2020年山東省部分地區(qū)鴨圓環(huán)病毒感染情況分析

高攀攀，李玲子，韋良孟，莊曉峰，劉金龍，朱瑞良，魏凱*

試驗研究

2020年山東省部分地區(qū)鴨圓環(huán)病毒感染情況分析

高攀攀1，李玲子1，韋良孟1，莊曉峰2，劉金龍2，朱瑞良1，魏凱1*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技院，山東 泰安 271018；2.山東貝瑞康生物科技有限公司，山東 濰坊）

為了解山東省部分地區(qū)2020年6～12月份鴨圓環(huán)病毒與其他病原體感染的情況，本實驗室對從聊城、東營、德州、濰坊、濟寧地區(qū)送檢的130份樣品進行了PCR鑒定及藥敏試驗，其中病毒檢測包括：鴨圓環(huán)病毒（DuCV）、腺病毒（FAV）、鴨細小病毒（DPV）、禽流感病毒（AIV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）、新型鴨呼腸弧病毒（NDRV）和鴨肝炎病毒（DHV）。結(jié)果表明：在130份樣品中，76份樣品檢測出病毒，其中DuCV檢出43份，約占56.58 %。86份樣品檢出細菌，占總樣本數(shù)28.46 %；DuCV與細菌混合感染37份，占DuCV陽性樣本數(shù)86.05 %。細菌單純感染時敏感藥物有四種，分別為鹽酸環(huán)丙沙星、硫酸慶大霉素、氨芐西林鈉、阿莫西林；細菌和DuCV混合感染時敏感藥物只有兩種，分別為硫酸慶大霉素和阿莫西林。說明DuCV在山東省部分地區(qū)存在著不同程度的流行，同時與細菌混合感染情況嚴(yán)重且增加了細菌的耐藥性。

鴨圓環(huán)病毒；單純感染；混合感染；檢出率

鴨圓環(huán)病毒（DuCV）是無囊膜結(jié)構(gòu)的DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）、圓環(huán)病毒屬（Circovirus），基因組全長在1 900～2 000 bp堿基之間[1-2]。DuCV分兩個基因型（1型和2型），臨床感染以基因1型為主[3]。鴨圓環(huán)病毒感染機體后臨床表現(xiàn)為羽毛雜亂、生長發(fā)育遲緩、體重下降、免疫功能減弱、多器官生長發(fā)育不良[4]。鴨圓環(huán)病毒與豬圓環(huán)病毒相似，有著圓環(huán)病毒的共同特征，都可以感染宿主的免疫器官，在淋巴系統(tǒng)內(nèi)增殖，從而引起免疫抑制，會使機體免疫力降低從而導(dǎo)致繼發(fā)感染或多重感染，使病情嚴(yán)重，死亡率增加，造成的經(jīng)濟損失嚴(yán)重[5]。結(jié)合整個行業(yè)的疫情監(jiān)測結(jié)果分析來看，鴨圓環(huán)病毒在所有病毒病中感染率高居首位，并且臨床分析發(fā)現(xiàn)一個明顯的規(guī)律，只要存在鴨圓環(huán)病毒感染，細菌感染的程度往往非常嚴(yán)重。針對2020年6～12月份從聊城、東營、德州、濰坊、濟寧地區(qū)送檢的130份樣品調(diào)查鴨圓環(huán)病毒和其他病原體感染情況來明確山東省部分地區(qū)鴨群中DuCV危害情況，進而為山東省養(yǎng)殖戶提供數(shù)據(jù)支持和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 被檢樣品 2020年6～12月份，山東省的聊城、東營、德州、濰坊、濟寧地區(qū)養(yǎng)鴨場共送檢130份患病鴨的內(nèi)臟（肝臟、肺臟、脾臟等），日齡均在20～ 30 d。

1.1.2 主要試劑 Biospin病毒DNA/RNA 提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司；2 × Rapid-TaqMasterMix、HisScriptⅡ1stStrandc DNA Synt-hesisKit均購自諾唯贊生物科技（南京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 核酸的提取 實驗人員用無菌鑷子和無菌剪刀在超凈臺中取部分肝臟、肺臟、脾臟等置于1.5 ml離心管中，加入生理鹽水，放入無菌鋼珠（2.5 mm及2 mm各一個），在全自動樣品快速研磨器中研磨2 min，參照Biospin病毒DNA/ RNA提取試劑盒說明書提取病毒核酸。

1.2.2 引物 鴨圓環(huán)病毒（DuCV）、腺病毒（FAV）、鴨細小病毒（DPV）、禽流感病毒（AIV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）、新型呼腸弧病毒（NDRV）和鴨肝炎病毒（DHV）特異性擴增引物序列，生工生物工程（上海）股份有限公司提供，見表1。

表1 引物序列

1.2.3 PCR/RT-PCR擴增 根據(jù)表1中的特異性引物進行PCR/RT-PCR擴增，反轉(zhuǎn)錄根據(jù)HisScriptⅡ1stStrandcDNA SynthesisKit試劑盒操作；PCR反應(yīng)體系為DNA模板4 μl、Mix酶10 μl、上游引物（100 μmol/L）1 μl、下游引物（100μmol/L）1 μl、雙蒸水4 μl；PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min預(yù)變性；95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 15 s退火，72 ℃ 6 s延伸，循環(huán)32次；72 ℃ 5 min延伸。取10 μl擴增產(chǎn)物進行核酸電泳，瓊脂糖凝膠濃度為1 %，將膠回收產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.4 藥敏試驗 首先無菌取部分肝臟、脾臟等置于2 ml離心管，加入生理鹽水，放入無菌鋼珠（2.5 mm及2 mm各一個），在全自動樣品快速研磨器中研磨2 min，然后將混懸液用玻璃涂布棒均勻致密的涂抹在普通培養(yǎng)皿表面，最后依次貼上磺胺間甲氧嘧啶、大觀霉素、鹽酸環(huán)丙沙星、硫酸粘菌素、鹽酸多西環(huán)素、利福平、鹽酸土霉素、恩諾沙星、硫酸慶大霉素、痢菌凈、硫酸新霉素、硫酸卡那霉素、氟苯尼考、鹽酸林可霉素、氨芐西林鈉、氟甲喹鈉、安普霉素、強力霉素、青霉素、丁胺卡那霉素、甲磺酸加替沙星、阿莫西林藥敏片置于37 ℃ 溫箱培養(yǎng)16～24 h。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 對聊城、東營、德州、濰坊、濟寧地區(qū)送檢的130份樣品病毒檢出率、細菌檢出率、DuCV與其他病原體混合感染情況進行統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒和細菌總檢出率

表2 6-12月病毒和細菌總檢出率

由表2可知，山東省6～12月份，DuCV在130份樣品中檢出76份病毒，檢出率為58.46 %，細菌在130份樣品中檢出86份，檢出率為66.15%，細菌感染嚴(yán)重。在76份病毒陽性樣品中DuCV檢出43份，檢出率為56.68 %，在DuCV陽性樣品中細菌檢出37份，檢出率為86.05 %。說明DuCV感染鴨群更易造成細菌混合感染。

2.2 單個月份鴨圓環(huán)病毒和細菌檢出數(shù)

圖1 單個月份鴨圓環(huán)病毒和細菌檢出數(shù)

由圖1可知，6、7、8、9月份DuCV、細菌、DuCV和細菌混合感染檢出數(shù)明顯高于10、11、12月份DuCV、細菌、DuCV和細菌混合感染檢出數(shù)。

2.3 不同病毒的檢出數(shù)

根據(jù)以往病毒流行情況在6～12月份對130份樣品檢測了DuCV、DPV、H9N2、NDRV、DTMUV、DHV-1、DHV-3和FAV這八種病毒，從圖2可以看出，DuCV檢出數(shù)最高，DPV、H9N2、NDRV和FAV檢出數(shù)次之，DTMUV、DHV-1和DHV-3檢出數(shù)最低。

2.4 藥敏試驗

細菌單純感染、DuCV和細菌混合感染藥敏情況，見表3。

圖2 不同病毒的檢出數(shù)

表3 細菌單純感染、DuCV和細菌混合感染藥敏情況

由表3可知，細菌單純感染對藥物的敏感性高于DuCV和細菌二重感染對藥物的敏感性，細菌單獨感染時敏感藥物有4種，分別為鹽酸環(huán)丙沙星、硫酸慶大霉素、氨芐西林鈉、阿莫西林；細菌和DuCV混合感染時敏感藥物只有兩種，分別為硫酸慶大霉素和阿莫西林。

3 討論

我國養(yǎng)鴨業(yè)年出欄量已達50億只，養(yǎng)殖量占全球的80%以上，鴨肉已經(jīng)成為我國繼豬肉和雞肉之后的第三大肉食品。然而，養(yǎng)鴨業(yè)目前的養(yǎng)殖現(xiàn)狀堪憂，養(yǎng)殖模式較為簡陋和粗放，防疫難度非常大。近幾年，鴨傳染病呈現(xiàn)“老病未除，新病又發(fā)”的狀態(tài)，尤其是肉鴨養(yǎng)殖后期，細菌病更是難以控制。DuCV通常以隱性感染的形式存在，無特征性癥狀和病變，它單獨感染，幾乎不會造成死亡，僅表現(xiàn)為料肉比下降[6]。DuCV侵入機體后感染免疫器官，造成機體抗病能力下降，被條件性致病微生物趁虛而入而造成機體發(fā)病。一旦發(fā)生混合感染，死亡率明顯增加，造成養(yǎng)殖戶經(jīng)濟損失嚴(yán)重，因此對DuCV與其他病毒、細菌共感染的研究也越來越多。研究表明DuCV與鵝細小病毒共感染會增強其致病性，導(dǎo)致短喙－侏儒綜合征[5]。劉少寧等人研究也表明鴨圓環(huán)病毒病和鴨疫里默氏桿菌病或者大腸桿菌等細菌二重感染率達到9.57 %[7]。根據(jù)本實驗室6～12月份收集的130份樣品顯示，DuCV和細菌混合感染檢出率為86.05 %（37/43），但實際結(jié)果應(yīng)高于86.05 %，是因為實驗室條件有限，只檢測了一些常規(guī)細菌，對于一些要求條件高的如鴨疫里默氏桿菌等無法進行培養(yǎng)。由此可見，DuCV與細菌混合感染在山東部分地區(qū)是極其嚴(yán)重的。同時根據(jù)不同月份感染情況統(tǒng)計結(jié)果顯示，DuCV、細菌、以及DuCV和細菌混合感染在6～9月份較多，說明DuCV雖然一年四季都可感染，但是在夏秋季節(jié)比較多發(fā)，可能是由于夏季雨水較多，溫度較高，濕熱的環(huán)境容易滋生病原菌。根據(jù)DuCV和細菌混合感染情況的藥敏試驗對比發(fā)現(xiàn)，DuCV和細菌混合感染的病料比單獨細菌感染的耐藥性更強，產(chǎn)生的抑菌圈更小，同時有效抗生素較少。由此可以得出，在臨床上細菌病危害嚴(yán)重與DuCV感染機體有很大關(guān)系，因此在用藥之前一定做好PCR檢測和藥敏試驗，做到對癥下藥，避免盲目用藥，增加機體腎臟、肝臟負(fù)擔(dān)以及耐藥性的產(chǎn)生。

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（2021–05–11）

S852.65

A

1007-1733（2021）08-0001-04

中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金項目（YDZX20203700004857）