響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助浸提葡萄籽原花青素

李瑞麗，張玎婕，趙琪，王惠妹，徐如彥

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)煙草科學(xué)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，江蘇 南京 210019）

原花青素（procyanidins，PC）是由兒茶素或表兒茶素縮合而成的生物類黃酮，作為天然強(qiáng)有效的自由基清除劑，能有效清除·OH、O2-·、NO·、DPPH·等多種自由基，具有舒張血管、降血糖、降血脂[1-3]，抑制腎、腸功能障礙、提高記憶力[4-6]，及抗肥胖、美白等作用[7-10]，尤其是原花青素的低聚體，其保健功能更是受到人們的廣泛關(guān)注[11-13]。

葡萄籽、松樹(shù)皮、蔓越桔等植物中PC含量豐富，自然界的PC多以氫鍵、疏水鍵與植物蛋白、多糖結(jié)合的形式存在，因此，從植物中提取PC多選用極性溶劑[11，14]。響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)可將因變量與多個(gè)自變量的二次函數(shù)關(guān)系用響應(yīng)面直觀展示并確定最優(yōu)條件或最優(yōu)區(qū)域，是解決天然產(chǎn)物有效成分提取過(guò)程中多變量問(wèn)題的有效統(tǒng)計(jì)方法[15-19]。

超聲波由于其空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)使得天然產(chǎn)物細(xì)胞壁破裂，有效成分可快速高效地溶出，在天然產(chǎn)物提取中具有耗時(shí)短、效率高等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[20-24]。但其熱效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致體系局部過(guò)熱，對(duì)于熱敏性較差的目標(biāo)產(chǎn)物有一定的破壞作用。因此，提出利用低頻短時(shí)超聲處理結(jié)合恒溫水浴的方法萃取葡萄籽中PC，縮短提取周期，提高提取效率，同時(shí)降低對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的破壞性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄籽：葡萄酒廠下腳料；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（＞98%）：天津尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司；香草醛、甲醇、濃鹽酸、無(wú)水乙醇（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260Infinity型高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；722G分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SB-3200DT超聲波萃取儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市瑞利儀器設(shè)備有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

取適量葡萄籽，40℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干（≥6.0 h），植物粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，密封，備用。

1.3.2 葡萄籽原花青素提取

稱取一定量的葡萄籽粉末，加入適量一定濃度的乙醇溶液，室溫（20℃）下超聲輔助提取一定時(shí)間，然后恒溫?zé)峄亓鹘嵋欢〞r(shí)間，離心處理取上清夜，即為葡萄籽PC提取液。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 提取時(shí)間對(duì)PC提取率的影響

稱取葡萄籽粉末5.00g，加入70%乙醇溶液60mL，室溫（20℃）下超聲處理20 min，80℃恒溫水浴熱回流提取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，測(cè)定葡萄籽 PC 提取率。

1.3.3.2 提取溫度對(duì)PC提取率的影響

稱取葡萄籽粉末5.00g，加入70%乙醇溶液60mL，室溫（20 ℃）下超聲處理 20 min，分別在 50、60、70、80、90℃恒溫水浴中熱回流提取2.0 h，測(cè)定葡萄籽PC提取率。

1.3.3.3 乙醇濃度對(duì)PC提取率的影響

稱取葡萄籽粉末5.00 g，加入乙醇溶液60 mL，室溫（20℃）下超聲處理20 min，80℃恒溫水浴中熱回流提取1.0 h，乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%，測(cè)定葡萄籽PC提取率。

1.3.3.4 液料比對(duì)PC提取率的影響

稱取葡萄籽粉末5.00 g，分別添加70%乙醇溶液30、45、60、75、90 mL，室溫（20 ℃）下超聲處理 20 min，80℃恒溫水浴中熱回流提取1.0 h，測(cè)定葡萄籽PC提取率。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度、液料比各優(yōu)選3個(gè)水平（見(jiàn)表1），采用四因素三水平響應(yīng)面分析法優(yōu)化PC提取條件。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化因素水平Table 1 The factor level design of response surface optimization

1.3.5 原花青素分析方法

香草醛-鹽酸法測(cè)兒茶素、表兒茶素單體與原花青素總量：準(zhǔn)確稱取兒茶素5.0 mg，去離子水溶解并定容至 25.0 mL，分別移取 1.0、2.5、4.0、5.5、7.0 mL 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液去離子水定容至10.0 mL，得濃度分別為20、50、80、110、140 μg/mL 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，依次加入40 g/L香草醛-甲醇溶液6.0 mL，濃鹽酸3.0 mL，混合均勻，室溫（25℃）避光反應(yīng)15.0 h。以香草醛-甲醇溶液∶濃鹽酸∶甲醇＝6∶3∶1（體積比）的混合溶液為空白對(duì)照，在500 nm處測(cè)吸光度。擬合溶液吸光度（y1）與單體及PC濃度（x1）標(biāo)準(zhǔn)曲線：y1=0.001 7 x1-0.041，R2=0.998 0。用于測(cè)定葡萄籽提取液中單體與原花青素總量的濃度。

式中：Y1為提取物中單體與原花青素總量，mg/g；v為提取液體積，mL；x為提取液濃度，μg/mL；n為提取液稀釋倍數(shù)；m為葡萄籽粉末質(zhì)量，g。

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)兒茶素、表兒茶素單體的量：準(zhǔn)確稱取0.002 g兒茶素、0.002 g表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品于2 mL容量瓶，甲醇定容，然后依次稀釋分別得到500、100、50、20、10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC測(cè)定峰面積，擬合色譜峰面積對(duì)數(shù)（y2）與兒茶素濃度（x2）、表兒茶素濃度（x3）的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：兒茶素y2=1.037 7x2-1.086 5，R2=0.999 6；表兒茶素 y2=1.053 6x3-1.384 2，R2=0.999 3。用于測(cè)定提取液中兒茶素、表兒茶素單體濃度。

式中：Y2為提取物中兒茶素、表兒茶素單體量，mg/g；v為提取液體積，mL；x2為提取液兒茶素濃度，μg/mL；x3為提取液表兒茶素濃度，μg/mL；n 為提取液稀釋倍數(shù)；m為葡萄籽粉末質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel2016、Origin 9.1進(jìn)行單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和繪圖；利用Design-Expert 12.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)曲面、等高線繪圖及回歸分析、方差分析和參數(shù)優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取時(shí)間對(duì)PC提取率的影響

超聲波的機(jī)械作用、空化作用及熱效應(yīng)是其加速天然產(chǎn)物有效成分提取的理論依據(jù)?？栈饔谩C(jī)械作用導(dǎo)致破壁使有效成分快速溶出，熱效應(yīng)可使溶液內(nèi)部溫度升高，利用超聲波破壁作用的同時(shí)避免局部溫度過(guò)高導(dǎo)致PC含量降低，采用超聲處理20 min，然后恒溫水浴熱回流浸提的方式提取，提取時(shí)間對(duì)PC提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 提取時(shí)間對(duì)PC提取率的影響Fig.1 Influence of extraction time on the yield of PC

由圖1可知，提取時(shí)間小于1.5 h時(shí)，隨提取時(shí)間延長(zhǎng)，葡萄籽PC提取率逐漸增加，但增幅逐漸減小，這是由于葡萄籽粉末與溶劑中PC的濃度差逐漸縮小所致。提取時(shí)間超過(guò)1.5 h后，PC提取率反而略降。提取時(shí)間1.0 h時(shí)，PC在葡萄籽粉末與溶劑中的傳質(zhì)基本上達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。

2.2 提取溫度對(duì)PC提取率的影響

提取溫度對(duì)PC提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 提取溫度對(duì)PC提取率的影響Fig.2 Influence of extraction temperature on the yield of PC

由圖2可知，當(dāng)提取溫度低于70℃時(shí)，葡萄籽PC提取率隨提取溫度增加呈增加趨勢(shì)，溫度升高利于傳質(zhì)效率增加，可加快有效成分溶出速度，但雜質(zhì)的溶出也會(huì)增加。同時(shí)，由于葡萄籽PC熱穩(wěn)定性較差，高溫處理如90℃超過(guò)12 h或50℃超過(guò)24 h，葡萄籽提取物中PC含量明顯減少。提取溫度超過(guò)70℃后，PC提取率不升反降，90℃時(shí)反應(yīng)液微有沸騰現(xiàn)象，PC提取率明顯下降。提取溫度為70℃時(shí)，PC的提取率相對(duì)最大。

2.3 乙醇濃度對(duì)PC提取率的影響

根據(jù)天然產(chǎn)物萃取中的相似相溶原理，乙醇溶液與PC極性越接近越利于PC從葡萄籽粉末溶出到乙醇溶液中。乙醇濃度對(duì)PC提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇濃度對(duì)PC提取率的影響Fig.3 Influence of ethanol volume on the yield of PC

由圖3可知，PC提取率隨濃度增加呈先增大后減小的趨勢(shì)，乙醇濃度為50%～60%時(shí)，PC提取率相對(duì)較大。

2.4 液料比對(duì)PC提取率的影響

液料比對(duì)PC提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 液料比對(duì)PC提取率的影響Fig.4 Influence of liquid-solid ratio on the yield of PC

溶劑用量與PC提取率呈正相關(guān)關(guān)系，由圖4可知，隨溶劑用量的增加，PC提取率逐漸增大，液料比達(dá)到15∶1（mL/g）時(shí)，PC提取率達(dá)到最大。溶劑用量再增大，對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的提取率影響很小，負(fù)面作用是在增加溶劑成本的同時(shí)雜質(zhì)溶出量增加不利于后續(xù)精制提純，因此液料比以 15∶1（mL/g）為宜。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.5.1 試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度、液料比各優(yōu)選3個(gè)水平，采用四因素三水平響應(yīng)面分析法優(yōu)化PC提取條件。響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，其中，第25至29號(hào)試驗(yàn)是各因素中心點(diǎn)組合的重復(fù)試驗(yàn)，用于評(píng)估試驗(yàn)誤差。

表2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The experimental design and results of response surface analysis

續(xù)表2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 The experimental design and results of response surface analysis

2.5.2 回歸模型及方差分析

通過(guò)對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，建立PC提取率與提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度、液料比這4個(gè)因素的回歸模型。PC提取率回歸方程：Y=-5.23+2.98X1+0.17X2+0.02X3+0.27X4+0.004X1X2-0.01X1X3-0.03X1X4+0.000 4X2X3-0.000 6X2X4+0.000 1 X3X4-0.95X12-0.000 1X22-0.000 4X32+0.009X42。

回歸模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA results of quadratic model

由表3可知，顯著性檢驗(yàn)中，回歸模型P＜0.000 1，失擬項(xiàng)P=0.174 3，即回歸模型極顯著而失擬不顯著，說(shuō)明PC提取率與各因素的回歸模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且沒(méi)有其它對(duì)PC提取率影響顯著的因素被忽略。R2和調(diào)整R2均在0.95以上，模型擬合度較好且有良好的預(yù)測(cè)性，可在模型基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)果分析和方案優(yōu)化，明確超聲輔助提取葡萄籽PC的最優(yōu)工藝。

PC提取率與各因素的回歸模型中，X1、X2的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)的P值均小于0.000 1；X4的一次項(xiàng)的P值小于0.001，二次項(xiàng)的P值小于0.000 1；X3的一次項(xiàng)的P值遠(yuǎn)大于0.05，二次項(xiàng)的P值小于0.01；說(shuō)明提取時(shí)間、提取溫度是影響葡萄籽PC提取率的主要因素，液料比次之，乙醇濃度對(duì)葡萄籽PC提取率的影響相對(duì)較小。提取時(shí)間與乙醇濃度、提取時(shí)間與液料比、乙醇濃度與液料比的交互作用對(duì)葡萄籽PC提取率有顯著影響。其它因素間的一級(jí)交互作用P值均大于0.05，對(duì)PC提取率無(wú)顯著影響。

2.5.3 響應(yīng)曲面分析

各因素交互作用響應(yīng)曲面圖及其在底面的投影（即等高線圖）見(jiàn)圖5。

圖5 各因素交互作用響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.5 The interaction effect and contour on extraction rate of PC between two factors

由圖5可知，隨提取時(shí)間延長(zhǎng)、提取溫度升高，葡萄籽PC提取率均呈逐漸增大的趨勢(shì)，到達(dá)因素中心值以后，提取率隨時(shí)間延長(zhǎng)、溫度升高反而減小，提取溫度升高導(dǎo)致的PC提取率下降更為明顯。隨乙醇濃度、液料比增大，PC提取率基本均呈逐漸增加的趨勢(shì)。對(duì)比響應(yīng)曲面圖的陡緩趨勢(shì)，提取時(shí)間對(duì)提取率的影響較大，其次是提取溫度，再次是液料比，而乙醇濃度響應(yīng)曲面相對(duì)平緩，說(shuō)明乙醇濃度對(duì)提取率的影響相對(duì)較小。對(duì)比各因素交互作用的等高線圖，提取時(shí)間與乙醇濃度、提取時(shí)間與液料比的交互作用影響較大，等高線為橢圓形，其次是提取溫度與乙醇濃度、乙醇濃度與液料比的交互作用，等高線為近似橢圓形；而提取時(shí)間與提取溫度、提取溫度與液料比的交互作用影響較小，等高線近似圓形。這與回歸模型方差分析的結(jié)果一致，利用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)可明確提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度和液料比等因素對(duì)葡萄籽PC提取率的影響。

在研究范圍內(nèi)，響應(yīng)面分析回歸模型預(yù)測(cè)葡萄籽PC提取率最高的工藝條件為室溫（20℃）下超聲處理20 min后，水浴熱回流提取時(shí)間1.15 h，提取溫度67.78℃，乙醇濃度 50.06%，液料比 15.92∶1（mL/g），回歸模型預(yù)測(cè)此條件下的PC提取率為4.713%。其次為室溫（20℃）下超聲處理20 min后，水浴熱回流提取時(shí)間1.0 h，提取溫度70℃，乙醇濃度60%，液料比15∶1（mL/g），回歸模型預(yù)測(cè)此條件下的PC提取率可達(dá)4.710%。兩種工藝條件下PC提取率相差很小，僅為0.003%，兼顧試驗(yàn)條件實(shí)際操作，確定最優(yōu)工藝條件為室溫（20℃）下超聲處理20 min后，水浴熱回流提取時(shí)間1.0 h，提取溫度70℃，乙醇濃度60%，液料比15∶1（mL/g）。最優(yōu)工藝條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，葡萄籽PC提取率為4.68%，與模型預(yù)測(cè)值4.71%接近，RSD為1.22%。說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化工藝可重復(fù)性較好，工藝可靠。

3 結(jié)論

超聲輔助結(jié)合恒溫水浴萃取葡萄籽PC的過(guò)程中，提取時(shí)間對(duì)葡萄籽PC提取率的影響較大，其它依次是提取溫度、液料比，乙醇濃度對(duì)提取率的影響相對(duì)較小。響應(yīng)面優(yōu)化的最佳工藝條件為室溫（20℃）下超聲處理20 min，水浴熱回流提取時(shí)間1.0 h，提取溫度 70℃，乙醇濃度 60%，液料比 15∶1（mL/g）。在此條件下3次驗(yàn)證試驗(yàn)，PC提取率均值為4.68%，與模型預(yù)測(cè)值4.71%接近，RSD為1.22%。該提取工藝設(shè)備要求不高，且工藝有良好的重現(xiàn)性和可操作性。PC作為天然的抗氧化劑，應(yīng)用前景和開(kāi)發(fā)潛力較大。下一步工作考慮分離PC低聚物單體，研究其抗氧化活性，探索PC低聚體中對(duì)抗氧化活性貢獻(xiàn)較大的主要單體。