6 種食用香辛料基因組DNA提取方法比較

周夢(mèng)月，邢冉冉，王 楠，葛毅強(qiáng)，陳 穎,*

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.中國(guó)農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心，北京 100045）

香辛料是對(duì)花、花蕾、種子、芽、葉、莖、塊根和根莖等器官，或從這些器官取得的原料而制成的有刺激性香辛味、可賦予食物風(fēng)味并增進(jìn)食欲和幫助消化的物質(zhì)的統(tǒng)稱[1]。大多數(shù)香辛料是藥食同源植物，用于食品烹調(diào)時(shí)，可以呈現(xiàn)出各種辛、香、辣味等特性，能夠賦予食物以風(fēng)味，起到開胃、調(diào)香、增色等作用，因此被廣泛地運(yùn)用在食品工業(yè)、家庭和酒店的菜肴烹調(diào)中[2]。最新研究表明，香辛料還具有抗氧化[3]、抗糖尿病[4]、抗癌[5]、抗病毒[6]、抗胃潰瘍[7]以及提供營(yíng)養(yǎng)素[8]等特殊生理功效。隨著全球貿(mào)易的發(fā)展，食用香辛料的市場(chǎng)需求還會(huì)繼續(xù)增加。但是由于我國(guó)目前對(duì)食用香辛料還沒(méi)有統(tǒng)一的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，這給食用香辛料的摻假創(chuàng)造了機(jī)會(huì)。由于不同食用香辛料經(jīng)濟(jì)價(jià)值不同，因此其價(jià)格也存在較大差異。在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)下，一些不法商人利用價(jià)廉的材料全部或部分替代價(jià)格較高的食用香辛料產(chǎn)品[9]，如2017年“天津獨(dú)流鎮(zhèn)調(diào)料造假”事件的發(fā)生擾亂了市場(chǎng)秩序[10]。為了規(guī)范市售食用香辛料的商品情況，合理制定食用香辛料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，迫切需要一種準(zhǔn)確快速的食用香辛料真?zhèn)舞b別方法。

基于DNA的分子檢測(cè)方法對(duì)物種判別的基礎(chǔ)是遺傳物質(zhì)，可以克服表型不能完全或真實(shí)地反映食用香辛料變異情況的缺點(diǎn)，從而保證檢測(cè)結(jié)果的確定性和重現(xiàn)性[11]。近年來(lái)，序列特異擴(kuò)增區(qū)域-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（sequence characterized amplified region-polymerase chain reaction，SCAR-PCR）和DNA條形碼技術(shù)成為檢測(cè)食品摻假的理想方法，已被廣泛用于香辛料的物種鑒別[12]。Gul等[13]使用隨機(jī)引物擴(kuò)增出區(qū)分胡椒和番木瓜種子的特異性RAPD標(biāo)記片段，并轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，最終成功鑒別胡椒及其常見(jiàn)摻假物（番木瓜種子）。ITS2基因是5.8S和28S基因之間的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，其兩端區(qū)域高度保守易于通用引物的設(shè)計(jì)，且該區(qū)域易擴(kuò)增，是唯一被廣泛使用的核基因[14]。Chen Shilin等[15]利用通用引物對(duì)992 種藥用植物（雙子葉植物、單子葉植物、裸子植物、蕨類植物）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增成功率達(dá)到89.6%，可成功擴(kuò)增大部分藥用植物的ITS2基因序列。Zhang Mengting等[16]以ITS2和psbA-trnH基因序列為分子標(biāo)記，利用DNA條形碼技術(shù)成功鑒別了16 種具有代表性的食用香辛料及其常見(jiàn)摻雜物，但部分白胡椒、丁香和肉豆蔻因DNA質(zhì)量濃度低（＜20 ng/μL）導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗，未能進(jìn)行下一步研究。由此可見(jiàn)，DNA純度和質(zhì)量濃度是基于DNA分子檢測(cè)方法成功的重要因素。食用香辛料來(lái)自不同科屬植物的不同部位，有些含有大量的多糖和多酚類化合物，這些化合物的存在會(huì)抑制DNA的提取[17]。多酚經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間放置被氧化，可以不可逆結(jié)合蛋白質(zhì)和核酸形成高分子質(zhì)量的復(fù)合物，導(dǎo)致所提DNA質(zhì)量差[18]。而多糖會(huì)阻礙聚合酶、連接酶和限制性內(nèi)切酶的活性，若DNA提取過(guò)程中未完全去除會(huì)導(dǎo)致后續(xù)研究無(wú)法進(jìn)行[19]。目前關(guān)于食用香辛料DNA提取方法的研究多針對(duì)單一物種[20-23]，缺少對(duì)大多數(shù)食用香辛料通用的提取方法。

本研究針對(duì)常見(jiàn)的食用香辛料，采用改良十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-CTAB法和4 種市售DNA提取試劑盒對(duì)其基因組DNA進(jìn)行提取，并利用ITS2序列引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)比較DNA提取效率和所提DNA的質(zhì)量及PCR擴(kuò)增成功率，以篩選出最適合食用香辛料DNA提取的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

選用常見(jiàn)的19 種食用香辛料作為實(shí)驗(yàn)材料（圖1）。其中，砂仁、草果、豆蔻、干姜、高良姜、山柰、小茴香、白芷、肉桂、肉豆蔻、花椒、陳皮、丁香、八角、甘草購(gòu)于北京同仁堂開發(fā)區(qū)店，孜然、芫荽子、月桂葉、白胡椒購(gòu)于電子商務(wù)平臺(tái)。所有樣品均根據(jù)中國(guó)植物志進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。市售粉狀食用香辛料，孜然粉、肉桂粉、花椒粉、八角粉、白胡椒粉和辣椒粉購(gòu)于線上京東超市。

圖1 食用香辛料圖片F(xiàn)ig. 1 Pictures of edible spices tested in this study

DNA提取試劑盒：TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒、TIANGEN DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；DNeasy plant kit 德國(guó)QIAGEN公司；Nucleospin?Food kit 德國(guó)Machereye-Nagel公司。為了便于區(qū)分，以上4 種DNA提取試劑盒分別用公司名稱代替，即TIANGEN-I試劑盒、TIANGEN-II試劑盒、QIAGEN試劑盒和MN試劑盒。

CTAB、Tris-HCl、EDTA、NaCl、NaCOOH、KCOOH、異丙醇、無(wú)水乙醇 國(guó)藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司；SDS 美國(guó)Amresco公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP） 北京索萊寶科技有限公司；DNA抽提試劑 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；2×SuperTaqPCR MasterMix、6×上樣緩沖液北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker寶生物技術(shù)（大連）有限公司；瓊脂糖 北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

TissueLyser II高通量組織研磨儀 德國(guó)QIAGEN公司；BT323S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Thermo Heraeus Pico 17微量離心機(jī)、Nano Drop ONE超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；電泳儀、Versa Doc凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)Bio-Rad公司；微量移液器 德國(guó)Eppendorf公司；Veriti 96-Well Thermal Cycler梯度PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

取食用香辛料樣品，塊狀和片狀的食用香辛料用70%乙醇溶液擦拭，顆粒狀和粉狀食用香辛料放入70%乙醇溶液中，混合均勻后棄上清液。隨后將清洗后的食用香辛料晾干并放入組織研磨器中，在頻率30 Hz研磨90 s。將粉碎后的食用香辛料放入研缽中，加入液氮充分研磨3～5 次。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，為了防止多酚氧化影響DNA的質(zhì)量，CTAB法和SDS-CTAB法在研磨時(shí)加入2%的PVP，使多酚與PVP絡(luò)合[24]。

1.2.2 DNA提取

使用4 種商業(yè)化試劑盒以及改良CTAB法和SDSCTAB法對(duì)塊狀、片狀及顆粒狀食用香辛料樣品進(jìn)行基因組DNA提取。篩選出最優(yōu)DNA提取方法用于粉狀食用香辛料中基因組DNA的提取，以驗(yàn)證該方法在市售香辛料粉中的適用性。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，且每個(gè)DNA提取方法設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照。

1.2.2.1 TIANGEN-I試劑盒

TIANGEN-I試劑盒采用以硅基質(zhì)為材料的離心柱，適用于從多種植物的不同組織中快速提取基因組DNA，特別適用于多酚、多糖含量高的植物組織和植物干粉。分別稱取30 mg樣品進(jìn)行DNA提取，DNA裂解時(shí)間由20 min延長(zhǎng)至60 min；由于食用香辛料中多酚較多，苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）代替氯仿進(jìn)行等體積抽提2 次，最終使用60 μL雙蒸水洗脫DNA，洗脫后的溶液再加入離心柱中重復(fù)洗脫步驟，其余按照說(shuō)明書步驟操作。

1.2.2.2 TIANGEN-II試劑盒

TIANGEN-II試劑盒是離心柱型試劑盒，適用于各種植物組織。分別稱取20 mg樣品按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行DNA提取。其中DNA裂解條件改為65 ℃水浴60 min，且最終使用60 μL雙蒸水重復(fù)洗脫2 次。

1.2.2.3 QIAGEN試劑盒

QIAGEN試劑盒通過(guò)基于硅膠膜的離心柱形式，從植物細(xì)胞、組織或真菌細(xì)胞樣本中分離總DNA。分別稱取20 mg樣品按照試劑盒說(shuō)明書操作，其中DNA裂解時(shí)間延長(zhǎng)為60 min，最終使用60 μL雙蒸水重復(fù)洗脫DNA 2 次。

1.2.2.4 MN試劑盒

MN試劑盒是一種硅膠柱吸附式試劑盒，能提取復(fù)雜基質(zhì)（加工食品、大豆、巧克力，谷物、肉類、動(dòng)物飼料等）中的DNA。分別稱取30 mg樣品進(jìn)行DNA提取，DNA裂解時(shí)間由30 min延長(zhǎng)為60 min，最終使用雙蒸水重復(fù)洗脫2 次，其余按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行。

1.2.2.5 改良CTAB法

分別稱取30 mg樣品參照余亞?wèn)|[25]的方法進(jìn)行DNA提取，部分步驟進(jìn)行改進(jìn)。其中樣品經(jīng)CTAB提取液裂解60 min后，使用DNA抽提試劑苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）代替氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）將DNA抽提至上層水相中，加入異丙醇和3 mol/L NaCl溶液后置于-20 ℃中冰浴，冰浴時(shí)間由60 min延長(zhǎng)至過(guò)夜。12 000 r/min離心5 min，棄上清液，并使用70%乙醇溶液和無(wú)水乙醇分別洗滌沉淀，最后使用60 μL雙蒸水溶解DNA。

1.2.2.6 SDS-CTAB法

稱取30 mg樣品，參考趙玲云等[26]的方法進(jìn)行DNA提取，并針對(duì)食用香辛料部分改進(jìn)?；陬A(yù)實(shí)驗(yàn)省略緩沖液I洗滌和RNase的加入，樣品在2% SDS溶液中65 ℃裂解60 min后，加入5 mol/L KCOOH（pH 6.0），并置于-20 ℃中冰浴60 min。離心取上清液后加入CTAB緩沖液，65 ℃裂解60 min后改用等體積的DNA抽提試劑苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）抽提DNA。隨后加入異丙醇和NaCl溶液過(guò)夜沉淀DNA，離心棄上清液，并用70%乙醇溶液洗滌2 次，最后使用60 μL雙蒸水溶解DNA。

1.2.3 DNA質(zhì)量檢測(cè)

1.2.3.1 DNA質(zhì)量濃度和純度測(cè)定

取1 μL提取的DNA用Nano Drop ONE測(cè)定其質(zhì)量濃度、A260nm/A280nm和A260nm/A230nm的比值，以評(píng)估提取DNA的質(zhì)量和雜質(zhì)去除情況。

1.2.3.2 DNA完整度檢測(cè)

選取3 個(gè)重復(fù)中DNA質(zhì)量濃度最高的樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，評(píng)價(jià)不同提取方法所得DNA的完整度。取5 μL DNA原液與1 μL 6×上樣緩沖液混勻，以1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓90 V，電泳時(shí)間40 min。電泳結(jié)束后放于EB染液中染色10 min，水洗2 min，最后放入凝膠成像系統(tǒng)中成像。

1.2.3.3 PCR擴(kuò)增

將DNA稀釋至10 ng/μL，用ITS2序列引物[27]進(jìn)行PCR擴(kuò)增以評(píng)價(jià)所提DNA是否滿足后續(xù)研究。引物序列為MS2F：5’-GAGTCTTTGAACGCAAGTTG-3’和MS2R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATG-3’。PCR體系為：2×PCR reaction mix 12.5 μL，正反向引物各0.1 mmol/L，DNA 30 ng，加水補(bǔ)充至25 μL。PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，33 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物，在2%的瓊脂糖凝膠中電泳45 min，電壓90 V。隨后用Versa Doc凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)PCR擴(kuò)增情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA完整度分析

食用香辛料來(lái)自植物的不同部位，其組織中含有不同含量和種類的次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)的存在會(huì)影響DNA的提取質(zhì)量。本研究選取適用于富含多酚和多糖的植物DNA提取試劑盒、復(fù)雜基質(zhì)的食品DNA提取試劑盒及針對(duì)次生代謝產(chǎn)物改良的CTAB法和SDS-CTAB法提取食用香辛料基因組DNA。

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA完整性。條帶緊湊、分子質(zhì)量大的表明提取方法效果較好，高分子質(zhì)量條帶呈分散狀，低分子質(zhì)量區(qū)域較亮，表明降解較為嚴(yán)重[28]。結(jié)果表明，不同DNA提取方法對(duì)DNA完整性影響不同，都觀察到一定程度的降解。6 種方法提取的7號(hào)（孜然）、9號(hào)（芫荽子）、12號(hào)（月桂葉）、14號(hào)（青花椒）和18號(hào)（甘草）樣品DNA在2 kb以上區(qū)域有明顯條帶，但存在拖尾現(xiàn)象。2號(hào)（草果）、11號(hào)（肉桂）、13號(hào)（肉豆蔻）和17號(hào)（八角）樣品的DNA均無(wú)明顯條帶，主要是由于食用香辛料在干燥及存放過(guò)程中，DNA暴露在高溫、物理或化學(xué)處理下，導(dǎo)致DNA的降解[29]?？傮w來(lái)看，TIANGEN-II試劑盒和改良CTAB法所提DNA完整性最好。而QIAGEN試劑盒法所提DNA電泳條帶亮度較弱，表明該方法提取的DNA產(chǎn)率較低。

圖2 6 種方法提取食用香辛料基因組DNA的電泳圖Fig. 2 Electrophoresis of genomic DNA from edible spices obtained by six extraction methods

2.2 DNA質(zhì)量濃度分析

由于6 種方法所用食用香辛料的量不同，因此將質(zhì)量濃度換算為20 mg樣品所提DNA的質(zhì)量濃度進(jìn)行比較。結(jié)果表明，不同食用香辛料種類和提取方法在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著差異，證明DNA質(zhì)量濃度取決于提取方法和樣品種類（表1）。比較不同的DNA提取方法，發(fā)現(xiàn)改良CTAB法、SDS-CTAB法所提DNA質(zhì)量濃度顯著高于MN試劑盒法、TIANGEN-I試劑盒法和QIAGEN試劑盒法（P＜0.05）。在4 種商業(yè)試劑盒中，TIANGEN-II試劑盒和MN試劑盒所提DNA質(zhì)量濃度顯著高于TIANGEN-I和QIAGEN試劑盒（P＜0.05）。研究發(fā)現(xiàn)，DNA質(zhì)量濃度受食用香辛料種類的影響。皮類食用香辛料，如11號(hào)（肉桂），提取DNA質(zhì)量濃度為2.44～62.36 ng/μL，其中改良CTAB法提取的DNA質(zhì)量濃度最高，其次依次為SDS-CTAB法、TIANGEN-II試劑盒法、QIAGEN試劑盒法、MN試劑盒法和TIANGEN-I試劑盒法。主要是由于木質(zhì)素合成途徑中存在的蛋白質(zhì)、多糖和酚類化合物會(huì)強(qiáng)烈抑制DNA的提取，使得從木材中提取基因組DNA對(duì)困難[30]，導(dǎo)致樹皮/木質(zhì)組織的DNA產(chǎn)量較低（＜50 ng/μL）[31]。根莖類食用香辛料，如4號(hào)（干姜）、5號(hào)（高良姜）、6號(hào)（山柰）、10號(hào)（白芷）和18號(hào)（甘草），所提DNA平均質(zhì)量濃度低于85 ng/μL，這是由于這類樣品大多質(zhì)地堅(jiān)硬且組織中含有較多的纖維和儲(chǔ)藏物質(zhì)[32]，導(dǎo)致同等質(zhì)量的樣品中DNA含量少、較難提取。部分果實(shí)類食用香辛料，如1號(hào)（砂仁）和2號(hào)（草果），其質(zhì)地堅(jiān)硬（圖1），在相同的前處理情況下仍有塊狀物質(zhì)存留，表明細(xì)胞壁未完全破除，導(dǎo)致所提DNA質(zhì)量濃度低。因此，在根、莖、皮類等質(zhì)地堅(jiān)硬的食用香辛料DNA提取中，應(yīng)充分研磨，且適當(dāng)增加樣品量和裂解時(shí)間，以獲得高質(zhì)量濃度、高質(zhì)量的DNA。13號(hào)（肉豆蔻）經(jīng)6 種提取方法提取后得到的DNA質(zhì)量濃度低，平均為8.54 ng/μL。這是由于13號(hào)（肉豆蔻）含油率較高[33]，脂質(zhì)的存在阻礙了遺傳物質(zhì)的提取。另外，其平均DNA質(zhì)量濃度低于其他食用香辛料的DNA質(zhì)量濃度，證明脂質(zhì)對(duì)DNA提取的影響比堅(jiān)硬的組織更大，這也與Tear等[34]研究一致。

表1 6 種方法提取的19 種食用香辛料DNA的質(zhì)量濃度Table 1 Concentrations of DNA from 19 edible spices extracted by six methods

2.3 DNA純度分析

多糖和多酚的存在會(huì)干擾DNA進(jìn)一步分析[35]，本研究采用A260nm/A280nm和A260nm/A230nm比值對(duì)提取的DNA進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。所有方法提取DNA的A260nm/A280nm比值在（0.70±0.03）～（2.05±0.01）之間（表2），TIANGENII試劑盒所提DNA的A260nm/A280nm比值最高，與改良CTAB法、SDS-CTAB法和TIANGEN-I試劑盒法無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但顯著高于MN試劑盒法和QIAGEN試劑盒法（P＜0.05）。利用TIANGEN-II試劑盒提取到的19 種食用香辛料DNA，其中63%的樣品優(yōu)于其他方法，且26.3%的樣品DNA的A260nm/A280nm比值高于1.8，證明DNA提取過(guò)程中蛋白質(zhì)去除良好。MN試劑盒法提取的4號(hào)（干姜）和6號(hào)（山柰）樣品DNA的A260nm/A280nm比值分別為1.12±0.02和0.99±0.02，DNA中存在蛋白質(zhì)污染，表明MN試劑盒不適用于兩者中蛋白質(zhì)的去除。本研究采用A260nm/A230nm比值評(píng)估各方法對(duì)碳水化合物的去除情況，6 種方法提取DNA的A260nm/A230nm比值低于2.0（P＜0.05），表明DNA中可能存在多糖、小分子鹽類及色素等物質(zhì)。6 種DNA提取方法中TIAGEN-I碳水化合物去除情況最好，且52.6%的樣品所提DNA優(yōu)于或同于其他方法。總體而言，6 種方法所提DNA的A260nm/A230nm比值無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表2 6 種方法提取的19 種食用香辛料DNA的純度Table 2 DNA purity from 19 edible spices extracted by six methods

2.4 PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

本研究將6 種方法提取的食用香辛料DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增以評(píng)估DNA的擴(kuò)增成功率，進(jìn)而比較不同方法去除PCR抑制劑的能力，以選出最佳DNA提取方法。結(jié)果顯示，6 種方法提取的DNA在PCR擴(kuò)增效率上有明顯差異（圖3），表明不同方法去除干擾PCR抑制劑的能力不同?？傮w上，4 種商業(yè)試劑盒法提取DNA的PCR擴(kuò)增成功率均大于80%，高于改良CTAB法（75.2%）和SDSCTAB法（77.2%）。TIANGEN-I試劑盒法和QIAGEN試劑盒法提取的DNA擴(kuò)增成功率最高為100%，但QIAGEN試劑盒法提取的2號(hào)（草果）、11號(hào)（肉桂）和14號(hào)（花椒）樣品DNA只能觀察到微弱的電泳條帶，這表明QIAGEN試劑盒法所提DNA中仍存在少量PCR抑制劑。食用香辛料種類不同導(dǎo)致PCR擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生差異。3號(hào)（豆蔻）、7號(hào)（孜然）、8號(hào)（小茴香）、9號(hào)（芫荽子）和18號(hào)（甘草）樣品利用6 種方法所提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均具有明亮、單一的電泳條帶，表明樣品DNA擴(kuò)增效率高。而TIANGEN-I試劑盒法、TIANGEN-II試劑盒法、改良CTAB法和SDS-CTAB法所提12號(hào)（月桂葉）樣品的DNA質(zhì)量濃度及純度高，但只能觀察到微弱的電泳條帶，表明研究所用引物在月桂葉DNA中擴(kuò)增效率低。對(duì)于11號(hào)（肉桂）樣品，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶弱，這是由于DNA質(zhì)量濃度低導(dǎo)致的。

圖3 6 種方法提取的19 種食用香辛料DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 3 Electrophoresis of PCR products of DNA from 19 edible spices extracted by six methods

在實(shí)際工作中，選擇一種快速、準(zhǔn)確的DNA提取方法對(duì)食用香辛料的檢測(cè)具有重要意義。SDS-CTAB法和改良CTAB法耗時(shí)長(zhǎng)，分別需要14 h和10 h，且PCR擴(kuò)增成功率最低。4 種試劑盒法均用時(shí)較短（≤2 h），其中TIANGEN-I和QIAGEN試劑盒法的PCR擴(kuò)增成功率最高，但QIAGEN試劑盒法所提DNA的質(zhì)量濃度最低，并存在一定的PCR抑制劑。因此，經(jīng)過(guò)綜合比較，本研究推薦使用TIANGEN-I試劑盒法作為食用香辛料中基因組DNA提取的優(yōu)選方法。

2.5 市售香辛料粉中提取DNA的質(zhì)量濃度及質(zhì)量分析

使用DNA提取效果最好的TIANGEN-I試劑盒對(duì)7 份常見(jiàn)的市售食用香辛料粉進(jìn)行DNA提取，并根據(jù)DNA質(zhì)量濃度、純度及PCR擴(kuò)增效率評(píng)估該方法對(duì)香辛料粉的適用性。為使結(jié)果更加直觀，將質(zhì)量濃度換算為20 mg香辛料粉所提DNA的質(zhì)量濃度進(jìn)行比較。

表3TIANGEN-I試劑盒法提取市售香辛料粉DNA的質(zhì)量濃度和純度Table 3 DNA concentrations and purity from commercial spice powder extracted by TIANGEN plant genomic DNA kit

結(jié)果表明，所有樣品DNA質(zhì)量濃度在3.36～139.20 ng/μL之間（表3），其中，S-1（孜然粉）、S-2（肉桂粉）、S-3（花椒粉）、S-4（八角粉）和S-5（白胡椒粉）的DNA質(zhì)量濃度顯著高于完整的食用香辛料所提DNA的質(zhì)量濃度（P＜0.05），這是因?yàn)榉蹱钍秤孟阈亮霞?xì)胞壁破碎更加完全。因此，在食用香辛料DNA提取過(guò)程中充分研磨可以提高DNA提取的效率。與片狀肉桂（11）類似，因肉桂粉（S-2）中蛋白質(zhì)、多糖和多酚物質(zhì)的存在會(huì)抑制DNA提取，導(dǎo)致其DNA質(zhì)量濃度較低（3.36 ng/μL）。市售香辛料粉DNA的A260nm/A280nm比值在1.18～1.80之間，與其對(duì)應(yīng)的完整食用香辛料所提DNA的A260nm/A280nm比值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。同樣，粉狀食用香辛料細(xì)胞壁破碎完全，細(xì)胞中的碳水化合物釋放出來(lái)，使其在DNA裂解和純化過(guò)程中被充分去除。研究利用PCR擴(kuò)增成功率判斷該方法所提DNA中抑制劑去除情況，以評(píng)估是否適用于后續(xù)研究。S-1（孜然粉）、S-3（花椒粉）、S-4（八角粉）、S-5（白胡椒粉）、S-6（辣椒粉）和S-7（辣椒粉）的PCR產(chǎn)物條帶明亮（圖4），證明DNA質(zhì)量良好，適合后續(xù)的研究。當(dāng)使用30 mg肉桂粉，裂解時(shí)間為60 min時(shí)，所得DNA質(zhì)量濃度為5.07 ng/μL，但PCR擴(kuò)增后顯示無(wú)電泳條帶。將樣品量增加至50 mg，裂解時(shí)間延長(zhǎng)至120 min后，提取到的DNA質(zhì)量濃度提高至（13.20±0.19）ng/μL，且PCR擴(kuò)增成功（圖4）。因此，在提取皮類或者堅(jiān)硬的食用香辛料時(shí)需要適當(dāng)增加樣品量，延長(zhǎng)DNA裂解時(shí)間。

圖4 市售食用香辛料粉PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 4 Electrophoresis of PCR amplification products of DNA from commercial spice powder

綜上所述，利用TIANGEN-I試劑盒可以成功提取7 份常見(jiàn)的市售食用香辛料粉中的基因組DNA。其中，對(duì)于皮類食用香辛料，如肉桂粉樣品（S-2），可以通過(guò)增加樣本量和延長(zhǎng)裂解時(shí)間，以提取得到符合實(shí)驗(yàn)要求的基因組DNA。

3 結(jié) 論

食用香辛料中因含有多糖、多酚和色素等化合物，導(dǎo)致DNA提取相對(duì)困難。本研究通過(guò)DNA的完整性、DNA純度和PCR擴(kuò)增成功率，比較4 種商業(yè)DNA提取試劑盒、改良CTAB法和SDS-CTAB法用于食用香辛料的DNA提取。結(jié)果表明，QIAGEN試劑盒法能夠去除大部分PCR抑制劑，但提取的DNA質(zhì)量濃度較低且質(zhì)量較差；改良CTAB法和SDS-CTAB法提取的食用香辛料DNA質(zhì)量濃度高，但由于采用異丙醇和高質(zhì)量濃度鹽沉淀DNA，會(huì)導(dǎo)致PCR抑制劑及其他有機(jī)化合物與DNA同時(shí)沉淀，影響PCR擴(kuò)增，從而造成PCR擴(kuò)增成功率低；TIANGEN-I試劑盒法去除次生代謝物和PCR抑制劑的能力最強(qiáng)，對(duì)塊狀、片狀、顆粒狀和粉狀香辛料均能提取得到質(zhì)量濃度及純度良好的DNA，且所得DNA的PCR擴(kuò)增成功率高，適合含多糖、多酚以及其他次生代謝物含量較高的食用香辛料DNA提取。

此外，由于食用香辛料種類不同，其細(xì)胞破壞難易程度及組織中存在的物質(zhì)不同，需要根據(jù)實(shí)際情況對(duì)DNA提取步驟進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)于根莖類、皮類等堅(jiān)硬的食用香辛料，由于細(xì)胞破壞困難導(dǎo)致其DNA質(zhì)量濃度低，因此在DNA提取時(shí)需要研磨充分，適當(dāng)增加樣品量、裂解液以及延長(zhǎng)裂解時(shí)間，以得到較好的DNA提取效果。