè)得EGCG和內(nèi)標(biāo)（香草醛）的定量限和檢出限。

1.2.5.3 精密度和準(zhǔn)確度。分別取0.218、0.872、2.180、87.200 μg/mL的EGCG標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，加入空白血漿50 μL，按“1.2.2”方法進(jìn)行提取，按“1.2.4”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度6個(gè)平行樣品，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算EGCG的濃度，并計(jì)算批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度;連續(xù)處理3個(gè)分析批，計(jì)算批間準(zhǔn)確度和精密度。

1.2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。分別取0.218、87.200 μg/mL的EGCG標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，加空白血漿50 μL，再加入空白基質(zhì)提取液，渦旋混勻后檢測(cè)，每一個(gè)濃度6個(gè)平行樣本，分別考察凍融循環(huán)穩(wěn)定性（-80 ℃和室溫凍融循環(huán)3次）、室溫短期6 h穩(wěn)定性、長(zhǎng)期30 d穩(wěn)定性（-80 ℃長(zhǎng)期存放）和樣品制備后24 h自動(dòng)進(jìn)樣器穩(wěn)定性（5 ℃）。

1.2.6 稀釋效應(yīng)。制備21.8 μg/mL的血漿樣本，用空白血漿稀釋5倍后取10 μL，按“1.2.2”方法進(jìn)行提取，按“1.2.4”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定6個(gè)樣本。

1.2.7 殘留。取空白血漿20 μL，按“1.2.2”方法進(jìn)行提取，制備得到殘留樣本，在標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)樣本進(jìn)樣后進(jìn)樣殘留樣本。

1.2.8 回收率與基質(zhì)效應(yīng)。分別取低（0.218 μg/mL）、中（2.180 μg/mL）、高（87.200 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，IS溶液（內(nèi)標(biāo)，5 μg/mL）10 μL，再加入空白基質(zhì)提取液，渦旋混勻后檢測(cè)，每一個(gè)濃度6個(gè)平行樣本，峰面積記為Set1;分別取0.218、2.180、87.200 μg/mL的EGCG標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入空白血漿50 μL，渦旋混勻后，按“1.2.2”方法進(jìn)行提取，按“1.2.4”色譜條件進(jìn)樣分析，每一個(gè)濃度6個(gè)平行樣本，峰面積記為Set2;回收率按Set2/Set1計(jì)算。

分別取低（0.218 μg/mL）、中（2.180 μg/mL）、高（87.200 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，IS溶液（內(nèi)標(biāo)，5 μg/mL）10 μL，按“1.2.2”方法進(jìn)行提取，按“1.2.4”色譜條件進(jìn)樣分析，每一個(gè)濃度6個(gè)平行樣本，峰面積記為Set3;基質(zhì)效應(yīng)按Set1/Set3計(jì)算。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析及藥動(dòng)學(xué)研究。給藥數(shù)據(jù)采用對(duì)血藥濃度（C）-時(shí)間（T）數(shù)據(jù)進(jìn)行房室模型的判定及 t 1/2z、AUC、CL和Vd等藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的計(jì)算。所有數(shù)據(jù)均表示為 ±S ，應(yīng)用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過(guò) t 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性判定，如 P <0.05，則認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

取-80 ℃存放的大鼠血漿樣品，室溫解凍，精密吸取50 μL 置1.5 mL離心管中，按“1.2.2”方法進(jìn)行提取，按“1.2.4”色譜條件進(jìn)樣分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本的濃度，大鼠腹腔注射EGCG后各時(shí)間點(diǎn)所測(cè)得的血藥濃度-時(shí)間曲線，血藥濃度和時(shí)間數(shù)據(jù)采用DAS 3.2（drug and statistics）計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專(zhuān)屬性考察。由圖2可見(jiàn)，EGCG和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為8.78、9.89 min，兩者之間達(dá)到基線分離;空白血漿中雜質(zhì)峰均在兩者之前出現(xiàn)，不干擾EGCG和內(nèi)標(biāo)IS的含量測(cè)定，給藥之后血漿樣品的圖譜中未見(jiàn)代謝物干擾，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾EGCG和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和定量限、檢出限。 按照“1.2.5.2”方法操作，以EGCG的濃度為橫坐標(biāo)（ x ）、EGCG與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)（ y），用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重為1/x2）進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的回歸方程為y=4 094.174 83x+11 313.197 16（r =0.993 4），表明EGCG在5.45～5 450.00 ng/mL 線性關(guān)系良好。以 S/N >10測(cè)得EGCG和內(nèi)標(biāo)（香草醛）的定量限分別為10和5 ng/mL，以 S/N >3測(cè)得EGCG和香草醛的檢出限均為1 ng/mL。

2.1.3 精密度和準(zhǔn)確度。按照“1.2.5.3”方法操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度在92.0%～118.9%，RSD≤11.5%，符合《中國(guó)藥典》2015年版對(duì)生物樣本的檢測(cè)要求。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按照“1.2.5.4”方法操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表2），RSD≤10.7%，符合藥典測(cè)定要求，表明供試品在-80 ℃和室溫凍融循環(huán)3次、室溫6 h、-80 ℃存放30 d、自動(dòng)進(jìn)樣器24 h（5 ℃）基本穩(wěn)定。

2.2 稀釋效應(yīng) 按照“1.2.6”方法操作，平行測(cè)定6個(gè)樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)確度均值為87.5%，精密度（RSD）為5.8%，說(shuō)明高濃度血漿樣本經(jīng)過(guò)5倍稀釋不影響待測(cè)物的準(zhǔn)確定量。

2.3 殘留 在標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)樣本進(jìn)樣后進(jìn)樣殘留樣本，結(jié)果表明殘留樣本峰面積小于定量下限峰面積的20%，符合要求。

2.4 回收率與基質(zhì)效應(yīng) 從表3可以看出，EGCG的萃取回收率在92.7%～114.5%;基質(zhì)效應(yīng)在95.3%～115.3%。結(jié)果表明，EGCG在各濃度下提取回收率一致，基質(zhì)因子符合要求。該方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。

2.5 數(shù)據(jù)分析與藥動(dòng)學(xué)結(jié)果 大鼠腹腔注射EGCG后各時(shí)間點(diǎn)所測(cè)得的血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3，血藥濃度和時(shí)間數(shù)據(jù)采用DAS 3.2計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，主要藥動(dòng)學(xué)結(jié)果見(jiàn)表4，大鼠腹腔注射EGCG（20 mg/kg）后的血漿動(dòng)力學(xué)符合二室模型，消除半衰期較長(zhǎng)，表觀分布容積（Vd）大于總體水體積。

3 討論與結(jié)論

該研究分別考察了不同的流動(dòng)相和色譜柱，優(yōu)選了分析條件，此色譜條件下EGCG和內(nèi)標(biāo)（香草醛）峰形較好，出峰時(shí)間適中，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾分析物，且可以準(zhǔn)確定量;血漿樣本處理采用了液液萃取的方法，方法簡(jiǎn)便易行，能達(dá)到較高的響應(yīng)且不具有基質(zhì)效應(yīng)，能滿(mǎn)足高通量分析要求。血漿樣本用量少，且靈敏度高;按常規(guī)方法對(duì)方法學(xué)的專(zhuān)屬性進(jìn)行考察，采用質(zhì)控樣品對(duì)精密度、準(zhǔn)確度、樣品存放穩(wěn)定性等進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，均符合《中國(guó)藥典》2015年版對(duì)生物樣品分析的要求。

該研究建立了LC-MS/MS測(cè)定大鼠血漿中EGCG的分析方法，該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，符合生物樣品分析方法的指導(dǎo)原則的要求，并成功地應(yīng)用到腹腔注射給藥后在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究，獲得了藥動(dòng)學(xué)的參數(shù)。結(jié)果表明，EGCG在大鼠體內(nèi)的藥物變化趨勢(shì)符合腹腔注射藥動(dòng)學(xué)的特點(diǎn)，具有分布迅速、給藥頻次低的特點(diǎn)。該研究結(jié)果為進(jìn)一步研究EGCG藥動(dòng)-藥效學(xué)性質(zhì)提供了參考依據(jù)和技術(shù)保障。

參考文獻(xiàn)

[1] 梁駿，付婷，韓國(guó)柱，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中茶多酚主要活性成分EGCG和ECG[J].藥物分析雜志，2009，29（1）：39-43.

[2] 李秋莎，郗恒，韓國(guó)柱，等.茶多酚在大鼠的多效應(yīng)成分整合藥代動(dòng)力學(xué)及其與抗自由基藥效動(dòng)力學(xué)的相關(guān)性[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47（7）：863-869.

[3] 尹建國(guó)，張社兵，彭道泉.表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)肥胖的影響及其機(jī)制[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，48（12）：1073-1075，1081.

[4] 李秋莎.茶多酚在大鼠的多組分藥代動(dòng)力學(xué)和抗自由基藥效動(dòng)力學(xué)及其相關(guān)性研究[D].大連：大連醫(yī)科大學(xué)，2010.

[5] 劉楊，張萬(wàn)圣，顧仁濟(jì)，等.綠茶提取物EGCG對(duì)老年癡呆鼠和肥胖鼠的改善作用研究[J].糧油食品科技，2020，28（3）：1-9.

[6] WANG X，HAO M W，DONG K，et al.Apoptosis induction effects of EGCG in laryngeal squamous cell carcinoma cells through telomerase repression[J].Archives of pharmacal research，2009，32（9）：1263-1269.

[7] CAI E P，LIN J K.Epigallocatechin gallate （EGCG） and rutin suppress the glucotoxicity through activating IRS2 and AMPK signaling in rat pancreatic β cells[J].Journal of agricultural & food chemistry，2009，57（20）：9817-9827.

[8] WANG S，MOUSTAIDMOUSSA N，CHEN L X，et al.Novel insights of dietary polyphenols and obesity[J].The journal of nutritional biochemistry，2014，25（1）：1-18.

[9] 蔡淑嫻，萬(wàn)娟，劉仲華.茶葉的調(diào)節(jié)免疫作用[J].中國(guó)茶葉，2020，42（4）：1-12.

[10] 趙麗萍，邵宛芳.茶葉中EGCG功效研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（7）：143-147.

[11] 陳義，汪小鋼，宛曉春.沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯制備新工藝的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，34（3）：364-368.

[12] 吳秋欣，王慧，劉冬梅，等.表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）抗氧化作用在眼科研究中的應(yīng)用[J].眼科新進(jìn)展，2019，39（3）：287-290.

[13] 李慧星.樹(shù)脂法提取純化兒茶素及兒茶素單體EGCG分離制備的工藝研究[D].合肥：合肥工業(yè)大學(xué)，2006.

[14] 王霞，高麗娟，林炳昌.表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）的分離與制備[J].食品科學(xué)，2005，26（9）：242-246.

[15] 張牧，代二琴，張雅芳，等.綠茶多酚在藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J].信陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，32（2）：250-258.

[16] 付婷.茶多酚注射液在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究[D].大連：大連醫(yī)科大學(xué)，2009.