人參葉中高產(chǎn)皂苷菌種的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

馮 穎，陶 亮，2，肖學愛，2，趙存朝，2，李 暢，2，田 洋，2，3*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.食藥同源資源開發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650201；3.國家辣木加工技術中心，云南 昆明 650201）

人參（Panax ginseng）為五加科人參屬植物，作為滋補珍品已有幾千年的歷史?，F(xiàn)代醫(yī)學證明人參具有諸多生物活性功能[1]，不僅抗癌、抗衰老、抗氧化[2]，還有效改善機體的免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)[3]。人參的主要活性成分為人參皂苷，具有抗腫瘤、抗疲勞[4]、延緩衰老、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、提高機體免疫力、改善心腦血管供血不足等作用[5]?，F(xiàn)代研究表明，人參葉與人參具有相似的化學成分[6]，人參莖葉中含有大量的莖葉皂苷（約7%～16%），其藥理活性也與人參根類似[7]。如果人參葉中的人參皂苷能被充分的利用，不僅能避免了人參葉的浪費，同時也變廢為寶，為人參皂苷的開發(fā)開辟了另一條新途徑。

傳統(tǒng)的人參皂苷提取方法有熱水浸提法[8]、煎煮、浸漬法、超臨界輔助提取法等[9]。近年來，新的提取方法不斷的應用于人參皂苷提取的研究中，目前，微生物發(fā)酵技術用于人參葉皂苷的提取研究鮮見報道。微生物發(fā)酵技術主要是利用微生物在生長代謝過程中分泌的各種生物酶類，破壞植物細胞的結構，使活性成分能夠較大程度溶出，提高提取效率[10]。研究表明，人參作為藥食兩用植物，經(jīng)過發(fā)酵，可以使原有的藥性發(fā)生變化，產(chǎn)生新的人參皂苷或提高人參稀有皂苷的含量，從而提高人參的藥用價值[11]，比如增強或產(chǎn)生新的功效，降低藥物毒性等。本研究以吉林不同產(chǎn)地（長白山、通化市榆林鎮(zhèn)及白山市撫松縣）人參葉為發(fā)酵基質(zhì)，對發(fā)酵高產(chǎn)人參皂苷的菌株進行了篩選，并對發(fā)酵條件及發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，旨在提高發(fā)酵后的人參皂苷含量，拓寬人參葉利用范圍，為人參葉發(fā)酵生產(chǎn)人參皂苷提供理論基礎和數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

人參葉：分別采購于吉林長白山、吉林通化市榆林鎮(zhèn)及吉林懷化白山撫松縣；嗜酸乳桿菌（Lactobacillu acidophilus）CICC 20710、克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）CICC 32845、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC 31393、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GIM 2.43、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）CICC 6226、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BNCC 194165：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 化學試劑

高氯酸（分析純）：天津市鑫源化工有限公司；葡萄糖、果糖（均為分析純）：山東西王生化科技有限公司；蔗糖、乳糖（均為分析純）：安徽金禾實業(yè)股份有限公司；檸檬酸（分析純）：昆山榮之譽精細化工有限公司；醋酸、丙酮酸（均為分析純）：廣州市鴻胤生物科技有限公司；酵母粉、蛋白胨、牛肉膏（均為生化試劑）：北京市奧博星生物技術有限責任公司；人參皂苷Re標準品（純度≥98%）：上海經(jīng)科化學科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基：北京市奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市城東新瑞儀器廠；UV-5100紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；HPX-9272ME恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選用三組不同的新鮮人參葉（A：吉林省長白山；B：通化市榆林鎮(zhèn)；C：白山市撫松縣），流水洗去表面雜質(zhì)，于60 ℃恒溫干燥箱中烘干，粉碎后過60目篩，得人參葉粉，并儲存于低溫、避光、干燥的環(huán)境中，備用。

1.3.2 菌種篩選

乳桿菌及酵母菌均能通過發(fā)酵有效的釋放出人參皂苷，本實驗供試六種菌種，分別是三種乳桿菌[嗜酸乳桿菌（Lactobacillu acidophilus）CICC 20710、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）CICC 6226、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BNCC 194165]及三種酵母菌[克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）CICC 32845、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC 31393、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GIM 2.43]。

菌種活化培養(yǎng)：取酵母菌菌株CICC 31393、CICC 32845、GIM2.43分別接種于200 mL滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 h得到第一代菌懸液。按12%的接種量將一代菌懸液接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h得第二代菌懸液。重復上述步驟28 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，進行第三次活化得到第三代活化菌懸液，即為實驗用菌液，4 ℃冰箱儲存，備用。

1.3.3 分析檢測

人參皂苷Re標準曲線的繪制：參照萬玉華等[12]的方法略作修改。用電子天平精密稱取人參皂苷Re標準品1.5 mg，置10 mL試管中，利用移液槍精確移取6 mL甲醇，使之充分溶解，得到質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的Re標準品溶液。分別取50 μL、100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL、600 μL、700 μL Re標準品溶液于10 mL具塞試管中，75 ℃水浴蒸干，分別加入0.2 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，再加入0.8 mL高氯酸，在60 ℃水浴加熱15 min，迅速用冰水冷卻5 min，加入5 mL冰乙酸，漩渦儀振蕩搖勻，同時做空白對照。以1 cm比色皿在560 nm波長條件下測定其吸光度值[13]。以人參皂苷Re標準溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制人參皂苷Re標準曲線，得到標準曲線回歸方程為y=0.004 8x-0.010 4，相關系數(shù)R2為0.998 2。

樣品人參皂苷含量測定[14]：準確稱取冷凍干燥后的發(fā)酵人參葉粉1.5 mg，置10 mL試管中，加入6 mL甲醇，溶解，得到質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL樣品溶液。取500 μL、600 μL、700 μL樣品溶液，置于10 mL帶塞試管中，在恒溫水浴鍋中75 ℃水浴蒸干，加入0.2 mL 5%的香草醛冰乙酸溶液，再加入0.8 mL高氯酸，60 ℃水浴加熱15 min，冷卻5 min，加入5 mL冰乙酸，漩渦儀振蕩搖勻，同時做空白對照。以1 cm比色皿于560 nm波長條件下測定其吸光度值。按照人參皂苷Re標準曲線回歸方程計算樣品中人參皂苷含量。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

以發(fā)酵后的人參葉皂苷含量為評價指標，分別考察料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））、發(fā)酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、接種量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）以及初始pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）4個因素對發(fā)酵后人參葉皂苷含量的影響，確定最佳發(fā)酵條件。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

參照李昊然[15]的方法，以發(fā)酵后的人參葉皂苷含量為評價指標，考察氮源（蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、蛋白胨＋酵母粉（1∶1）、蛋白胨＋硫酸銨（1∶1））、碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、葡萄糖＋蔗糖（1∶1）、乳糖＋蔗糖（1∶1））、有機酸（醋酸、乳酸、丙酮酸、檸檬酸）及磷鹽（磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀）對人參葉皂苷含量的影響，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3.6 發(fā)酵前后皂苷含量對比

（1）對照實驗

準確稱取人參葉粉9 g，按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸餾水，離心20 min測定上清液吸光度值。

（2）最優(yōu)條件下發(fā)酵

準確稱取人參葉粉9 g，按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸餾水，按發(fā)酵液體積添加酵母粉+蛋白胨1%、果糖2%、丙酮酸0.14%、磷酸氫二鉀0.08%，混勻，得到人參葉發(fā)酵液，調(diào)節(jié)初始pH值為5.0，2組平行實驗。于121 ℃滅菌15 min，冷卻后按發(fā)酵液體積2.0%接種菌株，在30 ℃條件下培養(yǎng)6 d。于50 mL離心管中，4 000 r/min離心20 min，測定上清液吸光度值。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

通過SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，應用GraphPad 8.0軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 不同菌種發(fā)酵對人參皂苷含量的影響

分別選取CICC 20710、CICC 6226、BNCC 194165、CICC 32845、CICC 31393、GIM2.43 六種不同菌種，在自然pH下發(fā)酵，研究人參皂苷產(chǎn)量的差異，結果見圖1。由圖1可知，發(fā)酵后人參葉中的皂苷含量均明顯增加。這表明微生物發(fā)酵能夠有效促進人參葉中皂苷含量的增加。同時，不同菌種發(fā)酵對人參葉中皂苷的釋放是有差異的。釀酒酵母、羅伊氏乳桿菌均能高效的釋放出人參葉中的皂苷，但當發(fā)酵菌種為釀酒酵母CICC 31393時，人參皂苷含量最高。這可能是由于釀酒酵母CICC 31393能夠在人參葉基質(zhì)上良好共生或相互協(xié)同產(chǎn)生豐富的水解酶系，并且釀酒酵母與植物細胞具有很多相同的結構，容易培養(yǎng)，生長周期短，代謝旺盛，能促進人參葉中皂苷的釋放。因此，選擇釀酒酵母CICC 31393為最佳發(fā)酵菌種。

圖1 不同菌種的發(fā)酵對人參皂苷含量的影響Fig.1 Effect of different strains fermentation on ginsenoside contents

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 人參葉發(fā)酵料液比的篩選

影響微生物發(fā)酵的因素很多，料液比會影響底物濃度，進而影響發(fā)酵效率。本實驗選擇不同料液比，考察它們對人參皂苷含量的影響，結果見圖2。由圖2可知，不同料液比對人參皂苷的含量有明顯的差異，隨著料液比的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在料液比為1∶5～1∶10（g∶mL）時，人參皂苷含量逐漸增加；在料液比為1∶10（g∶mL）時，人參皂苷含量最高，為159.73 mg/g；在料液比1∶10～1∶25（g∶mL）時，人參皂苷含量呈下降趨勢。這可能是因為料液比過大時，部分人參葉未能與菌種充分接觸進行發(fā)酵；料液比過小時菌液中溶氧過低菌體不能完全生長繁殖和積累所需的代謝產(chǎn)物，使菌種產(chǎn)酶得能力降低，不能發(fā)酵充分[16]。因此，確定最佳料液比為1∶10（g∶mL）。

圖2 不同料液比對人參皂苷含量的影響Fig.2 Effect of different material and liquid ratio on ginsenoside contents

2.2.2 發(fā)酵溫度的篩選

發(fā)酵溫度是酵母菌正常生理活動的重要因素，適宜的溫度有益于酵母菌的生長，可以提高發(fā)酵速度，增加人參皂苷含量，以發(fā)酵后人參皂苷的含量為標準，分別考察不同發(fā)酵溫度對人參葉中皂苷含量的影響，結果見圖3。

圖3 不同發(fā)酵溫度對人參皂苷含量的影響Fig.3 Effect of different fermentation temperature on ginsenoside contents

由圖3可知，不同發(fā)酵溫度對人參皂苷的含量有顯著的差異，人參皂苷的含量隨發(fā)酵溫度在26～34 ℃之間變化，呈先上升后下降的趨勢。在發(fā)酵溫度為26～30 ℃時，人參皂苷的含量逐漸增加；在發(fā)酵溫度為30 ℃時，人參皂苷的含量最高，為146.96 mg/g；在發(fā)酵溫度高于30 ℃之后，隨著溫度逐漸升高，人參皂苷的釋放量減少，呈現(xiàn)下降的趨勢。這可能是由于溫度較低時微生物生長緩慢[17]，溫度過高又會導致微生物代謝能力下降，活性降低，對微生物的發(fā)酵作用產(chǎn)生不利影響[18]，導致影響了人參皂苷的最終產(chǎn)量。同時，溫度除了直接影響發(fā)酵過程中各種反應速率外[19]，還影響基質(zhì)和氧在發(fā)酵液的溶氧和傳遞速率及某些基質(zhì)的分解吸收速度[20]、生物合成方向等[21]。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.2.3 接種量的篩選

接種量會影響微生物的生長繁殖，從而影響人參皂苷含量。所以適量的接種有利于微生物的生長，以人參皂苷的含量為標準，分別考察不同接種量對人參葉中皂苷含量的影響，結果見圖4。由圖4可知，不同的接種量對發(fā)酵后釋放的人參皂苷含量有顯著的差異，隨著接種量在0.5%～2.5%范圍內(nèi)增加，人參葉中皂苷的含量呈先增加后減少的趨勢。接種量為0.5%～2.0%時人參皂苷含量隨接種量的增加而上升；接種量為2.0%時皂苷的含量最高；接種量＞2.0%之后，皂苷含量隨著接種量的增加而降低，這可能由于微生物數(shù)量出現(xiàn)過飽和的狀態(tài)[22]，接種量過多，接種量過多導致養(yǎng)分不足，菌的繁殖受到限制[23]，代謝緩慢，影響皂苷含量的變化。因此，確定最適接種量為2.0%。

圖4 不同接種量對人參皂苷含量的影響Fig.4 Effect of different inoculum on ginsenoside contents

2.2.4 初始pH值的篩選

pH隨微生物的變化而變化，因此確定相應的pH值對菌體生長和人參皂苷含量的增加具有重要意義。以人參皂苷的含量為標準，分別考察不同初始pH值對人參葉中皂苷含量的影響，結果見圖5。由圖5可知，不同的初始pH值對發(fā)酵后人參皂苷的含量有顯著差異，隨著初始pH值在4.0～6.0范圍內(nèi)逐漸增加，人參皂苷的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當初始pH值為4.0～5.0時，人參葉皂苷的含量逐漸增加；當初始pH值為5.0時，人參葉皂苷的含量達到最高值148.35 mg/g；當初始pH值＞5.0之后，人參皂苷的含量又呈下降的趨勢。pH值是影響發(fā)酵液及代謝產(chǎn)物的物理化學性質(zhì)，初始pH過低或過高均不利于菌體的生長[24]。培養(yǎng)基初始pH對酒釀酵母的生長有一定影響，當初始pH在4.0～5.0范圍內(nèi)酵母生長良好，且在該pH值下酒釀酵母的生長繁殖速度最快。因此，確定最佳初始pH值為5.0。

圖5 不同初始pH值對人參皂苷含量的影響Fig.5 Effect of different initial pH value on ginsenoside contents

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1 不同氮源對人參皂苷含量的影響

氮源是細胞合成產(chǎn)物的重要物質(zhì)，數(shù)量過少，產(chǎn)物合成不足，數(shù)量過多，有可能造成底物抑制，細胞合成酶的數(shù)量降低，從而使菌體產(chǎn)酶活性降低[25]。氮源不僅促進發(fā)酵初期菌體的生長，而且促進發(fā)酵后細胞的生長，并提高人參葉的皂苷含量。本實驗選取不同氮源（添加量為1%），在相同發(fā)酵條件下，考察它們對人參皂苷含量的影響，結果見圖6。

圖6 不同氮源對人參皂苷含量的影響Fig.6 Effect of different nitrogen sources on ginsenoside contents

由圖6可知，在培養(yǎng)基中加入不同氮源對人參葉釋放的皂苷含量影響顯著，當牛肉膏、蛋白胨、酵母粉作為單一氮源加入時，人參皂苷的含量沒有明顯增加，而當?shù)鞍纂耍湍阜郯?∶1比例混合添加作為氮源時，人參皂苷含量最高，這可能是因為蛋白胨中富含氨基酸，而且含有更多的維生素和其他能促使菌體生長的營養(yǎng)因子。酵母浸粉中富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素B、生長因子、微量元素及其他營養(yǎng)物質(zhì)，有助于菌體的生長。兩者結合能較好的發(fā)揮作用，使發(fā)酵充分。因此，選用添加量1%蛋白胨+酵母粉（1∶1）作為最適氮源。

2.3.2 不同碳源對人參皂苷含量的影響

在自然界中大多數(shù)的微生物都可以利用糖類、油脂、有機酸、氨基酸等有機物作為生長所需碳源，可是微生物的種類及其繁多，不同種的微生物之間生理特性是不同的，所以每種微生物生長所需碳源都不一樣。本實驗選取不同碳源（添加量為2%），在相同發(fā)酵條件下，考察它們對人參皂苷含量的影響，結果見圖7。

圖7 不同碳源對人參皂苷含量的影響Fig.7 Effect of different carbon sources on ginsenoside contents

由圖7可知，不同的碳源對人參葉皂苷的含量均有影響，當葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖作為單一的外源碳源時，人參葉中皂苷的含量要明顯高于混合碳源中人參皂苷的含量，而果糖作為單一碳源時，人參皂苷的含量最高，這可能是因為果糖更適合釀酒酵母的代謝利用，促進了菌體繁殖和代謝能力。因此，選用添加量為2%果糖作為最適碳源。

2.3.3 不同有機酸對人參皂苷含量的影響

在本實驗中，醋酸、乳酸、丙酮酸和檸檬酸被選為有機能源，按0.14%添加到培養(yǎng)基中[15]，在相同發(fā)酵條件下，考察它們對人參皂苷含量的影響，結果見圖8。

圖8 不同有機酸對人參皂苷含量的影響Fig.8 Effect of different organic acids on ginsenoside contents

由圖8可知，在培養(yǎng)基中加入不同的有機酸對人參皂苷的含量有明顯差異，當丙酮酸作為外源有機酸加入培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的人參皂苷含量要明顯高于乳酸，檸檬酸和醋酸。因此，選擇選擇0.14%丙酮酸作為最適有機酸。

2.3.4 不同磷酸鹽對人參皂苷含量的影響

本實驗通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中增添磷酸氫二鈉以及磷酸二氫鉀用來補充微量元素，添加量為0.08%[15]，其他發(fā)酵培養(yǎng)基組分不變進行對照實驗，結果見圖9。

圖9 不同磷酸鹽對人參皂苷含量的影響Fig.9 Effect of different phosphate salts on ginsenoside contents

由圖9可知，不同的磷鹽作為外源輔料添加到培養(yǎng)基中對人參皂苷含量的影響不同，磷能夠合成一些很重要的輔酶如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）+、輔酶A（coenzyme A，CoA）等，同時是許多高能磷酸化合物的重要輔料，磷酸鹽主要被應用在發(fā)酵和細菌培養(yǎng)中，因能補充微生物生長所需的磷和鉀，促進糖的新陳代謝和微生物的生長繁殖，所以常被用作外源輔料添加在發(fā)酵培養(yǎng)基中。當磷酸氫二鉀作為磷鹽發(fā)酵人參葉時，人參皂苷的含量最高。這可能是因為在發(fā)酵液中，磷酸鹽能夠調(diào)節(jié)酸堿度，促進發(fā)酵液中的pH達到最適的生長條件，從而能夠在發(fā)酵過程中保持著適宜微生物生長的條件以及產(chǎn)物的合成。因此，選擇添加量為0.08%磷酸氫二鉀作為最適磷鹽。

2.4 最佳發(fā)酵條件及最佳培養(yǎng)基發(fā)酵

在最佳發(fā)酵條件及最佳培養(yǎng)基條件下發(fā)酵，得到人參皂苷含量，結果見圖10。

由圖10可知，通過之前對發(fā)酵條件及培養(yǎng)基組分的篩選，利用選出的最佳條件進行復配，在料液比1∶10（g∶mL），發(fā)酵溫度30 ℃，接種量2.0%，初始pH值為5.0，同時添加外源輔料復配蛋白胨＋酵母粉（1∶1）1%、果糖2%、丙酮酸0.14%、磷酸氫二鉀0.08%的條件下進行發(fā)酵，3個不同產(chǎn)地人參皂苷的含量分別194.25 mg/g、214.57 mg/g、271.75 mg/g，較未發(fā)酵組產(chǎn)量（64.11 mg/g、86.19 mg/g、106.91 mg/g）均分別提高了約2.5倍。

圖10 培養(yǎng)條件優(yōu)化前和優(yōu)化后皂苷含量比較Fig.10 Comparison of ginsenoside contents before and after culture conditions optimization

3 結論

通過微生物發(fā)酵提取技術可提高人參葉皂苷的提取率，篩選得到的最佳發(fā)酵菌種為釀酒酵母CICC 31393，最佳發(fā)酵條件是料液比1∶10（g∶mL），初始pH 值為5.0，發(fā)酵溫度30 ℃，接種量2.0%，發(fā)酵時間6 d；最佳培養(yǎng)基成分為酵母粉＋蛋白胨（1∶1）1%、果糖2%、丙酮酸0.14%、磷酸氫二鉀0.08%，以此培養(yǎng)條件進行發(fā)酵，3個不同產(chǎn)地人參皂苷含量分別為194.25 mg/g、214.57 mg/g、271.75 mg/g，較未發(fā)酵組產(chǎn)量（64.11 mg/g、86.19 mg/g、106.91 mg/g）均分別提高了約2.5倍。微生發(fā)酵法制備人參葉皂苷可大大提高了人參葉皂苷的提取率，條件溫和、無污染，是一種應用前景較好的制備技術。