二安替比林甲烷比色法測(cè)定家禽飼料和糞便中二氧化鈦含量

王少龍，陳志敏，劉國(guó)華，常文環(huán)，鄭愛(ài)娟，蔡輝益

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081）

二氧化鈦又稱為鈦白粉，分子式為TiO2，是一種質(zhì)地柔軟的白色粉末，具有無(wú)毒、穩(wěn)定、分散性好的特性[1]。二氧化鈦?zhàn)鳛楝F(xiàn)行適用的外源指示劑，在豬、雞和牛的消化代謝試驗(yàn)研究中被廣泛應(yīng)用[2-5]。指示劑的回收率和指示劑的分布情況對(duì)消化率的測(cè)定結(jié)果有較大影響。因此，在應(yīng)用外源指示劑法時(shí)，需要保證指示劑與飼料充分混勻，采集糞樣時(shí)均衡收集[6]。二氧化鈦測(cè)定的準(zhǔn)確性決定消化代謝試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，定量檢測(cè)二氧化鈦的方法有電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-AES）、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）和二安替比林甲烷比色法等[7-10]。ICP-AES和ICP-MS方法需要使用大型儀器，且樣品前處理操作復(fù)雜，需要對(duì)測(cè)定元素進(jìn)行富集處理，這兩種方法操作成本高，對(duì)試驗(yàn)人員的專業(yè)水平要求高，難以得到廣泛應(yīng)用。那些不具備大型檢測(cè)儀器的實(shí)驗(yàn)室無(wú)法應(yīng)用ICP-AES和ICP-MS方法，多采用二安替比林甲烷比色法進(jìn)行測(cè)定。

二安替比林甲烷比色法具有測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度高、對(duì)儀器設(shè)備的要求不高、簡(jiǎn)單易操作的優(yōu)點(diǎn)，適合應(yīng)用推廣。劉超等[11]為探究更加簡(jiǎn)捷有效、準(zhǔn)確度高的火鍋底料中二氧化鈦含量測(cè)定方法，使用二安替比林甲烷分光光度法測(cè)定多種火鍋底料中二氧化鈦含量，得到鈦含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.245 0X+0.000 4，R2=1.000 0。馬嫄等[12]采用二安替比林甲烷分光光度法對(duì)幾種休閑零食中二氧化鈦的含量進(jìn)行測(cè)定，得到鈦含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.251 7X-0.008 0，R2=1.000 0，且鈦含量與吸光度有良好的擬合性。嚴(yán)進(jìn)[13]在原有二安替比林分光光度法測(cè)定二氧化鈦的方法基礎(chǔ)上，采用水和異丙醇組成的體系替換單純水相做溶劑，發(fā)現(xiàn)顯色劑溶劑化效應(yīng)增強(qiáng)，顯色反應(yīng)的靈敏度明顯提高。田倫富等[14]使用以二安替比林甲烷為顯色劑的比色法檢測(cè)釩基合金中的鈦含量，對(duì)鹽酸、抗壞血酸和顯色劑用量?jī)?yōu)化選擇后，發(fā)現(xiàn)回收率為97%~104%。胡嫻鳳等[15]在研究食品中的二氧化鈦含量時(shí)，考慮到二安替比林甲烷分光光度法背景吸收對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，采用在原有試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行一對(duì)一扣除本底空白的方式對(duì)試驗(yàn)方法優(yōu)化，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確度。王佳雅等[16]采用二安替比林甲烷比色法和ICP－MS法對(duì)小麥粉及其制品中的二氧化鈦含量進(jìn)行測(cè)定，探究小麥粉中二氧化鈦的本底值，發(fā)現(xiàn)該方法可以有效改善檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，為比色法在小麥粉中測(cè)定二氧化鈦含量的技術(shù)優(yōu)化方面提供參考。

本研究參照GB 5009.246—2016《食品中二氧化鈦的測(cè)定》中的第二法“二安替比林甲烷分光光度法”[17]，以飼料和糞便為檢驗(yàn)對(duì)象，對(duì)家禽代謝試驗(yàn)中二氧化鈦的測(cè)定進(jìn)行分析，旨在建立家禽代謝試驗(yàn)中飼料和糞便中易于推廣的二氧化鈦檢測(cè)方法，為快速準(zhǔn)確地測(cè)定養(yǎng)分表觀消化率提供參考。

1 材料與方法

1.1 測(cè)定原理

待測(cè)樣品經(jīng)過(guò)混合強(qiáng)酸的水解，鈦與二安替比林甲烷反應(yīng)生成黃顏色的絡(luò)合物，一定的濃度范圍、420 nm波長(zhǎng)條件下，樣品中的鈦含量與吸光度呈線性關(guān)系，可以依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量求出對(duì)應(yīng)吸光度下的鈦含量。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 試劑

高氯酸、濃硫酸、濃硝酸、濃鹽酸、硫酸銨、抗壞血酸、二安替比林甲烷、鈦標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1 g/L）

1.2.1.1 混合酸的配制

量取1份高氯酸與9份濃硝酸，充分混合，裝瓶備用。

1.2.1.2 鹽酸（1+1）的配制

量取100 mL濃鹽酸，將濃鹽緩慢加入100 mL蒸餾水中，充分混合，裝瓶備用。

1.2.1.3 鹽酸（1+23）的配制

量取10 mL濃鹽酸，將濃鹽酸緩慢加入230 mL蒸餾水中，充分混合，裝瓶備用。

1.2.1.4 2%硫酸（體積分?jǐn)?shù)）的配制

量取2 mL濃硫酸，將濃硫酸緩慢加入98 mL蒸餾水中，充分混合，裝瓶備用。

1.2.1.5 抗壞血酸溶液（2%）的配制

準(zhǔn)確稱取2 g抗壞血酸，利用少量蒸餾水溶解抗壞血酸，蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，搖勻，現(xiàn)配現(xiàn)使。

1.2.1.6 二安替比林甲烷溶液（5%）的配制

準(zhǔn)確稱取5 g二安替比林甲烷，以（1+23）鹽酸為溶劑，溶解并稀釋定容至100 mL容量瓶中，搖勻，裝瓶備用。

1.2.1.7 鈦標(biāo)準(zhǔn)液的配制

利用移液槍準(zhǔn)確移取1 mL鈦標(biāo)準(zhǔn)貯備液于100 mL容量瓶中，使用2%硫酸稀釋定容至刻度線，搖勻，裝瓶備用。

1.2.2 儀器設(shè)備

分光光度計(jì)、電熱板、分析天平（感量為0.1 mg）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取鈦標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、2.5、5.0、10.0 mL于50 mL的容量瓶中。向容量瓶中加入5 mL 2%抗壞血酸溶液，充分混合，依次加入14 mL（1+1）鹽酸、6 mL 5%二安替比林甲烷溶液，蒸餾水定容至刻度線，充分混合，靜置40 min，上機(jī)比色。以上配置的標(biāo)準(zhǔn)工作液中鈦的濃度依次為0、0.1、0.5、1.0、2.0 g/L。分別取部分以上待測(cè)液于1 cm比色杯，在420 nm波長(zhǎng)條件下讀吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)工作液的鈦濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，制作鈦含量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試樣消解

首先使用分析天平準(zhǔn)確稱取樣品（飼料2 g，食糜、糞便樣品0.5 g，精確至0.001 g）置于高腳燒杯中，向燒杯中注入5~10 mL的混合酸，放置在加熱板上，蓋好表面皿，調(diào)整加熱板溫度保持微沸，水解至紅棕色煙霧散盡、樣品徹底消解溶液澄清；待以上液體冷卻，向燒杯中加入1 g硫酸銨和5 mL濃硫酸，煮沸至白色煙霧散盡溶液澄清即可，取下冷卻；將消解液有效成分完全轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，使用蒸餾水仔細(xì)沖洗表面皿和燒杯壁，定容至容量瓶刻度線，充分混合，留作備用。

1.4.2 待測(cè)樣消解液顯色

使用移液槍移取5 mL待測(cè)樣消解液，注入50 mL容量瓶中，其余步驟同1.3。

1.4.3 比色

以5 mL蒸餾水代替標(biāo)準(zhǔn)工作液，其余試劑均按1.3要求正常添加的溶液為參比溶液，取1 cm比色杯，在波長(zhǎng)420 nm的條件下，利用分光光度計(jì)測(cè)定顯色后標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測(cè)樣溶液的吸光度。

1.4.4 二氧化鈦含量的計(jì)算公式

二氧化鈦含量計(jì)算公式如下：

式中：TiO2為待測(cè)樣中TiO2含量（mg/kg）；Ti為標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的待測(cè)樣中的鈦濃度（μg/kg）；100為待測(cè)樣消解后定容的總體積（mL）；50為顯色后待測(cè)樣定容的總體積（mL）；m為稱取待測(cè)樣的質(zhì)量（g）；5為顯色后移取待測(cè)樣溶液的總體積（mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈦濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1）

由圖1可知，鈦濃度與吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=3.946 1X，R2=1.000 0。相關(guān)系數(shù)R2等于1，表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線方程擬合度很好，鈦濃度與吸光值之間有著很強(qiáng)的線性相關(guān)性。

圖1 鈦濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for titanium concentration determination

2.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

按試驗(yàn)方法對(duì)肉雞代謝試驗(yàn)的飼料、糞便樣品平行測(cè)定10次，飼料樣品中二氧化鈦的平均測(cè)定值為3 926.44 mg/kg，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=10）為4.25%；糞便樣品中二氧化鈦的平均測(cè)定值為13 632.60 mg/kg，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=10）為3.70%。兩種樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值均在5%以內(nèi)，表示二安替比林甲烷比色法的精密度達(dá)到檢測(cè)要求，得出的試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3 回收試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表2）

由表2可知，飼料中二氧化鈦的回收率為100.14%，糞便中二氧化鈦的平均回收率為98.14%，表明二安替比林甲烷比色法達(dá)到檢測(cè)要求。該方法所需儀器設(shè)備大多數(shù)試驗(yàn)室都能滿足，樣品前處理簡(jiǎn)便、快速，試驗(yàn)結(jié)果回收率高、重復(fù)性好，可用于代謝試驗(yàn)中樣品的檢驗(yàn)。

表2 飼料和糞便中二氧化鈦回收率Tab.2 Recovery rate of titanium dioxide in feed and feces

3 討論

在樣品檢測(cè)中，以下幾個(gè)方面對(duì)準(zhǔn)確的測(cè)定二氧化鈦的含量至關(guān)重要：（1）樣品的稱量一定要準(zhǔn)確，精確到小數(shù)點(diǎn)后三位；（2）消解要徹底，電熱板的消解溫度設(shè)定在250~350℃，如果消解溫度不夠，容易產(chǎn)生白色沉淀，影響測(cè)定結(jié)果；（3）定容時(shí)，凹液面與刻度線相平，否則會(huì)引入不確定度；（4）保證完全轉(zhuǎn)移消解液，對(duì)燒杯壁和表面皿上殘留有效成分進(jìn)行沖洗一并轉(zhuǎn)移，避免消解液遺失而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。

夏輝等[18]采取微波消解法處理試樣，利用過(guò)氧化氫比色法定量測(cè)定小麥粉中二氧化鈦含量，測(cè)得7個(gè)處理組二氧化鈦含量的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.88%，回收試驗(yàn)中二氧化鈦加標(biāo)回收率范圍在92%~98%之間。鄧雪娟等[19]研究過(guò)氧化氫比色法對(duì)家禽飼料和食糜中二氧化鈦含量的測(cè)定，在回收試驗(yàn)中測(cè)得二氧化鈦平均回收率為97.35%。結(jié)合本試驗(yàn)研究結(jié)果，測(cè)定值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均在5%以內(nèi)，加標(biāo)平均回收率均高于98%。因此，二安替比林甲烷比色法適用于家禽代謝試驗(yàn)中二氧化鈦含量的測(cè)定。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，高氯酸與硝酸為體系的混合酸消解飼料和糞便樣品的效果良好，以二安替比林甲烷為顯色劑的分光光度法去定量測(cè)定二氧化鈦時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果精密度高、加標(biāo)回收率高。二安替比林甲烷比色法是一種操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確的測(cè)定方法，適合在家禽代謝試驗(yàn)中推廣應(yīng)用。