纖維素酶高產(chǎn)菌篩選鑒定及酶學(xué)性質(zhì)初步研究

李明華，孟秀梅，王成龍

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

纖維素是以葡萄糖為基本單位組成的大分子多糖，是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的最主要成分，其質(zhì)量約占植物干質(zhì)量的40%～50%[1]。纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的可再生資源，每年僅由陸生生物合成的纖維素總量即達(dá)560～1 200億t[2]，是十分豐富的自然資源。但是，纖維素因結(jié)構(gòu)極其穩(wěn)定，僅有極少量被利用，絕大多數(shù)任由自然腐爛或燒掉，造成了極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。纖維素經(jīng)過降解轉(zhuǎn)化為葡萄糖后，可用作食品、能源和化工等行業(yè)原料，因此，纖維素的有效利用是解決全球食品短缺、能源危機(jī)和環(huán)境污染的重要途徑之一[3-4]。

目前，纖維素的降解可通過物理法、化學(xué)法和生物法進(jìn)行[5]。但是，物理降解法效率低、能耗高，化學(xué)降解法副產(chǎn)物復(fù)雜、環(huán)境污染嚴(yán)重，而生物降解法因具有反應(yīng)條件溫和、專一性高、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，已受到越來越多科研工作者的青睞[6]。纖維素酶是可將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系，可廣泛應(yīng)用于食品、飼料、能源、化工等眾多領(lǐng)域[7]。在自然界中，纖維素酶主要產(chǎn)自真菌和細(xì)菌，特別是絲狀真菌中木霉菌屬（Trichodermasp.）、青霉菌屬（Penicilliumsp.）和曲霉菌屬（Aspergillussp.）等所產(chǎn)纖維素酶組成豐富、結(jié)構(gòu)合理，是纖維素酶生產(chǎn)的主要微生物[8-9]。但是，目前已有的產(chǎn)纖維素酶菌株或者酶活較低或者培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，嚴(yán)重制約著纖維素的高效利用[10]。因此，本研究通過真菌菌株篩選，旨在獲得纖維素酶高效生產(chǎn)菌株，以便為纖維素的綜合利用提供高活性酶。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

樣品采集于本校及周邊富含腐敗樹葉的楊樹林土壤，樣品于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒、膠回收試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）、DNA marker：寶生物工程（大連）有限公司；蛋白胨、酵母粉：上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；羧甲基纖維素鈉（sodiumcarboxymethylcellulose-Na，CMC-Na）、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、剛果紅、葡萄糖等（均為分析純）：淮安國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

CMC-Na 培養(yǎng)基：CMC-Na 20 g/L，Na2HPO42.5 g/L，KH2PO41.5 g/L，蛋白胨2.5 g/L，酵母浸粉0.5 g/L，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.5。纖維素剛果紅培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：杭州微生物試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104分析天平：梅特勒托利多儀器公司；ZD-9556恒溫?fù)u床：太倉市科教儀器廠；MJ-500F生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RXT-76TV光學(xué)顯微鏡：江南永新光學(xué)有限公司；722N可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；CL5R高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株初篩

將采集到的樣品2.5 g置于滅菌三角瓶中，加入25 mL無菌水和適量玻璃珠，旋渦振蕩器充分振蕩混勻后梯度稀釋。取不同稀釋度土壤懸液涂布于PDA固體平板培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。挑選具有不同顏色及形態(tài)的霉菌菌落點(diǎn)種到纖維素剛果紅固體平板上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯的透明圈，根據(jù)透明圈直徑（D）和菌落直徑（d）的比值（D/d），初步篩選產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的菌株并劃線保存于PDA斜面培養(yǎng)基[11]。

1.3.2 菌株復(fù)篩

將初篩獲得的菌株孢子接種至PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h后按5%（V/V）比例分別接種到CMC-Na培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)4 d后，4 ℃、6 000 r/min離心8 min，取上清液作為粗酶液測(cè)定酶活，確定菌株產(chǎn)酶能力的高低[12]。

1.3.3 菌株形態(tài)鑒定

將菌種接種于PDA固體平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)過程中觀察菌落形態(tài)、顏色及質(zhì)地等菌落特征；挑取少許菌絲制成水浸片，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲、孢子梗和孢子形態(tài)并拍照記錄[14]。

1.3.4 菌株分子生物學(xué)鑒定

參照真菌基因組提取試劑盒說明書，提取菌絲基因組DNA作為模板，以通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）通過聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列[15]，引物由上海生工合成。PCR擴(kuò)增體系為：10×Buffer 2.5 μL，模板DNA1.5μL，dNTP2.0μL，上下游引物各1.0μL，Taq酶0.4 μL，ddH2O 16.6 μL，總體積25 μL；擴(kuò)增條件為：95 ℃5 min，95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，24個(gè)循環(huán)后，72 ℃延長(zhǎng)10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收、檢測(cè)確認(rèn)后送上海生工測(cè)序。將測(cè)得序列與GenBank已知核酸序列進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對(duì)，采用Clustal W進(jìn)行多序列匹配排列，最后用鄰接（neighborjoining，NJ）法通過MEGA6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]，確定菌株的種屬。

1.3.5 纖維素酶活測(cè)定

根據(jù)DNS法測(cè)定纖維素酶活性[13]。取1 mL粗酶液加入到含有1 mL 0.5%CMC-Na 溶液，5 mL 0.1 mol/L、pH5.0磷酸緩沖液中，迅速混勻后于50 ℃水浴孵育30 min后，立即加入5 mL DNS試劑終止反應(yīng)，搖勻后沸水浴10 min，水浴冷卻后于540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.99x-0.015 7，R2=0.990 9）計(jì)算還原糖含量，求得酶活力。纖維素酶酶活定義為：50 ℃、pH5.0條件下，1 min內(nèi)催化底物水解產(chǎn)生1 μmol葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

1.3.6 纖維素酶高產(chǎn)菌株產(chǎn)酶進(jìn)程

將纖維素高產(chǎn)菌株劃線接種到PDA試管斜面上，28 ℃培養(yǎng)至產(chǎn)生大量孢子后，用含0.05%吐溫80的無菌水將孢子洗下，然后接種到PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h時(shí)，按5%（V/V）比例接種到150 mL CMC-Na培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)，定時(shí)取樣，測(cè)定上清液纖維素酶活性。

1.3.7 纖維素酶性質(zhì)測(cè)定

溫度對(duì)纖維素酶酶活的影響：取1 mL粗酶液加入含有1 mL 0.5%CMC-Na 溶液，5 mL 0.1 mol/L、pH5.0磷酸緩沖液中，分別在30～70 ℃的水浴中反應(yīng)30 min，按1.3.5方法測(cè)定酶活，考察粗酶最適反應(yīng)溫度。同時(shí)將粗酶液分別于20～80 ℃的水浴中處理1 h后，測(cè)定酶活并與未處理的酶液活性相比較計(jì)算相對(duì)酶活，確定酶熱穩(wěn)定性。

pH對(duì)纖維素酶酶活影響：取1 mL粗酶液加入含有1 mL 0.5%CMC-Na溶液，5 mL 0.1 mol/L、pH4～8.5的磷酸緩沖液中，于最適反應(yīng)溫度的水浴中反應(yīng)30 min，測(cè)定酶活，確定粗酶的最佳反應(yīng)pH。同時(shí)，將粗酶液pH分別調(diào)至pH 2～9，30 ℃靜置1 h后測(cè)定酶活，并與未處理的酶液活性相比較計(jì)算相對(duì)酶活，確定pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。

金屬離子對(duì)酶活性影響：分別在上述反應(yīng)體系中添加不同種類金屬離子（K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+、Co2+）至終濃度為1 mmol/L[17]，以不加金屬離子酶液活性為100%，測(cè)定添加金屬離子后的相對(duì)酶活，確定不同金屬離子對(duì)酶活的影響。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，應(yīng)用Excel 2010進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差分析并作圖，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離篩選

將土壤懸液稀釋后涂布于PDA平板，然后挑選不同形態(tài)的菌株菌落點(diǎn)種到剛果紅培養(yǎng)基上，根據(jù)透明圈和菌落直徑的比值可初步判斷菌株產(chǎn)酶能力的大小[18]，共篩選出5株產(chǎn)酶能力較高的菌株，結(jié)果見表1。由表1可以看出，菌株SP08透明圈和菌落直徑比值（D/d）為1.37，大于其他4株菌，這在一定程度上表明該菌株產(chǎn)酶能力高于其它菌株。但是，該方法不能準(zhǔn)確衡量菌株產(chǎn)酶及酶活力的大小，必須經(jīng)發(fā)酵液酶活測(cè)定進(jìn)一步確定[19]。將5株菌分別接種到CMC-Na液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)4 d，測(cè)定纖維素酶酶活，其中菌株SP08酶活最高，為（19.01±0.51）U/mL，因此選擇該菌進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

表1 纖維素酶高產(chǎn)菌株酶活Table1 Enzyme activity of cellulase high-producing strain

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)特征

菌株SP08的形態(tài)特征見圖1。菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌落起初為白色，絮狀，圓形，后淺黃色，直至整個(gè)菌落全部變成綠色，反面無色（圖1a）。光學(xué)顯微鏡下，菌絲有隔膜，向上伸出直立的分生孢子梗，分生孢子梗多分枝，小梗頂端有成簇的分生孢子，分生孢子橢圓形，無色，孢子壁粗糙（圖1b）。根據(jù)菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果，同時(shí)比對(duì)《真菌鑒定手冊(cè)》[20]初步鑒定該菌株為木霉（Trichodermasp.）。

圖1 菌株SP08菌落（a）和孢子及孢子梗（b）形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of colony (a),spore and conidiophore (b) of strain SP08

2.2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定

在真核生物的相同物種之間，ITS序列高度同源，是用于物種鑒別的可信賴的基因標(biāo)記[11，21]。以菌株SP08基因組DNA為模板，以ITS1和ITS4通用引物PCR擴(kuò)增獲得629 bp的DNA片段，與預(yù)期ITS區(qū)域片段大小相符（圖2）。

圖2 菌株SP08 ITS序列PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR product of ITS sequence of strain SP08

應(yīng)用BLAST程序，將該片段堿基序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行相似性比對(duì)，然后選擇同源性較高的8株菌株，應(yīng)用MEGA6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，菌株SP08與Trichoderma koningiiACCC32842處于同一分支，親緣關(guān)系最近，相似率高達(dá)99%以上，結(jié)合該菌株菌落形態(tài)、孢子及孢子梗特征，可將該菌株鑒定為康氏木霉（Trichoderma koningii），并命名為T.koningiiSP08。

圖3 基于ITS序列菌株SP08的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain SP08 based on ITS sequence

2.3 菌株SP08纖維素酶產(chǎn)酶進(jìn)程

菌株SP08隨時(shí)間產(chǎn)酶進(jìn)程如圖4所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液酶活逐漸升高，在培養(yǎng)至60 h時(shí)，酶活為（18.54±0.75）U/mL，72 h時(shí)酶活達(dá)到最高（19.18±0.68）U/mL，隨后酶活趨于穩(wěn)定直至96 h后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。纖維素酶是菌株生長(zhǎng)代謝過程中產(chǎn)生的，隨著菌體的增多，酶產(chǎn)量不斷積累，表現(xiàn)為酶活隨之升高，但培養(yǎng)至96 h后，可能酶發(fā)生部分變性失活，或菌體次級(jí)代謝產(chǎn)物抑制了酶的活力，從而導(dǎo)致酶活出現(xiàn)下降趨勢(shì)[22]。因此，在以下試驗(yàn)中，當(dāng)菌株培養(yǎng)至60 h時(shí)，即收獲粗酶液測(cè)定酶活，考察不同條件對(duì)酶活性的影響。

圖4 菌株SP08產(chǎn)纖維素酶進(jìn)程Fig.4 Cellulase production process of strain SP08

2.4 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

2.4.1 纖維素酶最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

在不同溫度條件下，菌株SP08纖維素酶活性見圖5。由圖5a可知，菌株SP08纖維素酶活隨著反應(yīng)溫度的升高而提高，在反應(yīng)溫度為50 ℃時(shí)，酶活最高（18.71±0.82）U/mL，為該酶的最適反應(yīng)溫度，進(jìn)一步提高反應(yīng)溫度，酶活則快速下降。這是因?yàn)殡S著溫度升高，底物分子與酶有效碰撞率越大，反應(yīng)就越快，但溫度過高反而加快酶的變性，造成酶活降低[23]。由圖5b可知，粗酶液在底于50 ℃水浴中加熱1 h，相對(duì)酶活＞85%；處理溫度超過50 ℃時(shí)，酶活損失較大，80 ℃處理1 h，相對(duì)酶活降至14.23%，說明該酶在低于50 ℃時(shí)能保持相對(duì)穩(wěn)定。

圖5 纖維素酶最適反應(yīng)溫度（a）及熱穩(wěn)定性（b）Fig.5 Optimal reaction temperature (a) and thermal stability of cellulase

2.4.2 纖維素酶最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

在不同pH的反應(yīng)體系內(nèi)，菌株SP08纖維素酶相對(duì)活性見圖6。由圖6a可知，該纖維素酶在pH4.5～6.0反應(yīng)體系中活性最高，其中最適反應(yīng)pH為5.5，活性為（18.92±0.63）U/mL；pH會(huì)影響到酶蛋白結(jié)構(gòu)及與底物的結(jié)合能力，從而改變酶活力[24]，因此該酶在pH低于4.5或高于6.0時(shí)，活性迅速下降。粗酶液在不同pH下30 ℃保溫1 h后相對(duì)酶活見圖6b。由圖6b可知，菌株SP08纖維素酶在pH 4.0～6.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性較高，相對(duì)酶活均＞75%，說明該酶在弱酸性條件下能夠保持相對(duì)穩(wěn)定。因此該酶最適反應(yīng)pH為5.5，處于最穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，非常有利于該酶的催化反應(yīng)。

圖6 纖維素酶最適反應(yīng)pH（a）及pH穩(wěn)定性（b）Fig.6 Optimal reaction pH (a) and pH stability (b) of cellulase

2.4.3 金屬離子對(duì)酶活性影響

不同金屬離子對(duì)纖維素酶的內(nèi)、外切酶酶活性影響不同，不同來源的纖維素酶所需作為激活劑的金屬離子也不同[25]。如圖7所示，在所測(cè)試金屬離子中，1 mmol/L的Fe2+和Cu2+能夠抑制菌株SP08纖維素酶活性，而Mg2+、Mn2+和Ca2+對(duì)該酶活性有明顯的促進(jìn)作用，其中Mn2+和Ca2+使酶活分別提高了25.2%和18.52%。由此可見，在纖維素酶的應(yīng)用過程中，金屬離子的合理選擇對(duì)酶的催化性能是非常重要的。

圖7 不同金屬離子對(duì)纖維素酶活的影響Fig.7 Effect of different metal ions on cellulase activity

3 結(jié)論

應(yīng)用剛果紅染色法從土壤中分離到一株纖維素酶高產(chǎn)菌株SP08，經(jīng)過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為康氏木霉（Trichoderma koningii），并命名為T.koningiiSP08。菌株SP08生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)酶效率高，在CMC-Na培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h即可達(dá)到最高酶活（19.18±0.68）U/mL，而且該酶在最適反應(yīng)溫度和pH時(shí)具有較高的穩(wěn)定性，非常有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行。Mg2+、Mn2+和Ca2+對(duì)菌株SP08纖維素酶具有明顯的促進(jìn)作用，而Fe2+和Cu2+卻抑制該酶的催化活性。對(duì)于該纖維素酶的具體特征及菌株產(chǎn)酶的最佳條件尚需進(jìn)一步表征和優(yōu)化。