同位素稀釋-氣相色譜/質(zhì)譜法測(cè)定嬰幼兒輔食中四種呋喃類化合物

李鳳華，鄭鳳家，曹艷平，李 蔚，王 林，辛成龍

（山東大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院，山東省疾病預(yù)防控制中心，山東濟(jì)南 250014）

呋喃及甲基呋喃（2-甲基呋喃、3-甲基呋喃、2,5-二甲基呋喃）是一類無色、易揮發(fā)的小分子化合物，具有麻醉和刺激性，有毒且易燃，吸入后可引起頭痛、頭暈、惡心、呼吸衰竭[1?2]。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)研究認(rèn)為，呋喃對(duì)人類具有潛在的致癌性，將呋喃歸為2B類致癌物[3?4]。呋喃的檢測(cè)和評(píng)估一直是國(guó)內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)關(guān)注的熱點(diǎn)，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（US FDA）和歐盟食品安全局（EFSA）等權(quán)威機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)多種食品中存在呋喃[5?8]。呋喃可由抗壞血酸、氨基酸、碳水化合物、不飽和脂肪酸等前體物質(zhì)產(chǎn)生[9?10]，廣泛存在于咖啡、罐頭等食品中[11?15]。而2-甲基呋喃、3-甲基呋喃、2,5-二甲基呋喃與呋喃性質(zhì)類似，都可能由食品在熱加工過程中產(chǎn)生，且來源與食物中呋喃的形式相同，對(duì)人與動(dòng)物都具有相似的毒性。

到目前為止，甲基呋喃國(guó)內(nèi)研究的較少，有關(guān)食品和飲料甚至嬰幼兒食品中的含量信息有限。EFSA在2017年風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估過程中針對(duì)食品中呋喃、2-甲基呋喃、3-甲基呋喃、2,5-二甲基呋喃四種呋喃類化合物進(jìn)行評(píng)估，但是只得到了呋喃的分析結(jié)果，并未獲得其它三種甲基呋喃的數(shù)據(jù)，專家組經(jīng)過評(píng)估發(fā)現(xiàn)，對(duì)于嬰兒食品，主要的呋喃暴露途徑為即食食品，由于這類食品大多經(jīng)過高溫處理和密閉封裝，呋喃的含量水平較高[16?18]，而嬰幼兒的食物比較單一，可能為呋喃及甲基呋喃的高暴露人群。因此需要建立合適的方法，收集更多關(guān)于食品中呋喃及甲基呋喃類化合物含量的數(shù)據(jù)以便進(jìn)行人體健康風(fēng)險(xiǎn)的暴露評(píng)估。

目前針對(duì)呋喃的測(cè)定研究比較多，應(yīng)用的方法主要是電化學(xué)分析法[19]、頂空氣相色譜-質(zhì)譜法[20?22]和頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法[23?26]。由于呋喃、甲基呋喃分子量小，易揮發(fā)，定量容易受到基質(zhì)干擾，頂空進(jìn)樣是分析此類化合物的最合適的方法。本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化頂空氣相色譜-質(zhì)譜條件，利用頂空裝置將樣品中的目標(biāo)化合物提取出來，消除基質(zhì)干擾，采用氣相色譜分離，質(zhì)譜定性定量，建立了同時(shí)測(cè)定嬰幼兒輔助食品中四種呋喃類化合物的方法，并應(yīng)用本方法對(duì)市售嬰幼兒輔食中的四種呋喃類化合物的含量狀況進(jìn)行了調(diào)查，為食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估監(jiān)測(cè)研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嬰幼兒輔食 按照國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求采集市售嬰幼兒輔食樣品共139份，包括26份餅干，10份米粉，13份蛋糕，75份水果泥，15份肉（魚）泥，均為定型包裝樣品；甲醇 色譜純，德國(guó)Merck公司；氯化鈉 優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)；試驗(yàn)用水Millipore純水機(jī)制取超純水；標(biāo)準(zhǔn)品呋喃（100μg/mL）、D4-呋喃（100μg/ mL）、3-甲基呋喃、2,5-二甲基呋喃德國(guó)Dr.公司；2-甲基呋喃、D3-3-甲基呋喃、D3-2,5-二甲基呋喃 加拿大TRC公司；D6-2-甲基呋喃 加拿大CDN Isotopes公司。

Thermo Trace1310-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀配有EI源、Triplus三合一（液體、頂空、固相微萃?。┳詣?dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)Thermo公司；Millipore—Q超純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司；精密移液器 美國(guó)Thermo公司；Vortex-Genie2渦旋混勻器 美國(guó)Scientific公司；Sartorius CPA225D電子天平 德國(guó)Sartorius公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 餅干和蛋糕樣品放入?20℃冷凍2 h，用食品粉碎機(jī)粉碎，?20℃密封冷凍保存并盡快測(cè)定，其余樣品在分析前放入4℃冰箱中冷藏過夜。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制3種甲基呋喃混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別稱取2-甲基呋喃、3-甲基呋喃、2,5-二甲基呋喃標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，0～8℃避光保存。

D6-2-甲基呋喃、D3-3-甲基呋喃、D3-2,5-二甲基呋喃混合同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液的配制：分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇配制成濃度為100μg/ mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，0～8℃避光保存。

高濃度呋喃及甲基呋喃混合標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制：移取呋喃及3種甲基呋喃混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻，配制成1.0μg/mL的4種混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，0～8℃避光保存。

低濃度呋喃及甲基呋喃混合標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制：移取高濃度混合標(biāo)準(zhǔn)使用液1.0 mL，加入甲醇稀釋定容至10.0 mL，配制成濃度為0.1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，0～8℃避光保存。

同位素內(nèi)標(biāo)混合溶液的配制：移取D4-呋喃及甲基呋喃混合同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋并定容至50.0 mL，配制成濃度為1.0μg/mL的同位素內(nèi)標(biāo)混合使用液，0～8℃避光保存。

1.2.3 樣品測(cè)定 迅速稱取4℃冷藏過夜的混勻固體樣品1.0 g（精確至0.01 g），罐裝半固體樣品2.50 g（精確至0.01 g）于20 mL頂空瓶中，加入10 mL 20%氯化鈉溶液，加入濃度為1.0μg/mL的4種內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL，并立即蓋上頂空瓶蓋子，混勻，放置到頂空進(jìn)樣裝置上，GC/MS自動(dòng)進(jìn)樣分析，結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的三次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值計(jì)算。

1.2.4 色譜質(zhì)譜條件

1.2.4.1 頂空條件 頂空孵化室平衡溫度60℃，加熱時(shí)間30 min；進(jìn)樣針溫度：70℃。

1.2.4.2 色譜條件 HP-PLOTQ毛細(xì)管色譜柱：30 m×0.32 mm（內(nèi)徑）×20μm（膜厚）；進(jìn)樣口溫度：200℃；程序升溫：初溫60℃，保持1 min，以10℃/min升至230℃，保持2 min；載氣：氦氣，流速：1.7 mL/min；分流進(jìn)樣，分流比3:1。

1.2.4.3 質(zhì)譜條件 離子源：電子轟擊（EI）離子源，電子能量70 eV；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：280℃；溶劑延遲10 min；檢測(cè)方式：選擇離子（SIM）掃描。保留時(shí)間及監(jiān)測(cè)離子參數(shù)見表1。

表1 四種呋喃類化合物及同位素內(nèi)標(biāo)SIM模式下檢測(cè)條件Table 1 Selected ion monitoring (SIM)conditions for the determination of furans

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 線性關(guān)系、檢出限與定量限的考察 取8個(gè)20 mL頂空進(jìn)樣瓶，分別加入10 mL 20%氯化鈉溶液，1.0μg/mL 4種內(nèi)標(biāo)混合應(yīng)用液100μL，依次加入不同體積的高低濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，制成含1.0、3.0、5.0、10.0、20.0、40.0、100和200 ng的標(biāo)準(zhǔn)系列，GC/MS進(jìn)樣分析，以不同濃度的各目標(biāo)物的峰面積與其內(nèi)標(biāo)峰面積比值對(duì)應(yīng)相應(yīng)的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照三倍信噪比（3 S/N）計(jì)算檢出限，10倍信噪比（10 S/N）為定量限，確定四種呋喃類化合物的檢出限和定量限。

1.2.5.2 加標(biāo)回收率、精密度試驗(yàn) 精密稱取已知含量不同種類的嬰幼兒輔食樣品適量，進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)，分別添加三個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理和測(cè)定，每個(gè)濃度平行測(cè)定6次，計(jì)算其加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，應(yīng)用儀器配置工作站Xcalibur系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集處理，并使用excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離條件的優(yōu)化

根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)物呋喃及甲基呋喃的特點(diǎn)和色譜柱的性質(zhì)以及查閱文獻(xiàn)，本試驗(yàn)選擇了HP-PLOTQ色譜柱。將配制好的濃度為1.0μg/mL的單標(biāo)溶液按照方法進(jìn)行全掃描采集，確定8個(gè)目標(biāo)物的定性定量離子，并采用選擇離子掃描方式（SIM）分段采集檢測(cè)不同保留時(shí)間的待測(cè)物，以提高樣品檢測(cè)的靈敏度并消除部分雜質(zhì)的干擾。通過優(yōu)化色譜分離條件，獲得最優(yōu)的色質(zhì)譜儀器條件。應(yīng)用已建立的方法，SIM監(jiān)測(cè)模式下四種呋喃及同位素內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of mixed standardssolution

2.2 頂空條件的優(yōu)化

由于頂空孵育平衡溫度和時(shí)間的選擇直接影響樣品中四種呋喃類化合物定量的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)按照方法將四種呋喃類化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入頂空瓶中，使得頂空瓶中四種目標(biāo)化合物的加入量為100 ng，將頂空瓶密封好后分別在40、50、60、70、80℃的溫度下平衡30 min，分析四種目標(biāo)化合物的峰面積，結(jié)果見圖2a。結(jié)果表明，四種目標(biāo)化合物在60℃下回收最好，確定選擇樣品的平衡溫度為60℃。

另外將頂空瓶密封好后分別在60℃下平衡15、20、30、40、50 min，分析四種呋喃類化合物的峰面積，發(fā)現(xiàn)平衡時(shí)間20～50 min，峰面積沒有明顯的改變，見圖2b。因此選擇樣品的平衡時(shí)間為30 min。

圖2 頂空參數(shù)的優(yōu)化Fig.2 Optimization of HS parameters

2.3 無機(jī)鹽氯化鈉濃度的選擇

本試驗(yàn)考察了不加氯化鈉，加入10%氯化鈉和20%氯化鈉對(duì)各目標(biāo)物峰面積的影響，發(fā)現(xiàn)頂空分析中加入氯化鈉，各目標(biāo)物的峰面積均有成倍的增長(zhǎng)，見圖3。且線性關(guān)系良好，說明加入氯化鈉可以促進(jìn)樣品中的目標(biāo)物進(jìn)入頂空相，所以本試驗(yàn)確定加入20%氯化鈉以提高檢測(cè)方法的靈敏度。

圖3 無機(jī)鹽氯化鈉濃度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of NaCl concentration

2.4 定量方法的選擇

由于氘代同位素內(nèi)標(biāo)與目標(biāo)物有相似的物理化學(xué)性質(zhì)，因此在樣品分析的過程中，加入氘代同位素內(nèi)標(biāo)能校正分析過程中各種因素對(duì)待測(cè)目標(biāo)物的影響，提高了檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線法兩種方法測(cè)定嬰幼兒餅干、米粉、蛋糕、水果泥和肉泥中四種呋喃類化合物含量的平均結(jié)果（平行測(cè)定三次）見表2。由5種不同基質(zhì)樣品的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比表明標(biāo)準(zhǔn)加入法和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線法兩種方法沒有顯著性差異，證明兩種定量方法基本等效，為了避免重復(fù)樣品操作的繁瑣，提高分析的效率，當(dāng)分析測(cè)定大批量樣品時(shí)，推薦采用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

表2 標(biāo)準(zhǔn)加入法和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線法定量樣品中四種呋喃的檢測(cè)平均結(jié)果（n=3）Table 2 Resultsof 4 furansin sampleswith standard addition method and solvent standard curvemethod (n=3)

2.5 工作曲線和檢出限、定量限

以目標(biāo)物的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物的峰面積與同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果表明，各化合物在1～200 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表3。以3倍信噪比（3 S/N）和10倍信噪比（10 S/N）計(jì)算方法的檢出限和定量限，餅干、米粉、蛋糕稱取1.00 g，4種化合物的檢出限均為0.2μg/kg，定量限為0.5μg/kg；水果泥和肉泥稱取2.5 g，檢出限均為0.1μg/kg，定量限為0.3μg/kg。

表3 線性參數(shù)Table3 Linearity parameters

2.6 精密度與回收率試驗(yàn)

分別稱取一定質(zhì)量的餅干、米粉、蛋糕、果泥、肉泥樣品，加入不同質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照方法處理，使得添加水平相當(dāng)于樣品中10、40、200 ng，測(cè)定不同基底樣品高低濃度的回收率，結(jié)果見表4。不同基底樣品高低濃度的加標(biāo)回收率為81.6%～110.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）為3.44%～14.2%，說明方法具有良好的回收率與精密度。

表4 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 4 Results of test for precision and recovery (n=6)

2.7 實(shí)際樣品的檢測(cè)

利用已建立的方法，采集市售的嬰幼兒輔食樣品共139份，其檢出結(jié)果見表5，所有樣品檢出率最高的是呋喃，為98.6%。肉泥樣品中檢出四種目標(biāo)物的中位值最大，其中一份餅干樣品中呋喃和2-甲基呋喃的含量最高，分別達(dá)到了177.2和313.4μg/kg。

表5 樣品中四種呋喃類化合物的檢測(cè)結(jié)果Table5 Detection resultsof 4 furansin 139 samples

3 結(jié)論

本文建立了同位素稀釋-頂空氣相色譜/質(zhì)譜法檢測(cè)嬰幼兒輔食中四種呋喃類化合物的檢測(cè)方法。通過優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜條件以及樣品前處理方法，目標(biāo)化合物得到完全分離，線性關(guān)系良好，而且方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，準(zhǔn)確、可靠，適用于嬰幼兒輔食樣品中呋喃及甲基呋喃類化合物的檢測(cè)，滿足此類樣品污染狀況調(diào)查工作開展的要求，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)可以為制定食品安全標(biāo)準(zhǔn)和嬰幼兒人群膳食暴露評(píng)估提供數(shù)據(jù)支持。