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    發(fā)酵酒中甜蜜素的確證技術(shù)分析及解決方案

    2021-09-03 10:00:16張書(shū)芬張愛(ài)芝忻璐琰邢家溧王志強(qiáng)
    中國(guó)釀造 2021年8期
    關(guān)鍵詞:發(fā)酵酒小柱上機(jī)

    張書(shū)芬,張愛(ài)芝,忻璐琰,蘆 童,邢家溧,王志強(qiáng),劉 艷,勵(lì) 丹,何 怡,袁 偉

    (寧波市產(chǎn)品食品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院(寧波市纖維檢驗(yàn)所),浙江 寧波 315040)

    發(fā)酵酒是以糧谷、水果、乳類等為主要原料,經(jīng)發(fā)酵或部分發(fā)酵釀制而成的飲料酒[1],主要包括葡萄酒、黃酒和果酒等。我國(guó)擁有悠久而豐富的酒文化,酒是朋友聚會(huì)、大眾娛樂(lè)不可或缺的元素,但與這種旺盛的消費(fèi)現(xiàn)狀并存的是,一些生產(chǎn)者為了去除發(fā)酵酒在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的苦味,增加口感,在發(fā)酵酒中超范圍添加甜蜜素。2017-2019年河南省發(fā)酵酒中甜蜜素監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示336份發(fā)酵酒樣品中,甜蜜素不合格率為3.3%[2];2019-2020年福建、浙江、山東等多地都有相關(guān)葡萄酒或黃酒中檢出甜蜜素的報(bào)道,引發(fā)社會(huì)廣泛關(guān)注,非法添加甜蜜素成為發(fā)酵酒最重要的風(fēng)險(xiǎn)因子。

    甜蜜素,化學(xué)名為環(huán)己基氨基磺酸鈉,作為一種食品加工甜味劑,被廣泛應(yīng)用于糕點(diǎn)、飲料、醬腌菜、配制酒等食品中,但過(guò)量攝入有致癌、致畸、損害腎功能等副作用[3-6]。為了保證人民的生命安全,GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[7]明確規(guī)定了甜蜜素在各類食品中的使用量,發(fā)酵酒未包括其中。

    目前甜蜜素常用的檢測(cè)方法有氣相色譜法[8-9]、液相色譜法[10-11]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]及液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[14-15]。由于發(fā)酵酒中添加的甜蜜素含量相對(duì)較低,氣相色譜法、液相色譜法檢測(cè)甜蜜素均需進(jìn)行衍生化處理,且酒中含有的環(huán)己醇及環(huán)己基等類似物質(zhì)會(huì)與亞硝酸鈉反應(yīng),生成環(huán)己醇亞硝酸酯,造成假陽(yáng)性的結(jié)果,因而我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.97—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定》[16]中明確規(guī)定白酒、葡萄酒、黃酒、料酒中甜蜜素的檢測(cè)僅能用液質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行檢測(cè)。與白酒等蒸餾酒不同,葡萄酒、黃酒等發(fā)酵酒基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜,其中含有大量的糖類、單寧及有機(jī)酸成分,極易在檢測(cè)時(shí)造成干擾。按照目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)時(shí),由于基質(zhì)干擾,樣品中甜蜜素與標(biāo)準(zhǔn)溶液中甜蜜素離子豐度比的偏差經(jīng)常不能滿足液相色譜-質(zhì)譜法的要求,定性困難[17],存在誤判的可能。本實(shí)驗(yàn)旨在解決發(fā)酵酒中甜蜜素的定性確證困難的問(wèn)題,以便為食品監(jiān)管提供更加可靠的數(shù)據(jù),保證廣大消費(fèi)者的安全。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%):加拿大Torononto Research Chemicals公司;甲醇、乙腈(色譜純):德國(guó)Merck公司;甲酸銨(色譜純):美國(guó)Fisher Chemical公司;乙酸銨(色譜純):上海麥克林公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    I-CLASS XeVO TQ-XS 超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀、WAX固相萃取柱(60 mg,3 mL)、液相色譜柱(ACQUITY UPLCBEHC18(100mm×2.1mm,1.7μm)、ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm)、ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)):美國(guó)Waters公司;HHS-21-8數(shù)顯恒溫水浴鍋:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠:Turbovap LV多功能全自動(dòng)氮吹濃縮儀:英國(guó)Biotage公司;VORTEX 2自動(dòng)渦旋混合器:德國(guó)IKA公司;Fotector Plus全自動(dòng)固相萃取儀:??萍瘓F(tuán)股份有限公司;Milli-Q超純水儀:美國(guó)Millipore 公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 樣品前處理

    精確稱取10 g左右樣品于100 mL燒杯中,60 ℃水浴30 min,冷卻至室溫,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,用水定容至刻度,過(guò)0.22 μm水系濾膜,上機(jī)分析。當(dāng)樣品中正負(fù)掃描通道均出峰,且保留時(shí)間與甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液一致,但離子豐度比不滿足液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定性要求時(shí),不能簡(jiǎn)單判定為陰性樣品,應(yīng)做如下處理:當(dāng)上機(jī)質(zhì)量濃度≥200 ng/mL時(shí),稀釋20倍后上機(jī)分析;當(dāng)上機(jī)質(zhì)量濃度<200 ng/mL時(shí),取1 mL定容液,加入4 mL 0.1 mol/L HCl,上樣于預(yù)先活化好的WAX固相萃取柱上(WAX固相萃取柱活化:3 mL甲醇,3 mL水),依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗,3 mL 5%氨水甲醇洗脫,洗脫液氮吹至干,以1 mL水溶解,過(guò)0.22 μm水系濾膜,上機(jī)分析。

    1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    準(zhǔn)確稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL的棕色容量瓶中,以甲醇+水(1∶1)定容至刻度,得到1 mg/mL的儲(chǔ)備液,存放于-18 ℃冰箱中,可存放1年。

    1.3.3 儀器條件

    (1)超高效液相色譜條件

    色譜柱:WatersACQUITYTMUPLCBEHC18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫:40 ℃;樣品室溫度:20 ℃;進(jìn)樣體積:3 μL。流動(dòng)相A:5 mmol/L甲酸銨水溶液;流動(dòng)相B:甲醇;梯度洗脫程序:0~2.0 min,95%A;2.0~5.0 min,95%~50%A;5.0~5.1 min,50%~10%A;5.1~6.0 min,10%A;6.1~9.0 min,95%A。

    (2)質(zhì)譜條件

    離子源:電噴霧電離(electrospray ionization,ESI),采用正負(fù)離子同時(shí)掃描多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)模式;毛細(xì)管電壓正離子模式:3.00 kV,負(fù)離子模式:2.50kV,錐孔電壓:30 V;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑溫度:600 ℃;脫溶劑氣流量:900 L/h。

    1.3.4 儀器條件對(duì)基質(zhì)效應(yīng)消除的優(yōu)化

    考察了流動(dòng)相體系(乙腈-甲酸銨、甲醇-甲酸銨、乙腈-乙酸銨、甲醇-乙酸銨)、色譜柱(ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、ACQUITY UPLC BEH C18(150mm×2.1mm,1.7μm)、ACQUITYUPLCHSST3(100mm×2.1mm,1.7μm))、梯度洗脫程序、進(jìn)樣體積(7μL、5μL、3μL)及上機(jī)液稀釋倍數(shù)在減弱或消除基質(zhì)效應(yīng)方面的作用。

    1.3.5 前處理對(duì)基質(zhì)效應(yīng)消除的優(yōu)化

    前處理方面減小基質(zhì)效應(yīng)的基本途徑是盡可能將樣品凈化,SPE固相萃取法是分析檢測(cè)中最有效、最常用的凈化方式之一,因而本實(shí)驗(yàn)采用SPE固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行凈化。并考察SPE固相萃取柱、萃取柱上樣液pH以及凈化條件對(duì)基質(zhì)效應(yīng)消除方面的影響。

    1.3.6 數(shù)據(jù)處理

    定性測(cè)定:在相同實(shí)驗(yàn)條件下,樣液中被測(cè)化合物的保留時(shí)間,與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi),且樣品中各組分定性離子的相對(duì)豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對(duì)應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較,偏差不超過(guò)表1規(guī)定的范圍,方可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的被測(cè)物。

    表1 定性分析時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差Table1 Maximum allowable deviation of relative ion abundance in qualitative analysis

    定量測(cè)定:采用Masslynx4.1軟件處理數(shù)據(jù),以Masslynx 4.1和Microsoft word 2007軟件分析并繪圖。

    基質(zhì)效應(yīng):基質(zhì)效應(yīng)是殘留檢測(cè)中普遍存在的現(xiàn)象,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液與同濃度溶劑標(biāo)準(zhǔn)的響應(yīng)強(qiáng)度對(duì)比進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的考察,其計(jì)算公式為:

    2 結(jié)果與分析

    2.1 基質(zhì)效應(yīng)的消除

    2.1.1 儀器方面基質(zhì)效應(yīng)的消除

    (1)流動(dòng)相體系的選擇

    流動(dòng)相的組成不僅會(huì)影響到目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和峰型,亦會(huì)影響到離子化效率,從而影響靈敏度。在質(zhì)譜條件摸索時(shí),發(fā)現(xiàn)只有在酸性條件下正離子采集模式才會(huì)有響應(yīng),因而流動(dòng)相體系必定為酸性體系。

    由圖1可知,乙腈-銨鹽體系的峰型及靈敏度均不及甲醇-銨鹽體系。甲酸銨和乙酸銨對(duì)離子化效率的影響不同,同等條件下甜蜜素在甲酸銨體系中響應(yīng)較乙酸銨稍強(qiáng)。銨鹽的濃度對(duì)甜蜜素的電離影響較小,而流動(dòng)相體系的改變對(duì)基質(zhì)效應(yīng)基本無(wú)影響,因而選擇以甲醇-5 mmol/L甲酸銨為流動(dòng)相體系。

    圖1 流動(dòng)相體系對(duì)發(fā)酵酒中甜蜜素分析的影響Fig.1 Effect of mobile phase system on sodium cyclamate analysis in fermented wine

    (2)色譜柱的選擇

    從現(xiàn)有文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)來(lái)看,甜蜜素的分離多采用C18[19-22]、T3[23]等色譜柱,因而實(shí)驗(yàn)比較了Waters公司生產(chǎn)的ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm)、ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)對(duì)甜蜜素的分離效果,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,甜蜜素在三種色譜柱上均能獲得較好的峰型,色譜行為無(wú)太大差異,但均不能解決甜蜜素正離子采集模式的基質(zhì)效應(yīng)問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)最終選擇通用型色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)作為分離柱。

    圖2 液相色譜柱對(duì)發(fā)酵酒中甜蜜素分析的影響Fig.2 Effect of liquid chromatographic column on sodium cyclamate analysis in fermented wine

    (3)梯度洗脫程序的優(yōu)化

    梯度洗脫程序的改變也是減弱和消除基質(zhì)效應(yīng)的有效途徑,不同梯度洗脫程序?qū)Y(jié)果的影響見(jiàn)圖3。

    圖3 流動(dòng)相梯度對(duì)發(fā)酵酒中甜蜜素分析的影響Fig.3 Effect of mobile phase gradient on sodium cyclamate analysis in fermented wine

    由圖3可知,在對(duì)甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離時(shí),通過(guò)調(diào)節(jié)洗脫梯度,甜蜜素在2 min后均可獲得良好的峰型,但在分析陰性發(fā)酵酒加標(biāo)樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)出峰時(shí)間早于4 min時(shí),甜蜜素負(fù)離子采集模式有干擾峰,正離子采集模式增強(qiáng)。調(diào)節(jié)梯度洗脫程序,發(fā)現(xiàn)當(dāng)甜蜜素在4 min后出峰時(shí),負(fù)離子采集模式干擾消除,正離子基質(zhì)干擾有一定的減小,但仍存在較大的基質(zhì)效應(yīng),實(shí)驗(yàn)通過(guò)再次延緩梯度洗脫程序,來(lái)減小基質(zhì)效應(yīng),效果不理想。當(dāng)在95%A的等度洗脫的極限條件下,甜蜜素在6 min左右出峰。因而實(shí)驗(yàn)選用1.3.3的梯度洗脫程序,此時(shí)甜蜜素在4.7 min左右出峰。

    (4)進(jìn)樣體積的優(yōu)化

    小體積進(jìn)樣是減小基質(zhì)效應(yīng)的一種有效方式,本實(shí)驗(yàn)室配備的定量環(huán)體積為10 μL,進(jìn)樣體積在2.5~7.5 μL之間定量最為準(zhǔn)確,因而考察了進(jìn)樣體積為3 μL、5 μL、7 μL時(shí)的基質(zhì)效應(yīng),結(jié)果見(jiàn)圖4。

    圖4 進(jìn)樣體積對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.4 Effect of injection volume on matrix effects

    由圖4可知,基質(zhì)效應(yīng)隨著進(jìn)樣體積的減少而呈逐漸減弱趨勢(shì)后趨于平衡,因而,最后選擇以3 μL體積進(jìn)樣。

    (5)稀釋對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

    稀釋會(huì)減少單位中干擾物含量從而減少對(duì)目標(biāo)分析物電離的影響,試驗(yàn)中經(jīng)常采取稀釋上機(jī)液的方式來(lái)減小基質(zhì)效應(yīng),稀釋對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響見(jiàn)圖5。

    圖5 樣品稀釋對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.5 Effect of sample dilution on matrix effects

    由圖5可知,當(dāng)樣品稀釋20倍時(shí)基質(zhì)效應(yīng)基本消除,結(jié)合儀器的靈敏度,甜蜜素含量為定量限0.1 mg/kg時(shí),對(duì)應(yīng)上機(jī)質(zhì)量濃度為10 ng/mL,那么疑似陽(yáng)性樣品上機(jī)質(zhì)量濃度≥200 ng/mL時(shí),通過(guò)稀釋的方法即可消除干擾物對(duì)正離子模式的干擾,解決了相對(duì)離子豐度比超過(guò)允許的最大相對(duì)偏差,定性困難的問(wèn)題。

    當(dāng)上機(jī)質(zhì)量濃度<200 ng/mL時(shí),由于值相對(duì)較小,考慮到定量限的關(guān)系,單純的稀釋已不能解決問(wèn)題,因而采取前處理凈化的方式來(lái)減小基質(zhì)效應(yīng)。

    2.1.2 前處理方面基質(zhì)效應(yīng)的消除

    (1)SPE固相萃取柱的確定

    在前處理方面,SPE固相萃取凈化法是消除基質(zhì)效應(yīng)最有效、最常用的方式之一。甜蜜素含有磺酸基團(tuán),適合采用陰離子交換小柱進(jìn)行凈化,WAX小柱是一種混合型弱陰離子交換反相吸附柱,在酸性條件下填料表面電離帶正電,能吸附帶負(fù)電的環(huán)己基氨基磺酸基負(fù)離子,在堿性條件下填料表面不帶電,可對(duì)甜蜜素進(jìn)行洗脫。因而本實(shí)驗(yàn)采用WAX固相萃取小柱進(jìn)行凈化。

    (2)SPE固相萃取柱上樣液pH的確定

    陰離子交換小柱在上樣時(shí)應(yīng)處于酸性環(huán)境,通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)[18],陰離子交換小柱的上柱試樣基本由0.1 mol/L HCl進(jìn)行溶解,以保證目標(biāo)化合物可以有效保留在小柱上,因發(fā)酵酒樣品定容液(1.3.1)基本呈現(xiàn)弱酸性偏中性狀態(tài),因而在上柱前需經(jīng)過(guò)0.1 mol/L HCl進(jìn)行稀釋,方能滿足其要求。0.1 mol/L HCl的pH值為1.0,1 mL定容液上柱前預(yù)先采用4 mL0.1 mol/L HCl稀釋至其pH為1.0。

    (3)SPE固相萃取柱凈化條件的確定

    實(shí)驗(yàn)采取在紅葡萄酒和黃酒陰性樣品中添加甜蜜素的方式,考察了WAX的凈化程序,具體見(jiàn)1.3.1。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),WAX小柱經(jīng)淋洗后,肉眼基本看不到有色物質(zhì),洗脫液也較為清澈,上機(jī)分析后發(fā)現(xiàn)所有樣品基質(zhì)效應(yīng)均完全消除,且回收率在可接受范圍。

    2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

    將甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定,甜蜜素在10~1000ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,其線性方程為:y=257802x+295.267,其中x為甜蜜素質(zhì)量濃度,y為響應(yīng)強(qiáng)度。線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 2,均符合理化檢驗(yàn)對(duì)線性相關(guān)性的規(guī)定。

    采用向空白樣品中逐級(jí)降低加標(biāo)濃度的方法確定方法的檢出限,以3倍信噪比、10倍信噪比分別計(jì)算方法的檢出限和定量限,得到其檢出限為0.03 mg/kg,定量限為0.1 mg/kg。

    2.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

    實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵酒按糖度進(jìn)行分類,對(duì)紅葡萄酒(干型、半干型、甜型、半甜型)[24]、黃酒(干型、半干型、甜型、半甜型)[25]8種陰性樣品中分別添加不同濃度水平的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)添加水平按試驗(yàn)方法平行測(cè)定6次,計(jì)算回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)及樣品中甜蜜素與相當(dāng)濃度甜蜜素標(biāo)樣的離子豐度比偏差結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 發(fā)酵酒中甜蜜素三個(gè)加標(biāo)水平下的回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及定性數(shù)據(jù)Table2 Recovery rates,relative standard deviation and qualitative data of sodium cyclamate at 3 spiked levels in fermented wine

    由表2可知,經(jīng)WAX小柱凈化,甜蜜素的回收率在82%~109%之間,試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.2%~8.6%。發(fā)酵酒加標(biāo)樣品中甜蜜素與同濃度標(biāo)樣離子豐度比能夠滿足液相色譜-質(zhì)譜法定性要求,無(wú)定性困難。

    2.4 實(shí)際樣品應(yīng)用

    應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)104份不同類型的葡萄酒、黃酒及部分料酒樣品進(jìn)行了分析測(cè)定,其中5份干紅葡萄酒樣品檢出甜蜜素,其含量在0.2~1.7 mg/kg之間,1份黃酒樣品檢出甜蜜素,其含量為2.1 mg/kg,離子豐度比均滿足液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜定性要求。

    3 結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)以甲醇-5 mmol/L甲酸銨為流動(dòng)相體系,采用正負(fù)離子同時(shí)掃描的方式對(duì)發(fā)酵酒中甜蜜素進(jìn)行測(cè)定。樣品在60 ℃水浴中揮去酒精,用水稀釋10倍后上機(jī)分析,對(duì)甜蜜素進(jìn)行快速初篩測(cè)定,當(dāng)樣品中正負(fù)模式下甜蜜素出峰位置同時(shí)出峰,離子峰度比不滿足液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定性要求時(shí),通過(guò)稀釋或固相萃取小柱凈化的方式進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。方法可用于實(shí)際樣品檢測(cè),較好地解決了發(fā)酵酒中甜蜜素檢測(cè)定性困難的問(wèn)題。

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