生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)克氏原螯蝦細(xì)菌群落多樣性的影響

李雪紅，李述剛，石鋼鵬，羅小瑩，康 峻，蘇 靜，汪 蘭

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心，農(nóng)產(chǎn)品加工研究分中心，湖北武漢 430064；2.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢 430064；3.湖北潛網(wǎng)生態(tài)小龍蝦產(chǎn)業(yè)園集團(tuán)有限公司，湖北潛江 433100）

小龍蝦學(xué)名克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），是中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要物種之一。近年來(lái)，小龍蝦養(yǎng)殖面積和養(yǎng)殖產(chǎn)量持續(xù)增長(zhǎng)。根據(jù)2020年小龍蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展報(bào)告，2019年我國(guó)小龍蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)208.96萬(wàn)噸，與2018年相比，同比增長(zhǎng)27.52%[1]。小龍蝦-稻田循環(huán)系統(tǒng)是小龍蝦主要養(yǎng)殖方式[2]，在此生態(tài)系統(tǒng)中，生產(chǎn)力、養(yǎng)分循環(huán)及水質(zhì)離不開(kāi)環(huán)境微生物的作用[3]。小龍蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中細(xì)菌群落組成對(duì)小龍蝦體內(nèi)細(xì)菌微生物區(qū)系有很大影響，體內(nèi)微生物區(qū)系在動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)、免疫及抗病等方面發(fā)揮重要作用[4]。池塘底泥中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在水生生物的生長(zhǎng)過(guò)程中承擔(dān)著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的再循環(huán)作用，因此菌落結(jié)構(gòu)復(fù)雜。秦偉等[5]發(fā)現(xiàn)在池塘底泥中變形菌門(mén)是克氏原螯蝦的主要優(yōu)勢(shì)菌群，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的變化，底泥中菌群的豐富度及多樣性逐漸降低，而長(zhǎng)毛對(duì)蝦的養(yǎng)殖水體中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群為藍(lán)細(xì)菌，芽孢桿菌在目分類(lèi)水平上占有較高比例[6]。研究發(fā)現(xiàn)，小龍蝦攜帶的沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌及副溶血性弧菌等致病菌與其生活的水體環(huán)境密切相關(guān)[7?8]。

基因組測(cè)序和高通量測(cè)序（High-through putsequencing,HST）技術(shù)在描述多樣性環(huán)境中的微生物群落方面取得了突破性進(jìn)展[9?10]。基因組學(xué)克服了傳統(tǒng)微生物分離鑒定技術(shù)，采用直接提取DNA的方法檢測(cè)微生物菌落的多樣性，利用基因組序列分析對(duì)比結(jié)果，對(duì)微生物進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)[11]。Illumina MiSeq測(cè)序儀已被用于16SrRNA序列研究，能夠更好地檢測(cè)和分析自然界中的次優(yōu)勢(shì)菌和稀有細(xì)菌分類(lèi)群[12?13]。16S rRNA高通量測(cè)序分析表明[14]，變形桿菌、類(lèi)桿菌和梭桿菌是克氏原螯蝦腸道微生物區(qū)系中的優(yōu)勢(shì)菌群，其中變形桿菌參與土壤中碳、氮的循環(huán)。湯純等[15]運(yùn)用Illumina Miseq宏基因組探究了小龍蝦不同部位的菌相組成發(fā)現(xiàn)，在小龍蝦尾肉中主要微生物為希瓦氏菌屬、擬桿菌屬，并發(fā)現(xiàn)水體環(huán)境可能對(duì)小龍蝦攜帶的菌群多樣性影響較高。

目前關(guān)于小龍蝦微生物的研究主要集中于養(yǎng)殖水體中的微生物多樣性及小龍蝦腸道微生物菌落結(jié)構(gòu)研究，關(guān)于生長(zhǎng)水體及土壤對(duì)小龍蝦微生物群落的影響研究較少。本文以小龍蝦生長(zhǎng)環(huán)境周?chē)耐寥兰八w為研究對(duì)象，采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析生長(zhǎng)環(huán)境中水體、土壤及小龍蝦細(xì)菌群落組成，探討?zhàn)B殖水體及周?chē)寥乐形⑸锶郝渑c小龍蝦細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的關(guān)系，為改善小龍蝦養(yǎng)殖環(huán)境，提高小龍蝦的食用安全性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

活克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）（體長(zhǎng)8～9 cm，體重30±5 g）2018年7月、8月、9月采集于武漢農(nóng)科院養(yǎng)殖基地；土壤2018年采集于武漢農(nóng)科院養(yǎng)殖基地；水樣 2018年采集于武漢農(nóng)科院養(yǎng)殖基地；微孔濾膜直徑47 mm Millipore，USA；DNA分離試劑盒QIAGENSrl Milan，Italy。

SPX-150B-Z型恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；TP600梯度PCR儀 日本Takara Bio Inc；TGL-18M臺(tái)式冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集和DNA的提取 小龍蝦在養(yǎng)殖基地采集后30 min內(nèi)用冰袋運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理，將蝦分為三組（C1、C2、C3），尾肉使用液氮速凍后于-80℃下冷藏用于DNA提??；小龍蝦養(yǎng)殖基地的土壤采集參考伍一寧[16]的方法，利用五點(diǎn)取樣法進(jìn)行土壤采樣，去除土壤表面的植被及掉落物，取深度0～10 cm的土壤，過(guò)10目篩后混合均勻，分為五組（S1、S2、S3、S4、S5），保存于?80℃冰箱用于DNA提取；水樣使用滅菌處理后的塑料桶采集，每組樣品獨(dú)立采集三份后混合均勻[17]，于實(shí)驗(yàn)室經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后，將濾膜轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，分為五組（S1、S2、S3、S4、S5），于?80℃保存。按照Power Food微生物DNA分離試劑盒（QIAGENSrl，Milan，Italy）的方法進(jìn)行樣品總DNA提取，將其保存于?80℃冰箱中。提取的基因組委托北京博云華康基因科技有限公司進(jìn)行樣品檢測(cè)。

1.2.2 序列質(zhì)控及生物信息學(xué)分析 檢測(cè)合格的樣品構(gòu)建文庫(kù)，合格的文庫(kù)進(jìn)行cluster制備，利用Illumina平臺(tái)（Hiseq或Miseq）進(jìn)行Paired-end測(cè)序，用下機(jī)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)的生物信息分析。對(duì)數(shù)據(jù)過(guò)濾，獲得高質(zhì)量的Cleandata，通過(guò)reads之間的Overlap關(guān)系將reads拼接成Tags。序列拼接使用軟件FLASH（Fast Length Adjustment of Shortreads，v1.2.11），利用重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的reads組裝成一條序列，拼接條件設(shè)置為：最長(zhǎng)匹配長(zhǎng)度15 bp，重疊區(qū)域允許錯(cuò)配率為0.1，得到高變區(qū)的Tags。利用軟件USEARCH（v7.0.1090）將拼接好的Tags在97%相似度下將其聚類(lèi)為用于物種分類(lèi)的可操作分類(lèi)單元（Operational Taxonomic Units,OTU）。利用UCHIME（v4.2.40）[18]將PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的嵌合體從OTU代表序列中去除；使用usearch_global方法將所有Tags比對(duì)回OTU代表序列，得到每個(gè)樣品在每個(gè)OTU的豐度統(tǒng)計(jì)表[19]。根據(jù)每個(gè)樣品的OTU豐度文件，計(jì)算每個(gè)樣品或組別具有的OTU（不考慮OTU豐度，只考慮OTU有無(wú)），通過(guò)Venn圖，展示樣品間或組間共有及特有OTU情況。根據(jù)每個(gè)樣品OTU在每個(gè)樣品的豐度文件計(jì)算出每個(gè)OTU在每個(gè)樣品的相對(duì)豐度，利用這個(gè)豐度信息進(jìn)行OTU的PCA分析；通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)OTU進(jìn)行物種分類(lèi)并分別在門(mén)、綱、目、科、屬、幾個(gè)分類(lèi)等級(jí)對(duì)各個(gè)樣品作物種Profiling面積圖和柱狀圖，從綱水平開(kāi)始，將物種豐度在所有樣品均低于0.5%的物種全部合并成Others。最后使用Mothur（v1.31.2）軟件計(jì)算樣品的Alpha多樣性值，包括Observed species指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)，Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)。前4個(gè)指數(shù)越大，最后一個(gè)指數(shù)越小，說(shuō)明樣品中的物種越豐富。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用軟件Metastats（http://metastats.cbcb.umd.edu/）（默認(rèn)）或者R軟件（秩和檢驗(yàn)，F(xiàn)isher’s精確檢驗(yàn)，卡方檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)，方差檢驗(yàn)）進(jìn)行組間顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及豐度

利用測(cè)序獲得不同樣品的原始序列數(shù)據(jù)后，對(duì)序列進(jìn)行拼接優(yōu)化，每組樣品中測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)如下（表1），小龍蝦、土壤、水體的有效序列分別為77858～95353、47921～74143、61734～90037條，進(jìn)而對(duì)樣品序列進(jìn)行聚類(lèi)分析，在97%相似的水平下進(jìn)行OTU生物信息統(tǒng)計(jì)，三組樣品中的OTUs總數(shù)分別為2548～2635個(gè)、3274～3737個(gè)、1789～2648個(gè)。小龍蝦中OTUs數(shù)量較土壤中OTUs數(shù)量顯著（P<0.05）減少，說(shuō)明小龍蝦細(xì)菌多樣性低于土壤細(xì)菌多樣性。

表1 測(cè)序結(jié)果及質(zhì)量分析Table 1 Sequencing results and quality analysis

2.2 多樣性指數(shù)分析

通過(guò)單樣本多樣性（Alpha）分析反映微生物群落的豐度和多樣性。樣品中群落的豐富度可由Observed species指數(shù)、Chao指數(shù)和ACE指數(shù)來(lái)反映[20]，簡(jiǎn)單指群落中物種的數(shù)量，而不考慮群落中每個(gè)物種的豐度情況；Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)反映群落的多樣性（Species diversity），受樣品群落中物種豐富度（Species richness）和物種均勻度（Species evenness）的影響。相同物種豐富度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認(rèn)為群落具有越大的多樣性。Chao分析表明，小龍蝦中細(xì)菌群落豐富度范圍為2952～3109個(gè)，土壤中為3813～4608個(gè)，水中為2596～3922個(gè)（表2）。利用Shannon指數(shù)估算的細(xì)菌群落多樣性在小龍蝦中為5.565～5.760，在土壤中為6.008～6.767，在水中為4.364～5.206（表2）。養(yǎng)殖水體中的Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)均小于小龍蝦及土壤，說(shuō)明土壤和小龍蝦中的微生物群落多樣性較水體更為豐富。

表2 各組樣品Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Alpha diversity statistical results for each group

2.3 不同分類(lèi)水平上的物種注釋及分析

2.3.1 基于門(mén)分類(lèi)水平上的物種注釋及分析 為獲得每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)物種分類(lèi)信息，對(duì)小龍蝦生長(zhǎng)環(huán)境周?chē)乃w、土壤和蝦肉樣本的OTU序列進(jìn)行分類(lèi)匯總，對(duì)應(yīng)至門(mén)、綱、目、科和屬5個(gè)水平。在所有樣品中共檢出微生物61個(gè)門(mén)類(lèi)，分類(lèi)至53綱、85目、83科以及74屬。

小龍蝦尾肉、土壤及水體微生物在門(mén)分類(lèi)水平上的結(jié)構(gòu)分布具有一定規(guī)律性：三者的優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)為變形菌門(mén)（Proteobacteria）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），其中變形菌門(mén)占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在小龍蝦、土壤及水體中的平均相對(duì)豐度依次是54.02%、38.25%、41.94%。不同樣品類(lèi)型在門(mén)分類(lèi)水平上呈現(xiàn)出差異性，小龍蝦中梭桿菌門(mén)（Fusobacteria）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）相對(duì)豐度顯著（P<0.05）高于土壤和水體；土壤中放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）及藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）相對(duì)豐度高于小龍蝦肉和水體，且差異顯著（P<0.05）；綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）在蝦肉和土壤中相對(duì)豐度均小于1%，顯著低于水體（P<0.05）；酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）和硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）在水樣中相對(duì)豐度亦顯著高于底泥（P<0.05）（圖1），以上結(jié)果說(shuō)明小龍蝦蝦肉的菌落結(jié)構(gòu)與養(yǎng)殖環(huán)境有密切聯(lián)系，而土壤中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌藍(lán)細(xì)菌門(mén)及水體中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綠彎菌門(mén)在小龍蝦中占比較小，說(shuō)明盡管小龍蝦中的菌落結(jié)構(gòu)受到生長(zhǎng)環(huán)境的影響，但同時(shí)也有一定保守性。

圖1 基于門(mén)水平的微生物組成分析柱狀圖Fig.1 Histogram of microbial composition analysis based on phylum level

2.3.2 基于綱水平上的物種注釋及分析 對(duì)微生物在綱分類(lèi)水平上統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）和δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）等在小龍蝦尾肉、土壤及水體中平均相對(duì)豐度較高。在小龍蝦中，前三大優(yōu)勢(shì)綱為γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria），土壤中為β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、放線(xiàn)菌綱（Actinobacteria）及Saprospirae；而水體中δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）以及γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）相對(duì)豐度較高。微生物綱類(lèi)在小龍蝦尾肉、土壤和水體中的相對(duì)豐度存在一定差異。小龍蝦尾肉α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）及γ-變 形菌綱（Gammaproteobacteria）的相對(duì)豐度顯著高于土壤及水體，而水體中的擬桿菌綱（Bacteroidia）及硝化螺旋菌綱（Nitrospira）則顯著較高（圖2）。

圖2 基于綱水平的微生物組成分析柱狀圖Fig.2 Microbial composition analysis histogram based on class level

2.3.3 基于門(mén)、科、目水平上的物種注釋及分析 在目、科、屬分類(lèi)水平上，不同樣品種類(lèi)間優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的組成及豐度存在明顯差異。在蝦肉、土壤及水體中共同的優(yōu)勢(shì)目（按>5%記）為伯克氏菌目（Burkholderiales），此外，優(yōu)勢(shì)目、科、屬在不同樣品中各異。在蝦肉中梭桿菌目（Fusobacteriales）、甲基球菌目（Methylococcales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）顯著（P<0.05）高于土壤和水體；在土壤中，優(yōu)勢(shì)目則為放線(xiàn)菌目（Actinomycetales和Saprospirales）；水體中擬桿菌目（Bacteroidales）、硝化螺旋菌目（Nitrospirales）和紅環(huán)菌目（Rhodocyclales）顯著高于蝦肉和土壤（圖3）。在科和屬分類(lèi)水平，不同樣品種類(lèi)間優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的組成及豐度差異明顯，且無(wú)共同優(yōu)勢(shì)科和屬。從科水平看，小龍蝦中主要微生物菌落為梭桿菌科（Fusobacteriaceae）、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）及腸桿菌科（Enterobacteriaceae），土壤中主要微生物菌落為ACK-M 1和Chitinophagaceae；水體中主要微生物菌落為互營(yíng)菌科（Syntrophaceae）、熱脫硫弧菌科（Thermodesulfovibrionaceae）以及紅環(huán)菌科（Rhodocyclaceae）（圖4）。在屬水平，小龍蝦組中的主要優(yōu)勢(shì)菌株為鯨桿菌屬（Cetobacterium）、泉發(fā)菌屬（Crenothrix）、鄰單胞菌屬（Plesiomonas）；水體組中的主要優(yōu)勢(shì)菌群為4-29、地桿菌屬（Geobacter）、HB118；土壤組中的主要優(yōu)勢(shì)菌群為聚球藻屬（Synechococcus）、C39、Limnohabitans、多核桿菌屬（Polynucleobacter）、噬氫菌屬（Hydrogenophaga）（圖5）。

圖3 基于目水平的微生物組成分析柱狀圖Fig.3 Microbial composition analysishistogram based on order level

圖4 基于科水平的微生物組成分析柱狀圖Fig.4 Microbial composition analysis histogram based on family level

圖5 基于屬水平的微生物組成分析柱狀圖Fig.5 Microbial composition analysis histogram based on genus level

2.4 小龍蝦、土壤和水體中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的菌群

除計(jì)算α多樣性外，比較微生物群落的一個(gè)主要目標(biāo)是在每個(gè)樣本中找到特定細(xì)菌群。LDAEffectSize分析（Lefse），是一種用于發(fā)現(xiàn)和解釋高維度數(shù)據(jù)生物標(biāo)識(shí)（基因、通路和分類(lèi)單元等）的分析工具[21]，能夠進(jìn)行兩個(gè)或多個(gè)分組的比較，強(qiáng)調(diào)統(tǒng)計(jì)意義和生物相關(guān)性，還可以分析組間菌群差異，發(fā)現(xiàn)各組間差異的微生物種類(lèi)（圖6A和6B）。使用Lefse軟件在每個(gè)分類(lèi)水平上分析細(xì)菌群落數(shù)據(jù)，LDA值為2，共區(qū)分出508個(gè)細(xì)菌群，為清晰起見(jiàn)，分支圖譜顯示LDA值大于2的分類(lèi)群，圖6A表示三組樣品間具有顯著性差異的菌群，圖6B表示不同差異物種間的進(jìn)化分支情況，綜合分析兩組圖來(lái)反映小龍蝦及其生長(zhǎng)環(huán)境細(xì)菌群落差異物種的空間分布特征。在所有樣品中，共發(fā)現(xiàn)89個(gè)差異物種（圖6A），小龍蝦中共富集了31個(gè)類(lèi)群，其中酸桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、梭桿菌屬等相對(duì)豐度明顯較高；而土壤中共富集了28個(gè)類(lèi)群：酸桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、綠菌彎門(mén)、厚壁菌門(mén)、梭桿菌屬、變形菌門(mén)、軟壁菌門(mén)、疣微菌門(mén)等；水體中共富集29個(gè)類(lèi)群，包括酸桿菌門(mén)、擬桿菌屬、綠菌彎門(mén)、厚壁菌門(mén)、梭桿菌屬、變形菌門(mén)、軟壁菌門(mén)、疣微菌門(mén)等。

圖6 Lefse分析顯著不同的豐富分類(lèi)單元Fig.6 Lefse analysesof the significantly different abundant taxa

2.5 功能預(yù)測(cè)分析

基于PICRUSt2分析平臺(tái)的16S功能預(yù)測(cè)將獲得的OTU豐度表結(jié)合基因庫(kù)對(duì)微生物的代謝通路進(jìn)行功能預(yù)測(cè)（圖7）。在所有樣品中共檢測(cè)到433條微生物代謝通路，小龍蝦中細(xì)菌群落中代謝通路豐度較高的途徑主要有脂質(zhì)代謝、脂肪酸合成、氨基酸合成、有氧呼吸途徑、二?；视蜕锖铣?、順式戊酸酯生物合成、丙酮酸發(fā)酵途徑等；在土壤細(xì)菌中代謝通路豐度較高的途徑主要有氨基酸合成、有氧呼吸途徑、丙酮酸發(fā)酵途徑、脂肪酸合成、戊糖磷酸途徑、TCA循環(huán)途徑、核苷酸合成途徑；在水體細(xì)菌中代謝通路豐度較高的途徑主要有氨基酸合成途徑、糖酵解途徑、脂肪酸合成、脂質(zhì)合成、核苷酸合成途徑等。

圖7 PICRUSt2預(yù)測(cè)微生物代謝通路豐度圖Fig.7 PICRUSt2 predicted abundance of microbial metabolic pathways

3 討論

養(yǎng)殖環(huán)境微生物及其菌落結(jié)構(gòu)在水生生物生長(zhǎng)過(guò)程中具有重要作用，小龍蝦體內(nèi)的微生物與其營(yíng)養(yǎng)代謝及免疫防御有密切聯(lián)系，在維持小龍蝦生長(zhǎng)過(guò)程中內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)揮作用[22]。對(duì)蝦腸道的微生物生態(tài)被證實(shí)與外部水環(huán)境密切相關(guān)[23]。夏海峰等[24]在研究刺參腸道與養(yǎng)殖池塘底泥微生物關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著季節(jié)的變化，二者間細(xì)菌種群變化趨勢(shì)相同，說(shuō)明其菌系具有內(nèi)在聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，小龍蝦尾肉、土壤和水體中門(mén)、綱、目、科、屬在三者間均能被檢測(cè)，表明小龍蝦的養(yǎng)殖環(huán)境與小龍蝦蝦肉間微生物聯(lián)系密切。在門(mén)、綱、目三個(gè)分類(lèi)水平上的分布發(fā)現(xiàn)土壤與蝦肉間共有微生物較多，而水體分別與土壤及蝦肉間共有微生物較少，在科和屬分類(lèi)水平?jīng)]有檢測(cè)到共有優(yōu)勢(shì)菌群，說(shuō)明在本研究中，土壤與蝦肉中微生物菌落結(jié)構(gòu)在門(mén)、綱、目分類(lèi)水平上密切相關(guān)，而在科和屬水平無(wú)相關(guān)性。

分析微生物群落多樣性角度可知，小龍蝦生長(zhǎng)環(huán)境中土壤細(xì)菌豐富度和多樣性最高，而水體中的多樣性指數(shù)與小龍蝦及土壤相比明顯較低，這與凡納濱對(duì)蝦[25]、青蟹[26]等水生動(dòng)物的相關(guān)研究結(jié)果一致。進(jìn)一步說(shuō)明小龍蝦中的微生物與生長(zhǎng)水體及土壤關(guān)系密切，其中小龍蝦菌群的組成可能較多來(lái)源于土壤，符合孫振麗等[27]對(duì)南美白對(duì)蝦的推論，即池塘底泥對(duì)南美白對(duì)蝦腸道菌群的影響大于水體。

在運(yùn)輸儲(chǔ)藏過(guò)程中，由于生物體內(nèi)微生物作用，水產(chǎn)品品質(zhì)會(huì)發(fā)生不同程度劣變[28?29]。在微生物中導(dǎo)致產(chǎn)品變質(zhì)的微生物較少，其中對(duì)食品具有高度特異性的腐敗細(xì)菌為特異性腐敗菌。研究表明，海產(chǎn)品中主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌為希瓦氏菌屬（Shewanella）和假單胞菌屬（Pseudomonas），而淡水產(chǎn)品中主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）[30]和芽孢桿菌（Bacillusspp）[31]。江楊陽(yáng)等[32]利用高通量測(cè)序法確定淡水小龍蝦冷藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為希瓦氏菌（Shewanella）。謝麗丹等[33]發(fā)現(xiàn)引起南美白對(duì)蝦腐敗變質(zhì)的主要細(xì)菌是希瓦氏菌（Shewanella hafniensis）和約氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter johnsonii）。在本研究中，不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）是小龍蝦的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，與先前研究的優(yōu)勢(shì)腐敗菌略有不同的原因可能是生長(zhǎng)環(huán)境、貯藏時(shí)間及溫度的差別導(dǎo)致。不動(dòng)桿菌被證明在室溫下具有較高的脂解活性，并產(chǎn)生硫化氫導(dǎo)致蝦肉變質(zhì)[34]。在水體及土壤中檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為假單胞菌屬（Pseudomonas），是水產(chǎn)品儲(chǔ)藏過(guò)程中產(chǎn)生異味的主要原因[35]。但兩種腐敗菌種在三組樣品中的相對(duì)豐度均較小，因此水體及土壤中的微生物會(huì)可能會(huì)在低溫貯藏過(guò)程中進(jìn)行繁殖，影響小龍蝦貯藏品質(zhì)。

PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）是基于16 sRNA測(cè)序數(shù)據(jù)，通過(guò)標(biāo)記基因數(shù)據(jù)和參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)元基因組的功能[36]。在本研究中，基于KEGG同源基因（KO）對(duì)細(xì)菌功能進(jìn)行具體注釋?zhuān)Y(jié)果表明蝦肉、土壤和水體共有的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)功能類(lèi)群為有氧呼吸（aerobic respiration I）、脂肪酸合成（fatty acid elongation）、氨基酸生物合成（amino acid synthesis）和核糖核苷酸代謝途徑（nucleotide sugar metabolism），這可能與擬桿菌門(mén)分類(lèi)下的細(xì)菌有關(guān)。楊盼等[37]發(fā)現(xiàn)苜蓿根際土壤中代謝為細(xì)菌菌群的主要功能，其中氨基酸代謝豐度較高；凡納濱對(duì)蝦水體中微生物功能研究結(jié)果顯示水體中微生物在細(xì)胞新陳代謝及遺傳信息處理方面功能基因豐度較高[38]。

4 結(jié)論

本研究采用高通量測(cè)序的方法研究了小龍蝦及其養(yǎng)殖環(huán)境水體和土壤間的微生物菌落分布發(fā)現(xiàn)，小龍蝦菌群與其生長(zhǎng)環(huán)境中的土壤和水體中微生物存在密切聯(lián)系，其中小龍蝦和土壤中菌落結(jié)構(gòu)與水體相比較為豐富，三類(lèi)樣品擁有相對(duì)固定的優(yōu)勢(shì)菌群及共有菌群，包括變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)等，但同樣存在差異物種，此結(jié)果為理解三者之間的關(guān)聯(lián)奠定了基礎(chǔ)。對(duì)小龍蝦、土壤和水體中的微生物菌群進(jìn)行功能注釋表明三者間的代謝功能存在高度相似性，證實(shí)了小龍蝦菌群與其生長(zhǎng)環(huán)境之間的相關(guān)性，其中小龍蝦菌落組成可能較多來(lái)源于土壤，而水體所含微生物對(duì)其影響較小，此研究結(jié)果對(duì)小龍蝦的運(yùn)輸貯藏過(guò)程及健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)具有積極意義。但本研究尚未探討?zhàn)B殖水體中層水樣及下層水樣對(duì)小龍蝦菌落組成的影響，同時(shí)對(duì)三者之間菌落的關(guān)聯(lián)性未進(jìn)行深入探討。