圣草次苷的合成及其對過氧化氫誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化損傷的保護作用

梁曾恩妮，汪秋安，張菊華，蘇東林，付復華，李高陽，劉 偉,*，單 楊,*

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長沙 410125；2.果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410125；3.湖南大學化學化工學院，湖南 長沙 410082）

血管內(nèi)皮細胞呈扁平形或多角形，通過黏附連接、緊密連接和縫隙連接的方式在血管以及淋巴管內(nèi)表面形成單層細胞，起到調(diào)節(jié)血管張力、細胞屏障等作用。血管內(nèi)皮細胞的損傷和功能失調(diào)導致血管功能削弱，從而引起高血壓、冠心病、心肌梗塞、動脈粥樣硬化等心血管性疾病[1]。自由基是細胞代謝的中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物，是維持生命所必需的，具有信號傳導、預防微生物感染、激活細胞活性等多種生理功能[2]。然而，過剩的自由基利用氧化作用攻擊健康細胞的不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)，引起脂質(zhì)、代謝酶系、蛋白質(zhì)和DNA等物質(zhì)氧化，還會誘導細胞凋亡，導致細胞和機體衰老、損傷或死亡。氧自由基的產(chǎn)生和清除失衡誘發(fā)的氧化應激是損傷血管內(nèi)皮的主要病理因素之一[3]。近年來，自由基對人體的危害備受重視，開發(fā)具有清除自由基功能的食品和天然抗氧化劑成為學者研究的重要內(nèi)容。黃酮類化合物能夠調(diào)節(jié)機體內(nèi)的自由基水平和增強機體的氧化防御能力，是天然抗氧化劑的重要來源[4]。柑橘是世界第一大水果和重要的天然黃酮化合物來源，其消費量呈穩(wěn)定上升趨勢[5]。由于黃酮化合物具有抑制羥自由基和提供氫原子的能力，因此它們具有抗氧化能力，是極佳的羥自由基清除劑。

圣草次苷是一種存在于檸檬或酸橙柑桔中的黃烷酮，具有抗氧化、抗癌和抗過敏等多種生物活性[6]。國內(nèi)對圣草次苷活性功能的報道較少，僅有張曉愉等[7]采用圣草次苷治療小鼠慢性帕金森疾病。他們發(fā)現(xiàn)圣草次苷可以通過小鼠神經(jīng)元細胞的死亡緩解1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導的小鼠慢性帕金森疾病。國外有文獻報道圣草次苷還具有其他生理功能。例如，圣草次苷可以通過上調(diào)p53、細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白D3和周期素依賴性激酶6抑制S期細胞周期，進而抑制肝癌細胞的生長[8]；食用圣草次苷（32 mg/（kgmb·d））28 d可以增加線粒體大小和線粒體DNA含量，改善血脂異常和高脂飲食引起的肝脂肪變性[9]。圣草次苷和白藜蘆醇聯(lián)合可抑制體外脂多糖誘導的一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子α和白細胞介素1β的分泌，減輕體內(nèi)12-O-十四烷酰佛波-13-乙酸酯引起的水腫和皮下組織炎癥[10]。Miyake等[11]使用亞油酸體系評估圣草次苷抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，圣草次苷在亞油酸自氧化系統(tǒng)中的抗氧化活性與α-生育酚相當，與檸檬酸共同使用時抗氧化活性增強。

然而，圣草次苷在枳殼或新鮮檸檬或酸橙中的含量很低，其含量約為柚皮苷、新橙皮苷等柑橘黃酮含量的1/40[12]。企業(yè)多利用檸檬自然生理落果和多步法提取圣草次苷，即檸檬等柑橘落果經(jīng)乙醇提取、樹脂分離以及體積分數(shù)75%、85%和95%的乙醇溶劑3 步純化精制，不僅提取效率極低（≤1%），而且產(chǎn)品純度在10%以內(nèi)，加工流程繁瑣、成本高[13]。而圣草次苷化學合成法使用較少，這種方法可以采用來源豐富、含量高、價格相對低廉的天然二氫黃酮類資源橙皮苷制備圣草次苷，工藝簡單可控，不僅簡化了生產(chǎn)流程，降低了成本，而且提高了產(chǎn)率和純度。本實驗采用橙皮苷結(jié)構(gòu)修飾合成圣草次苷，對分離純化后的目標產(chǎn)物通過1H核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和13C NMR進行結(jié)構(gòu)表征，以過氧化氫（H2O2）誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞系（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）作為體外細胞氧化損傷模型，研究圣草次苷的細胞毒性作用及其對H2O2誘導的HUVEC細胞保護作用，評價圣草次苷的抗氧化潛力，為其開發(fā)和利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橙皮苷（純度≥98%） 綿陽迪澳藥業(yè)有限公司；HUVEC細胞 上海中喬新舟生物科技有限公司；CCK-8（cell counting kit-8）試劑盒 日本同仁化學研究所；DMEM培養(yǎng)基 美國Sigma公司；胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS） 美國Gibco公司；胰酶消化液、雙抗（青鏈霉素）、BCA法蛋白定量檢測試劑盒、RIPA裂解液 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；Super ECL Plus超敏發(fā)光液 美國 Advansta公司；一抗Bax、Bcl-2、p53、β-actin 美國Proteintech公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BSC-1300IIA2超凈工作臺 蘇凈安泰科技有限 公司；Forma Series II CO2培養(yǎng)箱、5424離心機 德國Eppendorf公司；LDZΧ-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋 上海 申安醫(yī)療器械廠；LGJ-12D真空冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；AS200.R2電子天平 波蘭 RADWAG公司；Avanti J-26 ΧP高速冷凍離心機、Cytoflex流式細胞儀 美國Beckman公司；MK3酶標儀 美國Thermo公司；CKΧ41SF熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；ZWY-100D振蕩搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；JB-10磁力攪攔器 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 圣草次苷制備工藝

將100 g干燥橙皮苷加入由900 mL吡啶溶劑和0.6 g三氯化鋁催化劑組成的混合溶液中，在（90±5）℃條件下反應12 h。真空減壓回收吡啶，加入550 mL蒸餾水攪攔均勻成浸膏。待浸膏溫度低于30 ℃，加入500 mL體積分數(shù)10%鹽酸水解鋁鹽2 h，冷卻至常溫，用活性炭20 g脫色，脫色液上樣至大孔樹脂柱（高度1 m、內(nèi)徑0.06 m），用3 倍體積的體積分數(shù)70%乙醇溶液洗滌該樹脂柱至流出液無色，濃縮洗脫液，采用3 倍體積的體積分數(shù)85%乙醇溶液攪攔溶解3 h，過濾，收集濾液，減壓蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥并粉碎，得到淡黃色固體。圣草次苷制備工藝流程見圖1。

圖1 圣草次苷制備工藝流程Fig.1 Flow chart for the preparation process of eriocidin

1.3.2 合成化合物結(jié)構(gòu)測定

對所合成化合物的結(jié)構(gòu)通過1H NMR和13C NMR進行表征，均采用四甲基硅烷作內(nèi)標，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）-d6作溶劑，1H NMR檢測頻率400 MHz，13C NMR檢測頻率101 MHz。

1.3.3 HUVEC細胞培養(yǎng)

在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下，HUVEC細胞培養(yǎng)于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基（含100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）中，每2～3 d更換培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.3.4 圣草次苷和H2O2對HUVEC細胞生長影響的分析

采用CCK-8法檢測圣草次苷和H2O2對HUVEC細胞生長的影響。取對數(shù)生長期HUVEC細胞，胰酶消化計數(shù)后，以5×103個/孔密度接種于96 孔板內(nèi)。培養(yǎng)12 h后，加入不同濃度H2O2（終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol/L）或不同質(zhì)量濃度圣草次苷（終質(zhì)量濃度為50、100、200、400 μg/mL）分別在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑孵育4 h，用酶標儀在450 nm波長處測定光密度（optical density，OD）值。設空白組（僅培養(yǎng)基）和正常組（無藥物處理的細胞），細胞存活率按下式計算。

1.3.5 圣草次苷對H2O2誘導HUVEC細胞生長的保護 作用分析

取對數(shù)生長期HUVEC細胞，以5×103個/孔密度接種于96 孔板內(nèi)，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，分別加入0.4 mol/L H2O2或/和不同質(zhì)量濃度圣草次苷（50、100、200 μg/mL）。設正常對照組（無藥物處理的細胞），僅添加H2O2處理作為模型組，同時添加H2O2和圣草次苷處理作為干預組，分別記作ERI-50、ERI-100和ERI-200組。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑孵育4 h后，用酶標儀在450 nm波長處測定OD值，按1.3.4節(jié)公式計算細胞存活率，根據(jù)細胞存活率評價圣草次苷對H2O2誘導HUVEC細胞生長的保護作用。

細胞經(jīng)過相應藥物處理后，每組處理在熒光倒置顯微鏡100 倍亮視野下觀察并拍照。

1.3.6 圣草次苷對H2O2誘導HUVEC細胞內(nèi)ROS水平 影響的分析

取對數(shù)生長期HUVEC細胞接種于6 孔板中，接種密度為1×105個/mL，每孔2 mL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，分別加入0.4 mol/L H2O2和不同質(zhì)量濃度圣草次苷（50、100 μg/mL），設正常對照組（無藥物處理的細胞）。按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋ROS探針2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA），使其終濃度為10 μmol/L。吸去細胞中的細胞培養(yǎng)液，加入1 mL 10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃、5% CO2孵育20 min，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3 次，用胰酶消化收集細胞，采用流式細胞儀檢測細胞的ROS水平。ROS水平以DCFH熒光強度表示。

1.3.7 圣草次苷對H2O2誘導HUVEC細胞MDA水平 和抗氧化物酶系活力影響的分析

取對數(shù)生長期HUVEC細胞接種于6 孔板中，接種密度為1.0×105個/mL，每孔2 mL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，分別加入0.4 mol/L H2O2和不同質(zhì)量濃度圣草次苷（50、100 μg/mL），設空白組（僅培養(yǎng)基）和正常組（無藥物處理的細胞）。吸去細胞培養(yǎng)液后，用pH 7.4磷酸緩沖液清洗細胞3 次，加入100 μL RIPA細胞裂解液，1 500×g、4 ℃離心10 min，收集上清液待測。按相應試劑盒說明書測定MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活力（均以每毫克蛋白計）。

1.3.8 圣草次苷對H2O2誘導HUVEC細胞蛋白表達影響的分析

取對數(shù)生長期HUVEC細胞接種于6 孔板中，接種 密度為1×105個/mL，每孔2 mL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，按1.3.7節(jié)分組方法加藥處理和裂解細胞后，將裂解液離心，收集上清液，采用BCA法檢測蛋白濃度。配制質(zhì)量分數(shù)10%分離膠和5%濃縮膠，上樣，分離目的蛋白，采用半干法將目的蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，將PVDF膜放入抗體Bax（體積比1∶5 000稀釋）、Bcl-2（體積比1∶500稀釋）和p53（體積比1∶1 000稀釋）稀釋液中4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育1 h，暗室中加入超敏發(fā)光液1 mL與膜孵育1 min，吸進液體，曝光顯影，采用ImageJ軟件進行定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 24軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用方差分析進行顯著性檢驗，采用Tukey法進行組間差異比較，結(jié)果以平均值±標準差表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 圣草次苷的合成及表征結(jié)果

以來源豐富、價廉的天然二氫黃酮類資源橙皮苷為原料，經(jīng)吡啶在三氯化鋁催化下發(fā)生去甲基反應得到圣草次苷（圖2）。常規(guī)提取工藝需經(jīng)過不同體積分數(shù)乙醇溶液純化3 次，本研究僅需通過樹脂分離、乙醇純化1 次，再經(jīng)過濾和干燥，即可得到圣草次苷質(zhì)量分數(shù)為80%～98%的成品，與常規(guī)多步法提取相比，合成時間由常規(guī)提取的72 h縮短至48 h，產(chǎn)率由一般常規(guī)提取的40%～60%提高至75%以上，產(chǎn)品純度由常規(guī)提取的70%～80%提高至80%～98%[14]。

圖2 圣草次苷合成的反應式Fig.2 Chemical reaction for synthesis of eriocidin

圣草次苷：黃色固體，產(chǎn)率83%，熔點為161～164 ℃。如圖3所示，圣草次苷1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：12.06（s, 1H, 5-OH）、9.14（s, 1H, 4’-OH）、9.09（s, 1H, 3’-OH）、6.92（dd, 1H,J＝ 8.5, 2.5 Hz, 6’-H）、6.82（d, 1H,J＝2.5 Hz, 2’-H）、6.78（d, 1H,J＝8.5 Hz, 5’-H）、6.17（d, 1H,J＝ 2.3 Hz, 8-H）、6.14（d, 1H,J＝2.4 Hz, 6-H）、5.46（d,J＝ 12.5 Hz, 1H, 2-H）、5.24（d,J＝7.2 Hz, 1H, 1’’-H）、5.01（d,J＝2.5 Hz, 1H, 1’’’-H）、4.75～3.15（m, 15H, 2”, 3”, 4”, 5”, 6”, 2’’’, 3’’’, 4’’’, 5’’’ -H）、3.12（dd,J＝ 16.5, 12.6 Hz, 3a-H）、2.75（dd,J＝16.5, 3.0 Hz, 3b-H）、1.11（d,J＝6.0 Hz, 3H, CH3）；圣草次苷13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ：197.61（4-C）、165.53（7-C）、163.50（5-C）、163.08（9-C）、146.24（4’-C）、145.64（3’-C）、129.74（1’-C）、118.50（6’-C）、115.88（2’-C）、114.89（5’-C）、101.06（10-C）、96.78（1’’’-C）、96.05（1’’-C）、79.15（6-C）、 79.06（8-C）、76.73（2-C）、75.97（3’’-C）、73.46 （5’’-C）、72.54（2’’-C）、71.20（4’’-C）、70.73（3’’’-C）、 70.0（2’’’-C）、68.78（4’’-C）、66.51（5’’’-C）、 60.23（6’’-C）、42.75（3-C）、18.28（6’’’-C）。以上數(shù)據(jù)與文獻[15-16]報道基本一致，故鑒定合成化合物為圣草次苷。

圖3 化學合成圣草次苷的1H NMR（A）和13C NMR（B）譜圖Fig.3 1H NMR (A) and 13C NMR (B) spectra of the synthetic eriocidin

2.2 圣草次苷對HUVEC細胞的毒性作用及其對H2O2 誘導HUVEC細胞生長的保護作用

CCK-8是一種廣泛應用于細胞生長和細胞毒性的快速高靈敏度檢測方法，其檢測原理為2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯作用下被細胞線粒體中脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物，在450 nm波長處有最大吸收峰[17]。由圖4A可知，與正常組（圣草次苷質(zhì)量濃度0 μg/mL）相比，不同質(zhì)量濃度圣草次苷作用HUVEC細胞24 h后，細胞存活率顯著增加 （P＜0.05），其中50 μg/mL圣草次苷促細胞生長效果最好，隨圣草次苷質(zhì)量濃度的增加，促生長作用有所減弱。結(jié)果表明，50～400 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的圣草次苷對HUVEC細胞無毒性作用。因此，選取50、100、200 μg/mL圣草次苷研究其對H2O2誘導HUVEC細胞生長的影響。

圖4 H2O2和圣草次苷對HUVEC細胞生長的影響Fig.4 Effects of H2O2 and eriocitrin on the growth of HUVEC cells

氧化應激是一種自由基積累過多導致的負面作用，會使健康細胞損傷和死亡。細胞存活率是反映氧化還原失衡環(huán)境對細胞損傷和死亡程度的最直觀指標，因此，細胞存活率下降是氧化應激模型建立成功的重要標志之一[18]。如圖4B所示，HUVEC細胞存活率隨著H2O2濃度的增加而降低，當H2O2濃度不超過0.4 mol/L時，其對HUVEC細胞損傷不明顯，細胞存活率仍在80%以上；當H2O2濃度為0.4 mol/L以上時，其對HUVEC細胞損傷明顯增強；當H2O2濃度為1.4 mol/L時，細胞存活率低于40%，表明成功構(gòu)建了H2O2誘導HUVEC細胞氧化應激模型。本實驗主要研究圣草次苷在自然衰老模型中對血管內(nèi)皮細胞的保護作用，H2O2濃度太高會導致細胞損傷嚴重難以恢復，因此，選取0.4 mol/L H2O2刺激HUVEC細胞建立氧化損傷模型。

由圖4C可知，與模型組相比，50、100、200 μg/mL圣草次苷處理均可顯著提高細胞存活率（P＜0.05），100 μg/mL圣草次苷對H2O2致HUVEC細胞氧化損傷的保護作用最強，但劑量效應不明顯。這與細胞形態(tài)學所觀察到的結(jié)果一致（圖5）。正常組HUVEC細胞呈棱形，貼壁緊密，生長良好；H2O2處理后細胞皺縮，呈圓形或橢圓形，且貼壁不緊密，與正常組相比，細胞 間距增加，細胞數(shù)量明顯減少。不同質(zhì)量濃度圣草次苷 與H2O2同時處理HUVEC細胞24 h后，大多細胞呈棱形，形態(tài)正常，與模型組相比細胞數(shù)量明顯增多。綜合以上結(jié)果，選取50、100 μg/mL圣草次苷進行后續(xù)實驗。

圖5 圣草次苷對H2O2誘導的HUVEC細胞形態(tài)的影響（×100）Fig.5 Effect of eriocitrin on the morphology of HUVEC cells treated with H2O2 (× 100)

2.3 圣草次苷對H2O2誘導HUVEC細胞內(nèi)ROS水平的影響

ROS由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶、脂氧化酶或環(huán)氧化酶還原形成[19]。當機體受到外界脅迫時，ROS可以作為信號分子調(diào)節(jié)生物學和生理過程以緩解脅迫，細胞分化、組織再生和防止衰老等細胞過程都需要ROS作為氧化還原信號參與[20]。然而，高水平的ROS引起氧化還原狀態(tài)失衡及細胞DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)破壞[21]。 ROS探針DCFH-DA進入細胞后水解成DCFH，被細胞內(nèi)ROS氧化發(fā)出熒光，胞內(nèi)ROS水平與其熒光強度成正比。由圖6可知，與正常組相比，暴露在H2O2環(huán)境下HUVEC細胞內(nèi)ROS水平顯著升高（P＜0.05）；采用圣草次苷和H2O2共培養(yǎng)HUVEC細胞，細胞的ROS水平較模型組顯著降低（P＜0.05），表明圣草次苷能通過阻止H2O2誘導胞內(nèi)ROS水平升高，減輕ROS對HUVEC細胞造成的氧化損傷。

圖6 圣草次苷對H2O2誘導HUVEC細胞ROS水平的影響Fig.6 Effect of eriocitrin on ROS level in HUVEC cells induced by H2O2

2.4 圣草次苷對H2O2誘導HUVEC細胞MDA含量的影響

暴露于臭氧、氮氧化物、高氧和某些異質(zhì)生物等環(huán)境可能會促使生物膜的多不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化，促進MDA等脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生。細胞內(nèi)的MDA由細胞膜磷脂中類似的脂肪酰基過氧化物分解而產(chǎn)生，也是前列腺素合成中環(huán)氧合酶反應的產(chǎn)物[22]。由圖7可知，與正常組相比，H2O2刺激HUVEC細胞的MDA含量顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，50、100 μg/mL圣草次苷均顯著降低了氧化應激模型細胞MDA含量的上升 （P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性。模型組MDA含量顯著升高表明HUVEC細胞受到H2O2刺激后，細胞膜發(fā)生嚴重脂質(zhì)氧化損傷；而圣草次苷顯著降低細胞MDA含量，表明圣草次苷能減輕H2O2引發(fā)的脂質(zhì)氧化作用，對抗氧化應激損傷。

圖7 圣草次苷對H2O2誘導HUVEC細胞MDA含量的影響Fig.7 Effect of eriocitrin on MDA content in HUVEC cells induced by H2O2

2.5 圣草次苷對H2O2誘導HUVEC細胞抗氧化物酶系 活力的影響

SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶組成了機體的抗氧化酶系，一旦機體氧化還原平衡失衡，抗氧化酶系統(tǒng)催化抗氧化反應以抵御外界氧化應激刺激原，避免組織和細胞遭受過氧化物損害[23]?？寡趸赶到y(tǒng)通過將能量代謝產(chǎn)生的電子傳遞給ROS發(fā)揮抗氧化活性。當體內(nèi)氧化脅迫較弱時，抗氧化系統(tǒng)能有效發(fā)揮電子傳遞作用，使細胞完成抗氧化反應。然而，當細胞氧化脅迫較強，體內(nèi)ROS短期內(nèi)大量增加，細胞就需要通過外源抗氧化劑獲得更強的抗氧化能力[24]。由圖8可知，與正常組相比，模型組的GSH-Px、CAT、SOD活力顯著降低 （P＜0.05）；與模型組相比，50、100 μg/mL圣草次苷顯著抑制了H2O2引起的HUVEC細胞中GSH-Px、CAT、SOD活力的下降（P＜0.05），且呈明顯劑量效應。結(jié)果表明，H2O2降低HUVEC胞內(nèi)抗氧化酶系活力，破壞了細胞的氧化應激動態(tài)平衡，從而引起細胞氧化損傷，HUVEC細胞氧化應激模型構(gòu)建成功；而在圣草次苷與H2O2聯(lián)合培養(yǎng)HUVEC細胞24 h后，細胞抗氧化物酶系活力的下降趨勢得到明顯緩解，表明圣草次苷能減輕H2O2對細胞抗氧化物酶系的破壞作用，提高了細胞的氧化應激調(diào)控能力，從而減輕了細胞的氧化損傷。

圖8 圣草次苷對H2O2誘導HUVEC細胞抗氧化物酶系活力的影響Fig.8 Effect of eriocitrin on the activity of antioxidant enzymes in HUVEC cells induced by H2O2

2.6 圣草次苷對H2O2誘導HUVEC細胞Bax、Bcl-2和p53蛋白表達的影響

抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax在細胞凋亡過程中扮演重要角色，Bcl-2/Bax比值與細胞凋亡的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。p53蛋白可介導DNA損傷后發(fā)生的細胞應激反應，參與DNA損傷修復和細胞周期運行等活動。正常細胞內(nèi)Bax和p53蛋白含量較低，Bcl-2蛋白含量較高。當外界環(huán)境刺激損傷細胞DNA時，胞內(nèi)Bax和p53表達量上升，Bcl-2表達量下降，細胞努力自我修復損傷的DNA，若無法修復，細胞則發(fā)生死亡[25]。由圖9可知，與正常組相比，模型組的Bax和p53蛋白相對表達量顯著增加 （P＜0.05），Bcl-2蛋白相對表達量降低，Bcl-2/Bax比值顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，50、100 μg/mL 圣草次苷處理組中Bax和p53蛋白表達量均顯著降低 （P＜0.05），Bcl-2蛋白表達量顯著升高，Bcl-2/Bax比值顯著升高（P＜0.05），具有劑量依賴效應。

圖9 圣草次苷對HUVEC細胞中Bcl-2、Bax和p53蛋白表達的影響Fig.9 Effect of eriocitrin on Bax/Bcl-2 ratio and p53 protein expression in HUVEC cells

3 討 論

H2O2是一種重要的ROS分子，常作為體外氧化應激損傷的造模藥物，氧化應激引起的血管內(nèi)皮細胞損傷是動脈粥樣硬化形成的重要發(fā)病機制之一，可導致血管內(nèi)皮細胞氧化損傷和功能障礙[26-27]。本研究采用橙皮苷制備圣草次苷，構(gòu)建了HUVEC細胞H2O2氧化應激損傷模型，研究圣草次苷對HUVEC細胞氧化損傷的保護作用，并對其抗氧化損傷作用機制進行了探討。研究發(fā)現(xiàn)，圣草次苷明顯緩解了H2O2對HUVEC細胞造成的氧化損傷，這種保護作用至少可以持續(xù)24 h，且50～400 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)圣草次苷對HUVEC細胞沒有明顯的細胞毒性作用，表明圣草次苷具有較好的預防和治療內(nèi)皮細胞損傷的潛力。

ROS屬于體內(nèi)高活性分子，可由機體新陳代謝產(chǎn)生，過量的ROS會升高脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平。機體抗氧化酶（SOD、CAT和GSH-Px）是人體抗氧化天然防御系統(tǒng)的重要組成部分[28]。本研究結(jié)果顯示，圣草次苷可明顯降低H2O2誘導氧化應激HUVEC細胞的ROS水平和MDA含量，提高GSH-Px、SOD和CAT活力，提示圣草次苷可以提高機體清除氧自由基效率和抗氧化能力，減輕HUVEC細胞受到氧化應激損傷。

細胞氧化還原狀態(tài)也是細胞凋亡執(zhí)行的“開關(guān)”。促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2是調(diào)節(jié)細胞凋亡的主要參與者和解碼者，通過調(diào)節(jié)氧化還原平衡狀態(tài)實現(xiàn)對細胞凋亡的控制[29]。在氧化應激條件下，p53蛋白能夠與線粒體基質(zhì)中的親環(huán)素D形成復合物，使線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔打開，引起線粒體內(nèi)容物釋放，最終導致細胞壞死[30]。一般，p53與Bax的表達變化趨勢一致。抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸促進Bcl-2表達，但同時抑制Bax和p53表達。然而，也存在p53與Bax表達水平不一致的特殊情況，例如，抗氧化劑二硫代氨基甲酸吡咯烷促進Bax表達以抵抗Bcl-2的作用，而對p53的影響較小[31]。本研究采用Western blotting法分析HUVEC細胞中Bax、Bcl-2和p53蛋白表達情況。結(jié)果表明，模型組中H2O2能下調(diào)Bcl-2表達和Bcl-2/Bax比值，上調(diào)p53和Bax蛋白表達；與模型組相比，圣草次苷能上調(diào)Bcl-2表達和Bcl-2/Bax比值，下調(diào)p53和Bax蛋白表達，說明圣草次苷對p53與Bax蛋白表達的影響趨勢基本一致。綜上所述，圣草次苷對H2O2誘導的HUVEC細胞氧化應激損傷具有一定的保護作用，其機制可能與提高自由基清除能力和抑制細胞凋亡有關(guān)。

4 結(jié) 論

本實驗采用的合成方法能有效簡化傳統(tǒng)圣草次苷提取純化工藝，提高圣草次苷得率和純度。圣草次苷對氧化應激損傷HUVEC細胞具有良好的保護作用，主要是通過降低細胞MDA含量、提高抗氧化酶系活力、上調(diào)Bcl-2/Bax 比值和下調(diào)p53表達來抑制氧化應激和細胞死亡。本研究為圣草次苷作為功能性營養(yǎng)添加劑在心血管疾病防治中的應用提供了理論參考。若將具有較好抗氧化作用且對HUVEC細胞無毒性作用的活性物質(zhì)與圣草次苷協(xié)同使用，可能會更好地緩解內(nèi)皮細胞抗氧化應激損傷。心血管疾病發(fā)生發(fā)病機理復雜，需要進一步采用體內(nèi)實驗和驗證性臨床實驗探討圣草次苷對血管的保護作用。