連續(xù)光源火焰原子吸收光譜法同時測定血清中鋅、銅、鐵蛋白結合態(tài)含量

徐 緯,李 軍,胡 勇,于 春,秦 旭,羅茹丹

(貴州醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院,環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室,貴陽 550025)

鋅、銅、鐵等微量元素與人體健康關系密切[1-6],在過往研究中,研究者主要探討微量元素總量與疾病的關系,對元素形態(tài)檢測的關注較少。微量元素在機體組織中的存在形態(tài)多樣,主要以與生物大分子結合的形態(tài)和自由離子形態(tài)存在[7],僅檢測組織中元素總量難以準確反映微量元素對疾病的影響機制,且體內微量元素主要以與蛋白結合的形態(tài)發(fā)揮生物學效應,故元素蛋白結合態(tài)檢測對疾病預防、診斷、治療及其機制研究具有更重要的價值。

血液和尿液是疾病研究與診治的重要檢測對象,其元素分析方法很多[8-13],主要以原子吸收光譜法(AAS)和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)應用較廣泛,但ICP-AES的高純氬氣消耗量大,檢測成本較高。AAS目前以連續(xù)光源技術較為先進,與銳線光源技術相比,其背景校正更精準,檢出限更低,在多元素測定時無需更換空心陰極燈[14-16]。

血清中元素形態(tài)分為蛋白結合態(tài)和非蛋白結合態(tài),元素與蛋白質結合而存在的形態(tài)稱為元素蛋白結合態(tài),其他存在形態(tài)皆稱為元素非蛋白結合態(tài)。目前國內外關于血清中元素蛋白結合態(tài)測定的相關研究較少。在已報道的方法中[17-19],其前處理方法基本相同,測定元素總形態(tài)時采用1%(體積分數(shù),下同)硝酸溶液直接稀釋血清,測定非蛋白結合態(tài)時采用無水乙醇沉淀分離蛋白質,但存在血清樣本消耗量較大、多元素測定時操作復雜、石墨爐法分析速率慢等問題。本工作以Sprague Dawley(SD)大鼠血清為方法學試驗對象,對上述前處理方法進行了改進,探索建立了連續(xù)光源火焰原子吸收光譜法同時測定血清中鋅、銅、鐵等元素蛋白結合態(tài)含量的方法,降低了血清樣本消耗量,可供臨床檢驗和疾病基礎研究中血清蛋白結合態(tài)多元素同時測定時參考使用。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Contr AA700 型連續(xù)光源火焰原子吸收光譜儀;Mettler Toledo AB265-S 型電子天平;Milli-Q型超純水儀;QL-861型漩渦混合器;Z36HK 型高速冷凍離心機。

鋅、銅、鐵單元素標準儲備溶液:1 000 mg·L－1。

鋅、銅、鐵混合標準儲備溶液:5.00 mg·L－1,移取1 000 mg·L－1鋅、銅、鐵單元素標準儲備溶液各0.50 mL,用1%硝酸溶液稀釋,定容至100 mL容量瓶中,搖勻,配制成質量濃度為5.00 mg·L－1的鋅、銅、鐵混合標準儲備溶液。

硝酸、無水乙醇均為優(yōu)級純;試驗用水為超純水(電阻率大于18.2 MΩ·cm)。

SD 大鼠(8周齡,雄性,貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供)。

1.2 儀器工作條件

乙炔-空氣(C2H2-Air)火焰;燃燒器高度為6 mm;助燃氣流量為470 L·h－1。鋅、銅、鐵等元素測定的其他儀器工作參數(shù)見表1。

表1 儀器工作參數(shù)Tab.1 Working parameters of the instrument

1.3 試驗方法

1.3.1 血清中鋅、銅、鐵總形態(tài)含量測定

取SD 大鼠血清0.5 mL,加入0.25 mL硝酸,靜置10 min,用水稀釋至25 mL,搖勻,按儀器工作條件測定;以水為空白樣品,同法做試劑空白試驗。

1.3.2 血清中鋅、銅、鐵非蛋白結合態(tài)含量測定

取上述相同SD 大鼠血清0.5 mL,加入65%(體積分數(shù),下同)乙醇溶液6.0 mL,漩渦混勻5 min,以轉速10 000 r·min－1離心5 min,上清液用0.45μm 有機系濾頭過濾。取濾液5.0 mL,用2%(體積分數(shù))硝酸溶液稀釋至10 mL,搖勻,按儀器工作條件測定;以水為空白樣品,同法做試劑空白試驗。

1.3.3 血清中鋅、銅、鐵蛋白結合態(tài)含量的計算

血清中元素蛋白結合態(tài)含量等于該元素總形態(tài)含量減去其非蛋白結合態(tài)含量。

2 結果與討論

2.1 前處理方法的選擇

血液中鐵元素主要分布于紅細胞中,在樣本采集和血清制備時要避免發(fā)生溶血現(xiàn)象。

2.1.1 測定血清中元素總形態(tài)含量和非蛋白結合態(tài)含量的前處理方法

在測定血清中元素總形態(tài)含量時,若血清直接用1%硝酸溶液稀釋定容[18-19],則血清溶液在較長時間內呈渾濁狀;而試驗選擇先在血清中加入適量硝酸,靜置10 min,使血清中有機質消解,再用水稀釋,使介質相當于1%硝酸溶液,所得血清溶液澄清。

在測定血清中元素非蛋白結合態(tài)含量時,需確保血清中蛋白質沉淀完全且蛋白結合態(tài)元素不脫落、非蛋白結合態(tài)元素不發(fā)生沉淀反應,因此血清蛋白質沉淀劑的選擇較為關鍵。試驗發(fā)現(xiàn),在血清中直接加入蛋白質沉淀劑無水乙醇時[17-19],沉淀速率較快,未能形成疏松細小沉淀,另血清具有一定的黏稠度,沉淀將可能包裹少量血清和游離元素。試驗選擇在0.5 mL 血清中加入65%乙醇溶液6.0 mL[相當于介質為60%(體積分數(shù))乙醇溶液],此時蛋白質沉淀率較高[18-19],且血清溶液能在快速混勻過程中溫和地形成疏松細小的蛋白質沉淀,當漩渦混勻時間大于3 min時,元素非蛋白結合態(tài)含量趨于平衡,最終確定漩渦混勻時間為5 min。

2.1.2 分離蛋白質沉淀的前處理方法

在分離蛋白質沉淀時,不同分離方法對元素非蛋白結合態(tài)含量測定影響較大。濾膜過濾法能有效分離沉淀,但蛋白質沉淀容易堵塞濾膜;離心分離法操作簡便,但在吸取上清液時容易吸入少量沉淀而影響測定結果。因此,試驗采用先離心后過濾的沉淀分離方法,以保證元素非蛋白結合態(tài)含量測定的準確性。為避免不同硝酸介質濃度對測定產(chǎn)生影響,試驗在制備供試品溶液時均控制介質硝酸溶液的體積分數(shù)為1%。

2.2 標準曲線和檢出限

移取鋅、銅、鐵混合標準儲備溶液,用1%硝酸溶液逐級稀釋,配制成質量濃度為0.01,0.02,0.05,0.10,0.20,0.50 mg·L－1的混合標準溶液系列,按儀器工作條件測定。以各元素的質量濃度為橫坐標,其對應的吸光度為縱坐標繪制標準曲線。結果表明:鋅、銅、鐵的質量濃度在0.01～0.50 mg·L－1內與其對應的吸光度呈線性關系,線性回歸方程和相關系數(shù)見表2。

按1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)試驗方法分別制備空白溶液,在儀器工作條件下連續(xù)測定11次,計算測定值的標準偏差(s)。以3倍標準偏差與相應標準曲線斜率(k)之比計算方法的檢出限(3s/k),結果見表2。

表2 線性參數(shù)和檢出限Tab.2 Linearity parameters and detection limits

2.3 精密度試驗

精密度試驗對血清樣本需求量較大,需進行多只SD 大鼠血清混勻以制成足夠量的均質血清,混勻操作需緩慢,避免產(chǎn)生泡沫。試驗采集SD 雄性大鼠血清約15 mL,充分混勻后,按1.3.1 節(jié)和1.3.2節(jié)試驗方法分別制備6份供試品溶液,按儀器工作條件測定,計算血清中鋅、銅、鐵元素總形態(tài)含量、非蛋白結合態(tài)含量、蛋白結合態(tài)含量及測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表3。其中代表6次測定值的平均值±標準偏差(s)。

表3 精密度試驗結果(n＝6)Tab.3 Results of test for precision(n＝6)

由表3可知,血清中鋅、銅、鐵元素總形態(tài)、非蛋白結合態(tài)和蛋白結合態(tài)測定值的RSD 均小于5.0%,說明方法的精密度較好。

2.4 回收試驗

取12份SD 大鼠均質血清各0.5 mL,均分為4組,分別加入1.00 mg·L－1混合標準溶液0,0.20,0.40,0.60 mL,按1.3.1節(jié)試驗方法進行前處理,按儀器工作條件測定,計算元素總形態(tài)的加標回收率,結果見表4。

另取12份上述血清各0.5 mL,均分為4組,分別加入65%乙醇溶液6 mL,漩渦混勻5 min,分別加入1.00 mg·L－1混 合標準溶 液0,0.20,0.40,0.60 mL,按1.3.2節(jié)試驗方法進行后續(xù)處理,按儀器工作條件測定,計算元素非蛋白結合態(tài)的加標回收率,結果見表4。

表4 回收試驗結果Tab.4 Results of test for recovery

結果表明:在進行非蛋白結合態(tài)加標回收試驗時,若先在血清中加入混合標準溶液,鋅和銅的回收率略偏低,這可能是血清蛋白再次結合了少量加入的元素,因此試驗先沉淀血清蛋白后再加入混合標準溶液,獲得了較為理想的回收率;元素總形態(tài)和非蛋白結合態(tài)的含量測定方法準確度較高,加標回收率為95.3%～104%,進而保證了元素蛋白結合態(tài)含量測定結果的準確性。

2.5 樣品分析

取3只同批次健康SD 大鼠,在相同條件下采集血清,每只SD 大鼠血清均按1.3節(jié)試驗方法分別制備供試品溶液,按儀器工作條件測定,每只SD大鼠平行測定2次,計算每只SD 大鼠血清中鋅、銅、鐵各元素總形態(tài)、非蛋白結合態(tài)和蛋白結合態(tài)含量,結果見表5。

表5 樣品分析結果Tab.5 Analytical results of samples

結果表明:大鼠血清中鋅和銅元素主要以蛋白結合態(tài)存在,在總形態(tài)中占比在60%以上,鐵元素蛋白結合態(tài)占比相對較少。

本工作建立了一種連續(xù)光源火焰原子吸收光譜法同時測定血清中鋅、銅、鐵元素蛋白結合態(tài)含量的方法。試驗操作簡單,引入干擾較少,具有較好的靈敏度、精密度和準確度,可為臨床檢驗和疾病基礎研究中蛋白結合態(tài)多元素的同時測定提供參考。