紅毛丹果皮中老鸛草素的分離純化及其熱穩(wěn)定性

李鈺景，孫麗平，莊永亮*

（昆明理工大學農(nóng)業(yè)與食品學院，云南 昆明 650500）

紅毛丹（Nephelium lappaceumL.），又稱毛荔枝，原產(chǎn)于馬來西亞，我國云南省的西雙版納和海南保亭等地已發(fā)展種植[1]。紅毛丹果實多汁多肉，可加工成水果罐頭等產(chǎn)品；其果皮多為紅色、披毛、易剝除，約占果實總質(zhì)量的50%[2]。在東南亞，紅毛丹果皮常用于抗菌和抗病毒感染，可用于治療發(fā)燒、痢疾、腹瀉等癥狀，是東南亞傳統(tǒng)藥物來源之一。

近幾年來，本團隊解析了紅毛丹果皮多酚（rambutan peel polyphenols，RPP）的制取工藝、活性成分及其生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，紅毛丹果皮中酚類化合物含量高，可達果皮干質(zhì)量的21%[3]；RPP中的主要物質(zhì)成分為老鸛草素、柯里拉京、鞣花酸等[4]；其多酚提取物具有顯著的抗衰老[5]、抗高糖應激損傷[6]、保護皮膚抵御光老化損傷[7]等生物活性，可提高大鼠抗維甲酸誘導的骨質(zhì)疏松癥的能力、保護RAW264.7細胞系不被破骨細胞分化因子誘導分化為破骨細胞等[8]。RPP對小鼠急性口服毒性的半數(shù)致死量大于5 000 mg/kgmb，在625 mg/kgmb的口服劑量下未對實驗動物造成亞急性毒性[9]。紅毛丹果皮作為產(chǎn)業(yè)廢棄物，其酚類物質(zhì)含量高、制取工藝簡單、生物活性高等優(yōu)異的性能吸引了越來越多研究者們的興趣和關(guān)注[10-11]。

老鸛草素是一種鞣花單寧晶體，其分子結(jié)構(gòu)中同時含有2 種類型的鞣花單寧取代基（六羥基聯(lián)苯二?；╤exahydroxydiphenoyl，HHDP）和去氫六羥基聯(lián)苯二?；╠ehydrohexahydroxydiphenoyl，DHHDP）），其葡萄糖核上還連接一個沒食子酸?；＠消X草素表現(xiàn)出顯著的抗炎和抗骨質(zhì)疏松活性，被認為是大戟科、苦木科、牻牛兒苗科等傳統(tǒng)中草藥-的活性物質(zhì)基礎[12]。

本實驗基于前期的研究，以新鮮紅毛丹為原料，擬探索從紅毛丹果皮中快速提取高純度老鸛草素的工藝，同時對純化老鸛草素的熱穩(wěn)定性進行分析，對其降解產(chǎn)物進行表征，為紅毛丹果皮高值化利用和紅毛丹果皮多酚在食品、藥物中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅毛丹購于云南墨江縣農(nóng)貿(mào)市場。挑選果皮全紅、無蟲害的果實，依次將其用流動水和蒸餾水清洗后平鋪于濾紙上自然晾干，收集果皮。

老鸛草素（標準品）（純度＞98%） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙醇、乙腈（色譜純） 德國默克公司；甲酸（色譜純） 美國Sigma公司；無水乙醇、甲醇等為分析純。

1.2 儀器與設備

LC-MS-8040型超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography triple quadruple mass spectrometry，UPLC-QqQ-MS）儀日本島津公司；1260制備型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；Q-Exactive Focus型超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-quadrupole-Orbitirp-MS，UPLC-Q-Orbitirp-MS）、U3000分析型高效液相色譜儀 美國賽默飛公司；中壓分離裝置 瑞士步琦公司。

1.3 方法

1.3.1 紅毛丹果皮干燥處理、干燥方式的優(yōu)化

將收集的紅毛丹果皮分成5 份，分別進行室溫通風干燥（自然風干）、40 ℃鼓風干燥、60 ℃鼓風干燥、80 ℃鼓風干燥和真空冷凍干燥處理，待果皮至質(zhì)量不再變化視為干燥完全。將5 種干燥方式得到的干燥果皮粉碎，過40 目篩，取篩下物于聚乙烯樣品袋中于-20 ℃凍藏備用。

準確稱取1 g果皮樣品，加入100 mL體積分數(shù)60%乙醇溶液，超聲時間10 min，離心（4 000 r/min、15 min），取上清液，得到果皮多酚提取液，真空冷凍干燥后得到多酚制取物，并稱其質(zhì)量，按公式（1）計算多酚制取物的產(chǎn)率。按Sun Liping等[3]的方法測定5 種方式干燥處理的果皮中總酚含量和體外抗氧化活性，按1.3.3節(jié)方法測定老鸛草素含量，優(yōu)選果皮干燥處理方式。

1.3.2 老鸛草素的快速分離純化

老鸛草素的快速分離純化經(jīng)過兩個步驟實現(xiàn)：中壓液相色譜反相C18柱系統(tǒng)和制備型高效液相色譜C18柱系統(tǒng)。

中壓液相色譜反相C18柱系統(tǒng)初步純化老鸛草素：以最優(yōu)方式干燥處理的果皮粉為原料，得到多酚提取液，減壓濃縮制成浸膏，根據(jù)m（果皮粉）∶m（硅膠）=1∶3的比例與細粒硅膠攔樣，裝柱，接入系統(tǒng)，利用甲醇-去離子水洗脫，按照每瓶200 mL定量分批接收洗脫流分。收集老鸛草素組分，減壓濃縮得到中壓分離組分，備用。C18柱系統(tǒng)分離洗脫條件：色譜柱：填料為反相C18材料，粒徑30～50 μm，中壓玻璃柱（36 mm×310 mm）；流動相A：去離子水；流動相B：無水甲醇；流速 20 mL/min；洗脫梯度：0～40 min，15% B；40～80 min，20% B；80～120 min，25% B；120～160 min，30% B；160～200 min：35% B；200～240 min，100% B。

制備型高效液相色譜純化老鸛草素：將減壓濃縮的老鸛草素組分用色譜純甲醇稀釋，采用Shimadzu C18制備型色譜柱（250 mm×20 mm，5 μm）分離，流動相為體積分數(shù)15%甲醇溶液，流速為10 mL/min。收集老鸛草素組分，減壓濃縮后得到制備型液相色譜組分，凍干備用。

1.3.3 老鸛草素的定量分析

采用UPLC-QqQ-MS法對紅毛丹果皮多酚制取物 及分離純化組分中的老鸛草素進行定量分析。色譜分離和洗脫條件：Infinity Lab Poroshell 120 ECC18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相A：體積分數(shù)0.1%甲酸溶液，流動相B：乙腈；梯度洗脫：0～1 min，5% B；1～5 min，5%～15% B；5～10 min，15%～38% B；10～15 min，38%～65% B；15～18 min，65%～80%B；18～20 min，80%～100% B；20～22 min，100% B；流速為 0.2 mL/min，進樣體積為2.0 μL；柱溫箱溫度為35 ℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離（electron spray ionization，ESI）源，采用負離子模式，霧化氣流為3 L/min；傳輸線溫度250 ℃；加熱塊溫度350 ℃；干燥氣流15 L/min。以老鸛草素標準物質(zhì)的質(zhì)譜信息進行定性和定量，分析計算果皮中老鸛草素的含量，并按公式（2）～（4）分別計算老鸛草素產(chǎn)率、純度、回收率。

式中：m1為組分中老鸛草素質(zhì)量/mg；m2為果皮原料的干質(zhì)量/mg；m3為組分干物質(zhì)質(zhì)量/mg；m4為這一步純化前老鸛草素的質(zhì)量/mg。

1.3.4 老鸛草素熱穩(wěn)定性分析

將純化后的老鸛草素溶于色譜乙醇中，配制成300 mg/L溶液，置于60 ℃和100 ℃的水浴鍋中加熱10 h，每2 h取樣。加熱前后的樣品體系采用UPLC-Q-Orbitrap-MS進行定性分析。色譜分離和洗脫條件同1.3.3節(jié)。質(zhì)譜條件：ESI-離子源，掃描范圍m/z100～1 000； 噴霧電壓3.5 kV、毛細管傳輸溫度320 ℃、干燥器溫度350 ℃；一級和二級質(zhì)譜的分辨率分別為70 000 和35 000。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個實驗至少3 次重復，使用Microsoft Office Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，P＜0.05表示差異顯著；UPLC-Q-Orbitrap-MS測定數(shù)據(jù)采用Thermo Χcalibur Qual Browser軟件進行定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干燥方式對紅毛丹果皮總酚含量、老鸛草素含量 及抗氧化活性的影響

如表1所示，5 種干燥方式對紅毛丹果皮中總酚含量、老鸛草素含量及其的體外抗氧化活性有顯著影響。 真空冷凍干燥的紅毛丹果皮中總酚含量最高，可達278.33 mg/g，顯著高于其他4 種干燥方式處理的果皮；其老鸛草素含量為12.67 g/100 g，顯著高于自然風干、40 ℃鼓風烘干和80 ℃鼓風干燥的果皮，但與60 ℃鼓風干燥的果皮中老鸛草素含量（12.07 g/100 g）沒有顯著性差異。在抗氧化活性方面，冷凍干燥果皮抗氧化活性最高，其次是60 ℃鼓風干燥的紅毛丹果皮，且60 ℃鼓風干燥的紅毛丹果皮1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和抑制脂質(zhì)體過氧化能力均與冷凍干燥紅毛丹果皮無顯著差異。

表1 5 種干燥方式處理對紅毛丹果皮總酚含量、老鸛草素含量 及抗氧化活性的影響Table 1 Effects of five drying processes on total phenolic content, geraniin content and antioxidant activity of rambutan peel

2.2 老鸛草素的分離純化結(jié)果

基于總酚含量及其制取物的抗氧化活性，結(jié)合真空冷凍干燥技術(shù)對物料品質(zhì)保持的優(yōu)勢[13]，本實驗選用真空冷凍干燥的紅毛丹果皮作為多酚和老鸛草素制取原料。經(jīng)測定，真空冷凍干燥紅毛丹果皮多酚制取物的產(chǎn)率為54.34%（以果皮干質(zhì)量計），多酚制取物中總酚含量為537.00 mg/g，老鸛草素含量為320.90 mg/g。 Palanisamy等[14]采用乙醇對40 ℃鼓風干燥的紅毛丹果皮進行振蕩提取，制取物產(chǎn)率為17.8%，總酚含量為762 mg/g，與本次實驗結(jié)果略有差異，可能是原料品種、干燥方式、提取方式的不同導致的。本團隊在前期研究中，采用大孔樹脂對紅毛丹果皮多酚制取物進行純化，純化前后總酚含量分別為579.72 mg/g和877.11 mg/g[4]。

采用中壓液相色譜系統(tǒng)和制備型高效液相色譜系統(tǒng)探索紅毛丹果皮多酚制取物中老鸛草素的快速分離純化技術(shù)，結(jié)果如表2所示。經(jīng)過中壓液相色譜C18柱系統(tǒng)分離和純化，再經(jīng)UPLC-QqQ-MS系統(tǒng)進行定量分析，老鸛草素純度為59.76%，回收率為85.70%。將收集的老鸛草素組分采用制備型液相色譜系統(tǒng)純化，洗脫的老鸛草素純度為95.63%，回收率為47.32%，最終得到的純化后老鸛草素的產(chǎn)率為6.00%。

表2 紅毛丹果皮中老鸛草素純化的定量分析結(jié)果Table 2 Summary of purification of geraniin from rambutan peel

2.3 老鸛草素熱穩(wěn)定性研究結(jié)果

熱處理可顯著影響老鸛草素的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖1 所示。60 ℃處理10 h，老鸛草素質(zhì)量濃度從加熱前的304.48 μg/mL下降至252.31 μg/mL，損失了17.13%。100 ℃加熱2 h的過程中，老鸛草素快速降解，其損失率可達73.97%，加熱10 h時未檢出老鸛草素。研究認為鞣花單寧結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，其在液體環(huán)境中極易被堿、溫度、光照、酶、微生物等因素破壞，降解產(chǎn)生一系列的同源衍生物[15]。Sójka等[16]研究了覆盆子鞣花單寧Lambertianin C 和Sanguiin H-6混合物在不同pH值和不同溫度下的穩(wěn)定性，研究發(fā)現(xiàn)，溫度對覆盆子鞣花單寧穩(wěn)定性的影響最大，在中性和弱堿性下，60～80 ℃的溫度即可快速破壞覆盆子鞣花單寧的原體結(jié)構(gòu)。

圖1 熱處理對老鸛草素穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of heating treatment on the stability of geraniin

對純化后老鸛草素進行加熱處理，利用UPLC-QOrbitrap-MS在降解體系中主要鑒定出7 種化合物，其具體離子碎片信息見表3。根據(jù)這6 種化合物的二級碎片離子的m/z，對比MassBank數(shù)據(jù)庫信息、文獻[16]，確定這6 種化合物分別為六羥基聯(lián)苯二甲酸、沒食子酸、云實酸、柯里拉京、Galloyl-bis-HHDP-glucose、鞣花酸、云實素。

表3 老鸛草素產(chǎn)品分解產(chǎn)物定性結(jié)果Table 3 Qualitative analysis of geranin decomposition products

老鸛草素的熱降解產(chǎn)物均為酚類物質(zhì)，根據(jù)降解產(chǎn)物，推測其熱降解過程如圖2所示。老鸛草素D-吡喃葡萄糖核上的“O-5”鍵水解，可生成沒食子酸；葡萄糖核上酯化的HHDP水解后再經(jīng)分子內(nèi)酯化生成鞣花酸。老鸛草素可水解去掉DHHDP結(jié)構(gòu)生成化合物柯里拉京，DHHDP結(jié)構(gòu)可經(jīng)過苯甲酸重排形氧代環(huán)戊烷甲酸結(jié)構(gòu)的中間產(chǎn)物[12]，經(jīng)脫羧、降解和分子內(nèi)酯化形成化合物云實酸，云實酸脫羧形成云實素[16]。

圖2 老鸛草素熱降解過程及產(chǎn)物Fig.2 Thermal degradation process and products of geraniin

3 討 論

近年來，真空冷凍干燥技術(shù)在食品干制方面表現(xiàn)出諸多優(yōu)勢，如可最大程度保留物料原有的結(jié)構(gòu)、形狀、色澤、風味、營養(yǎng)性和功能性物質(zhì)成分等，其干制產(chǎn)品具有較好的復水性等，被認為是保持食品品質(zhì)最好的方法[13]。 但是常規(guī)的真空冷凍干燥速度緩慢、耗能成本高[17]。 從新鮮原料干制角度，60 ℃鼓風干燥技術(shù)設備簡單易實現(xiàn)、運行成本低，也可以作為原料的干燥方式。后期研究可探討60 ℃鼓風干燥果皮中老鸛草素的制取、純化和穩(wěn)定性等技術(shù)和性質(zhì)。

基于紅毛丹果皮富含酚類物質(zhì)及其表現(xiàn)的顯著生物活性，Hernández-Hernández等[18]和Rakariyatham[2]等先后詳細論述了紅毛丹果皮生物活性的物質(zhì)基礎，分析了其對人體的健康促進作用，探討了其在食品和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中應用的可能性，強調(diào)了老鸛草素的存在及其生物作用。對于紅毛丹果皮中的老鸛草素，Thitilertdecha等[19]采用Sephadex LH-20型填料柱層析技術(shù)對紅毛丹果皮甲醇制取物進行組分分離，監(jiān)測并收集得到富含鞣花酸、柯里拉京和老鸛草素的組分。Palanisamy等[20]采用LiChroprep RP-18填料柱層析技術(shù)和制備型液相色譜技術(shù)對紅毛丹果皮甲醇制取物中的老鸛草素進行分離純化，老鸛草素產(chǎn)率為3.79%。Perera等[21]采用C18型反向填料柱層析技術(shù)對紅毛丹果皮中老鸛草素進行分離純化，純化后組分采用低溫結(jié)晶處理，得到純度接近98%的老鸛草素產(chǎn)品，產(chǎn)率為4.97%。本實驗基于已有的研究，研究了中壓C18柱系統(tǒng)聯(lián)合制備型液相色譜對紅毛丹果皮多酚制取物中老鸛草素的分離純化技術(shù)。比較上述相關(guān)研究，本方法的一次處理量、處理時間、產(chǎn)品純度與前人研究相當，但是老鸛草素產(chǎn)率更高。

目前普遍認同植物單寧是指相對分子質(zhì)量在500～3 000之間的水溶性多酚類化合物，具有顯著的生物活性，在醫(yī)藥、食品、日用化工等領域具有較高的應用預期[22]。鞣花單寧是分布廣、種類多、生物活性顯著的一大類植物丹寧，通過攝入蔬菜和水果，人體日均膳食鞣花單寧類物質(zhì)為4～12 mg[23]。對于鞣花單寧在液體環(huán)境中的穩(wěn)定性，Tanaka等[12]研究了老鸛草素在弱堿性環(huán)境下乙腈溶液中的穩(wěn)定性，鑒定了柯里拉京、云實酸衍生物、云實酸等降解產(chǎn)物，并揭示了鞣花單寧與降解產(chǎn)物之間的轉(zhuǎn)化關(guān)系。有研究表明，盡管鞣花酸被認為是鞣花單寧的水解產(chǎn)物，但鞣花單寧水解體系中鞣花酸的最大濃度可隨原體中沒食子?；康脑黾佣黾樱皇请S著HHDP基團含量的增加而增加[16]。由此可推測，鞣花單寧 降解產(chǎn)生的沒食子酸可能會發(fā)生氧化偶聯(lián)反應，生成六羥基聯(lián)苯二甲酸，再經(jīng)過分子內(nèi)酯化生成鞣花酸[16]。值得注意的是，鞣花單寧在光、熱、酸堿等影響因素下，其降解產(chǎn)物的生物安全性也是需要探討的[24]。

盡管鞣花單寧具有顯著的生物活性，但是鞣花單寧原體一般不能被生物體直接吸收利用，最終分布于組織及血液中的濃度往往低于其發(fā)揮生物學功能的有效濃度，從而阻礙其在生產(chǎn)上的應用性[25]。鞣花單寧和鞣花酸的生物利用度較低，部分未被吸收的鞣花酸可在哺乳動物胃腸道菌群的作用下代謝為更易吸收的尿石素類物質(zhì)[26]，并被認為是鞣花單寧和鞣花酸在體內(nèi)發(fā)揮生物活性的物質(zhì)基礎[27]。有研究合成并表征了尿石素系列物的生物活性，發(fā)現(xiàn)具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的尿石素C具有與老鸛草素、柯里拉京和鞣花酸相當?shù)腄PPH自由基清除 活性[28]，不具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的尿石素A表現(xiàn)出顯著的氧自由基吸收能力[29]，也可證實尿石素系列物是鞣花單寧在體內(nèi)發(fā)揮生物活性的物質(zhì)基礎。老鸛草素作為典型的鞣花單寧，其相對分子質(zhì)量為952，鑒定出的其熱降解產(chǎn)物均是相對分子質(zhì)量更低的生物活性酚類物質(zhì)，提示可進一步研究其可控降解手段，特別是關(guān)注其在生物腸道代謝過程中的形態(tài)變化和跨膜行為[30]，這對于富含鞣花單寧的紅毛丹果皮酚類制取物的科學合理利用具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究從新鮮紅毛丹果皮出發(fā)，探討了原料的干燥方式對總酚、老鸛草素含量及其制取物體外抗氧化活性的影響，工藝簡單可行、耗能成本低的60 ℃鼓風干燥可以作為原料干制的有效方法。紅毛丹果皮多酚制取物經(jīng)中壓液相色譜C18柱系統(tǒng)和制備型高效液相色譜分離和純化可得純度為95.63%的老鸛草素產(chǎn)品，產(chǎn)率為6.00%。純化的老鸛草素不耐高溫，鑒定出的熱降解產(chǎn)物均是分子質(zhì)量更低的生物活性酚類物質(zhì)。本研究為紅毛丹果皮富含的可水解鞣花單寧老鸛草素的開發(fā)和利用提供了技術(shù)支持和理論基礎。后續(xù)研究可進一步對純化后老鸛草素的可控降解及其生物有效性進行探討。