復(fù)合益生菌發(fā)酵南瓜漿菌株篩選及發(fā)酵工藝優(yōu)化

康三江，袁 晶，張海燕，曾朝珍，宋 娟，張霽紅，慕鈺文

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅 蘭州 730070）

隨著人們保健意識(shí)的提升，益生菌因具有增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)腸道消化系統(tǒng)健康、抑菌消炎等功效愈加受到人們關(guān)注[1-3]。部分乳酸菌具有益生功能，但目前該類(lèi)產(chǎn)品多以乳制品為載體，主要以發(fā)酵乳飲料形式呈現(xiàn)[4]。果蔬因富含糖類(lèi)、維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，越來(lái)越多研究表明，可作為乳酸菌發(fā)酵的良好載體[5-7]。

南瓜（Cucurbita moschataDuch），一年生蔓生草本植物，性溫，味甜適口，富含淀粉、蛋白質(zhì)、胡蘿卜素、多種維生素和礦物質(zhì)，被譽(yù)為“營(yíng)養(yǎng)全能王”[8-10]。南瓜不僅具有較高的食用價(jià)值，因其富含南瓜多糖等多種活性物質(zhì)，還有一定的食療作用，對(duì)心血管疾病、糖尿病等具有一定輔助療效[11-13]。

研究表明，乳酸菌可在南瓜汁中生長(zhǎng)繁殖，在發(fā)酵過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸、氨基酸等活性產(chǎn)物，能夠提高南瓜汁的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[14-16]，并且適宜的菌株復(fù)配后不僅可以彌補(bǔ)單一菌種發(fā)酵的缺陷，而且發(fā)酵效果要優(yōu)于單一菌種發(fā)酵[17-19]。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）在果蔬類(lèi)發(fā)酵食品中普遍存在，具備較好的發(fā)酵果蔬能力[20]。德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）可以產(chǎn)生胞外多糖，具有益生功能。戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）能夠產(chǎn)生γ-氨基丁酸，提高機(jī)體免疫力。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）能夠產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，可加速酸化反應(yīng)，提高發(fā)酵效率，產(chǎn)生發(fā)酵芳香氣味。嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）可以產(chǎn)生細(xì)菌素和維生素等活性代謝產(chǎn)物，提高人體免疫力。腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）可產(chǎn)生左旋糖酐，有降低血液粘稠度，改善微循環(huán)等生理功能。長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）可以調(diào)節(jié)腸道健康，提高機(jī)體免疫力。青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolensentis）可以調(diào)節(jié)慢性腹瀉、便秘等，具有益生功能[21]。

目前，人們多以單菌種發(fā)酵南瓜汁，復(fù)合菌種發(fā)酵南瓜果漿研究較少。本研究以南瓜果漿為原料，充分利用南瓜果漿的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，首先以活菌數(shù)、pH值和可滴定酸為考察對(duì)象，對(duì)8株益生菌進(jìn)行篩選，篩選出活菌數(shù)最高、發(fā)酵能力最強(qiáng)、降酸速度最快、適應(yīng)性最強(qiáng)的菌株[22]，并進(jìn)行菌株復(fù)配試驗(yàn)驗(yàn)證后，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以活菌數(shù)為響應(yīng)值，根據(jù)Box-benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵南瓜漿的發(fā)酵工藝條件，獲得最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)。通過(guò)復(fù)合益生菌發(fā)酵南瓜漿，不僅為獲取益生菌提供新途徑，還可利用發(fā)酵特性提高南瓜漿的生物利用率[23-24]，為開(kāi)發(fā)一種富含益生菌、具有保健功能的蔬菜飲料提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

貝貝南瓜（Cucurbita moschataDuch）：產(chǎn)自甘肅武威市民勤縣；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CICC21824、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）CICC20271、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）CICC24202、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）CICC6075、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）CICC20373、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）CICC23614、長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）CICC6259、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolensentis）CICC6175：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 化學(xué)試劑

纖維素酶（20萬(wàn)U/g）、果膠酶（30萬(wàn)U/g）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；木瓜蛋白酶（20萬(wàn)U/g）：南寧龐博生物工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS固體培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S-CW電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；ZHJH-C112B型超凈工作臺(tái)：上海智城分析儀器制造有限公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BL-75G型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；Scientz-IID超聲波打漿機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；PB-10酸度計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

取超低溫冰箱保存的8株益生菌菌株分別在MRS固體培養(yǎng)基上劃線活化，適宜溫度下恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落于MRS肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)培，活化1～2次。充分活化后的菌液在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，在超凈臺(tái)中用無(wú)菌生理鹽水重懸，備用。

1.3.2 南瓜漿制備

選擇新鮮、成熟南瓜，清洗后去皮、去籽，切成5 mm均勻薄片在沸水中燙漂5 min，按一定比例加入蒸餾水后打漿。打漿后加入0.2%的纖維素酶、0.1%的果膠酶和0.15%的木瓜蛋白酶，50 ℃酶解1 h后，于110 ℃滅菌5 min[25]，迅速冷卻至室溫備用。

1.3.3 菌株篩選

將重懸后的菌液按照6%的接種量（108CFU/mL）分別接種于經(jīng)過(guò)預(yù)處理的南瓜漿中，在菌株最適生長(zhǎng)條件下靜置發(fā)酵，在第0、4、8、12、16、20和24小時(shí)分別取樣，測(cè)定活菌數(shù)、可滴定酸和pH值。

1.3.4 混菌復(fù)配試驗(yàn)

將篩選出的植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌分別以3∶1、1∶1和1∶3（V/V）的比例進(jìn)行復(fù)配，并且以?xún)芍耆樗峋鷨为?dú)發(fā)酵作為對(duì)照，6%的接種量接種于預(yù)處理南瓜漿中，37 ℃靜置發(fā)酵，在第4、8、12、16、20和24 小時(shí)分別取樣，測(cè)定活菌數(shù)、可滴定酸和pH值。

1.3.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

在菌種篩選的基礎(chǔ)上，選擇植物乳桿菌21824和嗜熱鏈球菌20373（1∶1）進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵，以發(fā)酵后的活菌數(shù)、可滴定酸和感官評(píng)分為考察指標(biāo)，分別考察料液比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3（g∶mL）），接種量（2%、4%、6%、8%、10%）（V/V），發(fā)酵溫度（28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃），發(fā)酵時(shí)間（12 h、16 h、20 h、24 h和28 h）對(duì)發(fā)酵南瓜漿的影響。

1.3.6 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）為自變量，以活菌數(shù)（Y）為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)Box-Benhnken試驗(yàn)，Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.7 指標(biāo)測(cè)定和感官評(píng)價(jià)

活菌數(shù)測(cè)定：活菌數(shù)測(cè)定按照國(guó)標(biāo)GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》中的平板計(jì)數(shù)法，結(jié)果以每毫升發(fā)酵液中所含活菌的對(duì)數(shù)值表示，單位為lg（CFU/mL）。

可滴定酸測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》中的酸堿滴定法，結(jié)果以每升發(fā)酵液中乳酸含量表示，單位為mg/mL；pH值測(cè)定：采用酸度計(jì)測(cè)定。

發(fā)酵南瓜漿感官評(píng)價(jià)采用9分制，滿分36分。共邀請(qǐng)9名具有食品感官學(xué)相關(guān)專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行品評(píng)，評(píng)分細(xì)則參考袁晶等[25]的方法，略有修改。感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 發(fā)酵南瓜漿感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table2 Sensory evaluation standards of fermented pumpkin pulp

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)處理和顯著性差異分析用Excel2016和SPSS 24.0軟件，BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)處理用Design-Expert 8.0.6軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜漿發(fā)酵益生菌篩選

2.1.1 不同益生菌發(fā)酵南瓜漿中活菌數(shù)的變化

不同益生菌發(fā)酵南瓜漿過(guò)程中活菌數(shù)變化見(jiàn)圖1。由圖1可知，8株益生菌均可在南瓜漿中生長(zhǎng)，其中，嗜熱鏈球菌適應(yīng)性最強(qiáng)，在發(fā)酵第4小時(shí)時(shí)，活菌數(shù)數(shù)量顯著高于其他菌株，達(dá)到7.46 lg（CFU/mL），說(shuō)明該菌株能快速適應(yīng)南瓜漿環(huán)境；發(fā)酵至第24小時(shí)，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活菌數(shù)為8.52～9.53 lg（CFU/mL）。其中植物乳桿菌活菌數(shù)最高，達(dá)到9.53lg（CFU/mL），隨后依次為嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、腸膜明串株菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和戊糖乳桿菌，活菌數(shù)分別是9.23 lg（CFU/mL）、9.10 lg（CFU/mL）、8.97 lg（CFU/mL）、8.55 lg（CFU/mL）、8.89 lg（CFU/mL）、8.64 lg（CFU/mL）和8.52 lg（CFU/mL）。

圖1 不同益生菌發(fā)酵南瓜漿中活菌數(shù)的變化Fig.1 Change of viable count in pumpkin pulp fermented with different probiotics

2.1.2 不同益生菌發(fā)酵南瓜漿中pH值的變化

8種益生菌發(fā)酵南瓜漿過(guò)程中pH值變化見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，體系pH值均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，在0～8 h發(fā)酵初期，嗜熱鏈球菌發(fā)酵南瓜漿pH降低速度最快，由4.70下降至4.21。在12～28 h發(fā)酵中后期，植物乳桿菌pH值降低最快，變化最顯著，pH值由發(fā)酵第12小時(shí)的4.02下降至3.25。至發(fā)酵結(jié)束（28 h），pH由低到高依次為：植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、戊糖乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜酸乳桿菌、腸膜明串株菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和青春雙歧桿菌，pH值分別為3.25、3.45、3.54、3.56、3.62、3.65、3.89和4.01。

圖2 不同益生菌發(fā)酵南瓜漿中pH值的變化Fig.2 Change of pH value in pumpkin pulp fermented with different probiotics

2.1.3 不同益生菌發(fā)酵南瓜漿中可滴定酸的變化

不同益生菌發(fā)酵過(guò)程南瓜漿中可滴定酸變化見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵體系中的可滴定酸呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。8株益生菌均可在南瓜漿中發(fā)酵產(chǎn)酸，在發(fā)酵初期（0～12 h），嗜熱鏈球菌發(fā)酵南瓜漿中可滴定酸從發(fā)酵前的1.01 mg/mL增長(zhǎng)至2.25 mg/mL，增長(zhǎng)最為顯著，隨后增長(zhǎng)趨于緩慢；發(fā)酵結(jié)束時(shí)（28 h），植物乳桿菌發(fā)酵南瓜漿體系的可滴定酸含量最高，隨后依次為德氏乳桿菌保加利亞亞種、戊糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、腸膜明串株菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和青春雙歧桿菌，可滴定酸含量分別為：4.28 mg/mL、4.15 mg/mL、4.01 mg/mL、3.51 mg/mL、3.78 mg/mL、3.40 mg/mL、3.01 mg/mL和2.95 mg/mL。說(shuō)明在適應(yīng)環(huán)境后，植物乳桿菌發(fā)酵能力最強(qiáng)，能大量產(chǎn)酸。

圖3 不同益生菌發(fā)酵南瓜漿中可滴定酸的變化Fig.3 Change of titratable acid in pumpkin pulp fermented with different probiotics

綜上所述，篩選出活菌數(shù)最高、發(fā)酵能力最強(qiáng)的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CICC21824和降酸速度最快、適應(yīng)性最強(qiáng)的菌株嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）CICC20373發(fā)酵南瓜漿。

2.2 混菌發(fā)酵南瓜漿中活菌數(shù)、pH值、可滴定酸的變化

選擇植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌進(jìn)行單獨(dú)及復(fù)配發(fā)酵，植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和復(fù)合菌發(fā)酵南瓜漿中活菌數(shù)、pH值、可滴定酸變化見(jiàn)圖4。由圖4可知，將植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌復(fù)配發(fā)酵南瓜漿后，比起單一菌種發(fā)酵而言，復(fù)合菌可互利共生，促進(jìn)生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酸，并且在復(fù)配比為1∶1（V/V）時(shí)，發(fā)酵效果最佳。嗜熱鏈球菌適應(yīng)能力最強(qiáng)，降低pH值速度最快，在南瓜漿發(fā)酵體系中，它能迅速生長(zhǎng)繁殖并且產(chǎn)酸，使南瓜漿快速進(jìn)入低pH值狀態(tài)，抑制酵母菌等雜菌生長(zhǎng)，為其他乳酸菌提供良好生長(zhǎng)環(huán)境[26]；發(fā)酵中后期，植物乳桿菌作為后期主要發(fā)酵菌種，生長(zhǎng)繁殖良好，產(chǎn)酸量高。因此，選擇植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌進(jìn)行1∶1（V/V）復(fù)配發(fā)酵南瓜漿。

圖4 植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌及混菌發(fā)酵南瓜漿中活菌數(shù)（A）、pH值（B）、可滴定酸（C）的變化Fig.4 Changes of viable count (A),pH value (B) and titratable acid (C) in pumpkin pulp fermented with Lactobacillus plantarum,Streptococcus thermophilus and mixed strains

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.3.1 料液比對(duì)發(fā)酵南瓜漿中活菌數(shù)、可滴定酸和感官評(píng)分的影響

料液比對(duì)發(fā)酵南瓜漿活菌數(shù)、可滴定酸和感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著料液比在3∶1～1.3（g∶mL）范圍內(nèi)變化，發(fā)酵體系中的活菌數(shù)、可滴定酸和感官評(píng)分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶1（g∶mL）時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大值9.89lg（CFU/mL），此時(shí)可滴定酸含量為4.73mg/mL，感官評(píng)分也最高；而隨著料液比的繼續(xù)增加，活菌數(shù)和可滴定酸呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，并且此時(shí)發(fā)酵南瓜漿組織過(guò)于稀薄，口感寡淡，感官評(píng)分較低。因此，選擇最適料液比為1∶1（g∶mL）。

圖5 料液比對(duì)發(fā)酵南瓜漿活菌數(shù)、可滴定酸和感官評(píng)分的影響Fig.5 Effect of solid and liquid ratio on viable count,titratable acid and sensory evaluation of fermented pumpkin pulp

2.3.2 接種量對(duì)發(fā)酵南瓜漿中活菌數(shù)、可滴定酸和感官評(píng)分的影響

接種量對(duì)發(fā)酵南瓜漿活菌數(shù)、可滴定酸和感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知，隨著接種量在2%～10%（V/V）范圍內(nèi)的增加，發(fā)酵體系中的活菌數(shù)、可滴定酸和感官評(píng)分呈現(xiàn)先升高后趨于平緩的趨勢(shì)。當(dāng)接種量為6%（V/V）時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大值9.75 lg（CFU/mL），感官評(píng)分也最高；當(dāng)接種量為10%時(shí)，可滴定酸達(dá)到最大值5.25 mg/mL。但接種量過(guò)大易導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)快，口感過(guò)酸[27]。因此，選擇最適接種量為6%（V/V）。

圖6 接種量對(duì)發(fā)酵南瓜漿活菌數(shù)、可滴定酸和感官評(píng)分的影響Fig.6 Effect of inoculum on viable count,titratable acid and sensory evaluation of fermented pumpkin pulp

2.3.3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵南瓜漿中活菌數(shù)、可滴定酸和感官評(píng)分的影響

發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵南瓜漿活菌數(shù)、可滴定酸和感官評(píng)分的影響如圖7所示。由圖7可知，發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)酸量影響較大。隨著發(fā)酵溫度在28～40 ℃范圍內(nèi)的升高，發(fā)酵體系中的活菌數(shù)和可滴定酸呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度為34 ℃時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大值9.85 lg（CFU/mL），可滴定酸達(dá)到最大值4.75 mg/mL，感官評(píng)分為31.5分。當(dāng)發(fā)酵溫度升高至37 ℃時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最大值31.8分，但與34 ℃時(shí)的感官評(píng)分差異不顯著?；诠?jié)約能源考慮，選擇發(fā)酵溫度34 ℃為最適發(fā)酵溫度。

圖7 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵南瓜漿活菌數(shù)、可滴定酸和感官評(píng)分的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on viable count,titratable acid and sensory evaluation of fermented pumpkin pulp

2.3.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵南瓜漿活菌數(shù)、可滴定酸和感官評(píng)分的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵南瓜漿活菌數(shù)、可滴定酸和感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖8。由圖8可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在12～28 h范圍內(nèi)的延長(zhǎng)，發(fā)酵體系中的活菌數(shù)呈現(xiàn)先升高后趨于平緩的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，體系中乳酸菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期，活菌數(shù)達(dá)到最大值9.85 lg（CFU/mL）；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞24 h之后趨于穩(wěn)定；可滴定酸隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)不斷累積增加，但產(chǎn)酸過(guò)多會(huì)造成乳酸菌發(fā)生自溶，不利于乳酸菌生長(zhǎng)[28]，并且太長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間會(huì)導(dǎo)致口感過(guò)酸，感官評(píng)分降低，因此，選擇最適發(fā)酵時(shí)間為24 h。

圖8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵南瓜漿活菌數(shù)、可滴定酸和感官評(píng)分的影響Fig.8 Effect of fermentation time on viable count,titratable acid and sensory evaluation of fermented pumpkin pulp

2.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）為自變量，以活菌數(shù)（Y）為響應(yīng)值，同時(shí)結(jié)合感官評(píng)價(jià)，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Design and results of Box-Benhnken experiment

續(xù)表

對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，獲得響應(yīng)值活菌數(shù)（Y）的回歸模型方程式為：

Y=9.84-0.16A+0.072B-0.034C+0.032D+0.068AB-0.087AC+0.045AD-0.12BC+0.018BD+0.12CD-0.16A2-0.003B2-0.15C2-0.15D2

由表4可知，該模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），模型決定系數(shù)R2為0.965 4，校正決定系數(shù)R2adj為0.925 1，說(shuō)明模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合度較好，可用于實(shí)際生產(chǎn)推測(cè)。由F值可得各因素對(duì)發(fā)酵南瓜漿中活菌數(shù)含量的影響程度從強(qiáng)到弱依次為料液比＞接種量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間。由P值可得，一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)AC、BC、CD，二次項(xiàng)A2、C2、D2對(duì)活菌數(shù)影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)C、D、交互項(xiàng)AB對(duì)活菌數(shù)影響顯著（P＜0.05）。

表4 回歸模型方差分析Table4 Variance analysis of regression model

4個(gè)因素交互作用對(duì)結(jié)果影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖9。由圖9可知，活菌數(shù)隨著料液比的加大、發(fā)酵溫度的升高、發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，并在料液比為1.1∶1～1.4∶1（g∶mL），發(fā)酵溫度為33.4～35.4 ℃，發(fā)酵時(shí)間為22～26 h的范圍內(nèi)含量較高；隨著接種量的增加，活菌數(shù)呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢(shì)，在接種量為7%～8%，發(fā)酵溫度為33～35 ℃區(qū)間內(nèi)，活菌數(shù)含量最高。

圖9 料液比、接種量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度交互作用對(duì)活菌數(shù)影響的響應(yīng)面及等高線Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between solid and liquid ratio,inoculum,fermentation time and temperature on viable count

經(jīng)過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件處理后，得到復(fù)合益生菌發(fā)酵南瓜漿的最佳工藝條件為：料液比1.26∶1（g∶mL），接種量7.81%（V/V），發(fā)酵溫度32.93 ℃，發(fā)酵時(shí)間為24.39 h。在該條件下，預(yù)測(cè)發(fā)酵南瓜漿的活菌數(shù)為9.93 lg（CFU/mL）。為便于實(shí)際操作同時(shí)結(jié)合感官評(píng)價(jià)，將發(fā)酵工藝修改為料液比為1∶1（g∶mL），接種量為7.8%（V/V），發(fā)酵溫度為33 ℃，發(fā)酵時(shí)間為24 h。在此最佳發(fā)酵工藝條件下，活菌數(shù)為9.89 lg（CFU/mL），與模型預(yù)測(cè)值較為吻合。

3 結(jié)論

本研究首先篩選出發(fā)酵能力最強(qiáng)、活菌數(shù)最高的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CICC21824和降酸速度最快、適應(yīng)性最強(qiáng)的嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）CICC20373的兩株益生菌菌株，繼而按照1∶1的比例進(jìn)行復(fù)合益生菌復(fù)配試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以活菌數(shù)為響應(yīng)值，利用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化南瓜漿發(fā)酵工藝參數(shù)。最后確定復(fù)合益生菌發(fā)酵南瓜漿的最佳工藝條件為：料液比1∶1（g∶mL），接種量7.8%（V/V），發(fā)酵溫度33 ℃，發(fā)酵時(shí)間24 h。在此最佳發(fā)酵工藝條件下，活菌數(shù)為9.89 lg（CFU/mL）。南瓜漿發(fā)酵飲品色澤金黃，感官評(píng)分較高，具有發(fā)酵產(chǎn)品特有風(fēng)味，無(wú)異味。本研究為開(kāi)發(fā)益生菌產(chǎn)品和南瓜類(lèi)加工產(chǎn)品提供新思路，為后續(xù)研發(fā)南瓜發(fā)酵類(lèi)產(chǎn)品提供實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)。