氫化可的松局部注射加90Sr-90Y同位素敷貼抑制大鼠皮膚瘢痕形成機制分析

張芬，戴耕武，楊鎵寧，羅東升，賴小梅

作者單位：四川省人民醫(yī)院皮膚外科，四川成都610031

瘢痕是物理、生物、化學等因素的損害作用于皮膚軟組織，導致皮膚軟組織的嚴重損傷而不能完全自行正常修復，轉(zhuǎn)由纖維組織替代修復留下的既影響外觀又影響功能的局部癥狀。皮膚損傷后，在自然愈合的過程中，成纖維細胞轉(zhuǎn)化為成肌纖維細胞，但是一旦成纖維細胞的增殖比其凋亡更活躍，就會影響組織的正常生理功能，例如引起病理性瘢痕或誘發(fā)纖維化疾病甚至導致皮膚癌癥的發(fā)生。每年在發(fā)達國家，多達5 500萬次的選擇性手術(shù)以及2 500萬次創(chuàng)傷后手術(shù)導致了瘢痕的產(chǎn)生，而在低收入和中等收入國家中這一情況更嚴重，瘢痕人數(shù)更多。另一方面，瘢痕影響美觀，并且經(jīng)常疼痛或瘙癢，使人感到沮喪煩躁不安，大大降低了病人預后的生活質(zhì)量。因此，加強對抑制瘢痕藥物及治療方式的探索具有重要的意義。

糖皮質(zhì)激素是機體內(nèi)極為重要的一類調(diào)節(jié)分子，它對機體的發(fā)育、生長、代謝以及免疫功能等起著重要調(diào)節(jié)作用。有研究指出，糖皮質(zhì)激素可增強胰腺癌對放療的耐受性，可增強放療后病人的機體能量水平。也有報道指出，糖皮質(zhì)激素注射治療有使手術(shù)不能切除的瘢痕疙瘩萎縮的可能。另外通過Sr-Y敷貼器，在其衰變過程中，產(chǎn)生β射線，其可作用于瘢痕組織中的成纖維細胞，在受到電離輻射作用后，成纖維細胞出現(xiàn)變性，膠原纖維的合成與沉積被抑制，破壞了瘢痕組織，并減少炎性遞質(zhì)的含量，可有效抑制瘢痕的形成?；诖?，本研究于2017年1月至2018年12月聯(lián)合了氫化可的松局部注射聯(lián)合放療，通過動物實驗，詳細觀察了其抑制皮膚瘢痕形成的效果，并對其作用機制進行了初步探索，報告如下。

1 材料方法

1.1 實驗動物及試劑

SPF級50日齡雄性健康SD大鼠30只，體質(zhì)量范圍為260～300 g，購自Vital River Laboratory Animal Technology（中國北京），許可證號：北京SYXK（京）2017-0033；糖皮質(zhì)激素注射液［2.5%醋酸氫化可的松注射液（25 g/L）］購自北京紫竹藥業(yè)有限公司，批號H11020062，批次1706271；放射性核素Sr-Y敷貼器由中國原子能科學研究院同位素研究所研制；二辛可寧酸試劑盒購自美國Pierce Corporation公司；一抗二抗購自美國Thermo Fisher Tech公司；Elisa比色測定試劑盒Bioxytech LPO-586獲自美國Oxis International公司。

1.2 動物模型制備及分組

使用10%的水合氯醛溶液將30只大鼠進行麻醉，麻醉后在背側(cè)皮膚的左側(cè)切出一條皮膚矩形（10 mm×20 mm），通過真皮和皮下筋膜切開切口，露出下面的肌肉（未切開）。由于大鼠瘢痕模型的制備會極大地影響最終結(jié)果，因此該實驗中所有大鼠的手術(shù)切口均由同一人進行。手術(shù)后第14天，將大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、糖皮質(zhì)激素組、糖皮質(zhì)激素+放療組，各10只。對照組不做任何處理；糖皮質(zhì)激素組將醋酸氫化可的松注射液1 mL平行于皮面均勻注入瘢痕部位，拔針后用棉簽按壓針眼至藥液不再滲出，每周注射2次為1個療程，共治療2個療程；糖皮質(zhì)激素+放療組行糖皮質(zhì)激素注射治療及放射性核素Sr-Y敷貼照射治療，糖皮質(zhì)激素治療同糖皮質(zhì)激素組一致，另在3 mm的橡皮防護貼的保護下，把Sr-Y敷貼器活性面對著皮損處照射，使每個部位吸收的計量達到27 Gy，每周2次為1個療程，共治療2個療程，與糖皮質(zhì)激素注射治療交替進行。

1.3 醫(yī)學倫理學問題

所有實驗程序均符合一般動物實驗倫理學原則，并根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）公布的實驗動物護理和使用指南（NIH出版物編號85-23）進行實驗。

1.4瘢痕的測量

每天用游標卡尺測量術(shù)后瘢痕的長、寬，并觀察是否產(chǎn)生了瘢痕增生，并將相關(guān)數(shù)據(jù)進行記錄。于術(shù)后第30天，將大鼠處死，并將瘢痕組織收集進行相關(guān)分析。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法

將皮膚瘢痕組織以1∶9（g/L）的比例加入鹽水中以形成勻漿。在7 000 r/min離心5 min后，用含有0.1 mmol/L二硫蘇糖醇和蛋白酶抑制劑混合物的組織蛋白提取試劑在冰上裂解沉淀物。使用二辛可寧酸試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。使用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離等量的蛋白質(zhì)級分，然后在100 mmol/L的tris-甘氨酸緩沖液中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上55 min。用含有0.05%（

V

/

V

）Tween-20（TBST）的tris緩沖鹽水中的5%（

W

/

V

）脫脂奶粉在室溫下封閉膜2 h。在4℃下與適當?shù)囊豢狗跤^夜后，用TBST洗滌膜3次，在室溫下與二抗孵育2 h，然后用TBST再洗滌3次。使用增強的化學發(fā)光溶液開發(fā)蛋白質(zhì)印跡。使用Image Lab Software（Bio-Rad，USA）使蛋白質(zhì)表達水平可視化。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測轉(zhuǎn)化生長因子

-β

1（TGF

-β

1）和

轉(zhuǎn)

化

生

長

因

子

激

活

激

酶1（TAK1）

使用來自皮膚瘢痕組織的蛋白質(zhì)提取物，根據(jù)制造商的說明書，通過ELISA（R＆D Systems）測量瘢痕組織的TGF-β1和TAK1。將值標準化為蛋白質(zhì)含量。用市售的比色測定試劑盒Bioxytech LPO-586（Oxis International）測量LV中的脂質(zhì)過氧化。為了計算脂質(zhì)過氧化，將樣品應用于MDA標準曲線并標準化為相對蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果

2.1 糖皮質(zhì)激素注射治療加放療顯著減小了肉眼可見的瘢痕長度

在兩個療程結(jié)束后，即手術(shù)后第29天，對照組的瘢痕長度為（18.55±2.31）mm，寬度為（7.3±1.13）mm，80%（8/10）出現(xiàn)了瘢痕增生；糖皮質(zhì)激素組的瘢痕長度為（15.39±2.17）mm，寬度為（4.7±1.25）mm，60%（6/10）出現(xiàn)了瘢痕增生；糖皮質(zhì)激素+放療組的瘢痕長度為（10.47±1.92）mm，寬度為（1.3±0.94）mm，僅20%（2/10）出現(xiàn)了瘢痕增生。三組間瘢痕長度及寬度比較差異有統(tǒng)計學意義（

F

=

12.734

、14.221，均

P

＜0.01），瘢痕增生比例比較也差異有統(tǒng)計學意義（

χ

=7.500，

P

=0.024）。經(jīng)兩兩比較，糖皮質(zhì)激素+放療組的瘢痕長寬顯著小于對照組及糖皮質(zhì)激素組（

P

＜0.000 1），其瘢痕增生現(xiàn)象也明顯輕于對照組及糖皮質(zhì)激素組（

P

＜0.05）。

2.2 糖皮質(zhì)激素注射治療加放療顯著減少了Smad3蛋白的表達水平

對照組、糖皮質(zhì)激素組、糖皮質(zhì)激素+放療組的Smad3蛋白表達水平分別為（1.00±0.15）、（0.78±0.20）、（0.47±0.18）（

F

=9.491，

P

＜0.01）；經(jīng)兩兩比較，糖皮質(zhì)激素+放療組的Smad3蛋白表達水平明顯低于對照組及糖皮質(zhì)激素組（

P

＜0.000 1，

P

＜0.01），如圖1所示。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組大鼠皮膚瘢痕組織Smad3蛋白水平

2.3 糖皮質(zhì)激素注射治療加放療顯著降低了TGF

β

1和TAK1的表達水平

糖皮質(zhì)激素+放療組TGFβ1和TAK1的表達水平分別明顯低于對照組及糖皮質(zhì)激素組（均

P

＜0.05），如表1所示。

表1 各組大鼠皮膚瘢痕組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）和轉(zhuǎn)化生長因子激活激酶1（TAK1）相對表達量的比較/±s

3 討論

不論是減少相關(guān)疾病的發(fā)生率，還是要使受傷的區(qū)域恢復新生并使皮膚功能正?；?，瘢痕形成的機制以及如何抑制瘢痕形成都是過去幾十年來的熱門話題。本研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素注射治療+放療能有效抑制瘢痕的形成，這種聯(lián)合方法比單一的糖皮質(zhì)激素注射治療的效果更好，這就說明，通過放射性核素Sr-Y放療和糖皮質(zhì)激素注射治療，發(fā)揮了兩種方法抑制瘢痕形成的功效，并且在實驗過程中，本課題組發(fā)現(xiàn)，該聯(lián)合方法安全、無副作用，具有在臨床進行推廣的潛力。

在本探究中，建立與人類相似的瘢痕模型是瘢痕研究的重要組成部分。當前，相關(guān)報道指出，用作瘢痕模型的常見動物包括豬，兔耳，裸鼠，大鼠，小鼠，其傷口愈合過程被認為與人類肥厚性瘢痕形成相似。但是以豬來制作瘢痕模型非常昂貴且困難。對豬進行手術(shù)需要花費大量時間和精力，并且容易產(chǎn)生人為錯誤。而且，這種方法的瘢痕模型不能模擬瘢痕攣縮和畸形，肥大性瘢痕不會侵犯周圍的正常組織。兔耳疤模型僅限于原始創(chuàng)傷范圍，它的膠原蛋白沉積不能達到瘢痕的厚度。小鼠是皮膚松弛的動物，其瘢痕生成過程中總是出現(xiàn)纖維化，更不易形成瘢痕。相比之下，大鼠更常用于制造瘢痕模型。本研究即采用了大鼠建立了線性瘢痕模型，并完成了相關(guān)的實驗。

本研究初步探討了糖皮質(zhì)激素注射治療+放療抑制瘢痕形成的機制，根據(jù)實驗結(jié)果，本課題組推斷是由于Smad3途徑及TGF-β1和TAK1途徑的下調(diào)所致。一些報道也指出，減少Smad和TAK1磷酸化可抑制瘢痕疙瘩形成，并且也有研究指出，TGF-β1支持過多和無組織的膠原沉積，調(diào)節(jié)Ⅰ，Ⅲ和Smad膠原蛋白的表達，可以作為瘢痕治療的靶標［20-21］。本研究通過蛋白質(zhì)印跡法發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素注射治療+放療組的Smad蛋白的表達顯著低于對照組和糖皮質(zhì)激素組，并且Elisa實驗也發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素+放療組TGF-β1和TAK1的表達水平分別明顯低于對照組及糖皮質(zhì)激素組，能初步說明糖皮質(zhì)激素注射治療+放療抑制瘢痕形成的機制。

綜上所述，氫化可的松局部注射聯(lián)合放療可用于抑制瘢痕的形成，效果明顯，安全可靠，可進一步在臨床上進行推廣。但由于其作用機制復雜多樣，需在后期的研究中進行全方位的探索。