低分子肝素對(duì)頸動(dòng)脈球囊損傷模型大鼠AngⅡ、HB-EGF表達(dá)及內(nèi)膜增生的影響

趙治濤 肖珂青

近年來，隨著社會(huì)壓力增大和老齡化加重，心血管疾病已成為威脅人類生命健康的主要原因之一[1,2]。由冠狀動(dòng)脈硬化(coronary atherosclerosis,CAS)引起的冠心病是心血管疾病的主要類型，也是導(dǎo)致心血管病患者死亡的主要原因之一[3]。目前，臨床上治療冠心病的主要方法是經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)，但PCI術(shù)后可引起血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)過度增殖、內(nèi)膜異常增生、遷移，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈再狹窄、硬化等[4]。而頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)所導(dǎo)致的血管內(nèi)皮剝落和VSMC增生，與人類 PCI 術(shù)所引起的冠脈狹窄及CAS病理變化過程相似，因此復(fù)制動(dòng)物頸動(dòng)脈球囊損傷模型，可模擬人類PCI 術(shù)血管內(nèi)膜增生病變過程[5]。目前，抑制PCI 術(shù)后VSMC增生、遷移是心血管臨床研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)之一[6]。研究發(fā)現(xiàn)在病理因素刺激下，血管緊張素Ⅱ(Angiotensin，AngⅡ)和肝素結(jié)合性表皮生長因子(Heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF)異常表達(dá)，可誘導(dǎo)并促進(jìn)VSMC的異常增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化[7,8]，因此調(diào)控AngⅡ和HB-EGF的表達(dá)，可能對(duì)抑制人類PCI 術(shù)血管內(nèi)膜增生病變有潛在的臨床價(jià)值。低分子肝素(low molecular weight heparin，LMWH)具有抗炎、抗凝血作用[9]，研究發(fā)現(xiàn)，LMWH可被用于預(yù)防PCI 術(shù)后血栓形成[10]，但LMWH對(duì)PCI 術(shù)血管內(nèi)膜增生病變及AngⅡ和HB-EGF的調(diào)控作用，筆者發(fā)現(xiàn)報(bào)道較少。本研究建立大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)復(fù)制人類PCI 術(shù)病理血管內(nèi)膜增生病變過程，探究LMWH給藥期間，血管內(nèi)膜增生變化及AngⅡ和HB-EGF蛋白的調(diào)控作用LMWH治療人類PCI術(shù)并發(fā)癥的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取清潔級(jí)健康雌性SD大鼠52 只，體重 200～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2018-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為省科委2000A027。所有大鼠于本院動(dòng)物房中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25℃，相對(duì)濕度50%，噪音<80分貝，保持動(dòng)物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。本研究經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。試驗(yàn)符合3R原則。

1.2 試劑及儀器 LMWH(貨號(hào)：140646-201002，購自上海雅吉生物科技有限公司)；白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(貨號(hào)：K-F5988，購自上?？祈樕锟萍加邢薰?；腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒(貨號(hào)：F12999，購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司)；AngⅡ抗體、HB-EGF抗體、縫隙連接蛋白43(Connexin 43，Cx43)抗體(貨號(hào)分別為：ab236317、ab175555、ab230523，均購自美國abcam公司)；蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-Eosin，HE)染色試劑盒(貨號(hào)：LMO105，購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司)；總RNA提取(Trizol)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)分別為：T6126、T1597，均購自日本TAKARA)；BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶(貨號(hào)分別為P0768，P0231，均購自美國Pierce 公司)；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(型號(hào)：Mastercycler nexus X2，購自德國Eppendorf艾本德)；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào)分別為1659001、Trans-Blot SD，均購自美國Bio-Rad公司)等。

1.3 大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型建立及分組給藥 參照文獻(xiàn)[11]制備大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型，具體操作方法為：取42只健康SD雄性大鼠，用3%戊巴比妥鈉麻醉后，于頸部正中切口，分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，并將頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端結(jié)扎，臨時(shí)阻斷頸左、頸總動(dòng)脈血流，將2.0 mm×12.0 mm的球囊導(dǎo)管由頸外動(dòng)脈插入至頸總動(dòng)脈后，將球囊充盈，并緩慢反復(fù)來回抽動(dòng)球囊3次，確保血管內(nèi)膜損傷后，退出球囊，然后將頸外動(dòng)脈結(jié)扎。術(shù)后給予30萬單位青霉素肌內(nèi)注射，3 d，1次/d以預(yù)防感染。術(shù)后第4天，隨機(jī)取2只，處死取頸動(dòng)脈組織，HE染色，若血管組織內(nèi)膜有增厚現(xiàn)象，表明造模成功，共造模成功40只，隨機(jī)分為模型組、LMWH低(50 U/kg)、中(100 U/kg)、高(200 U/kg)劑量組，每組10只；另取10只雄性SD大鼠，只暴露并分離左側(cè)頸外、頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎、不進(jìn)行球囊損傷，其余操作同模型組，作為假手術(shù)組。5組均于造模成功后開始給藥，LMWH藥物參照文獻(xiàn)[12]以0.9%氯化鈉溶液配置為5.00、10.00、20.00 U/kg的混懸液，以10 ml/kg的劑量經(jīng)尾靜脈注射給藥；假手術(shù)組與模型組經(jīng)尾靜脈給予等劑量0.9%氯化鈉溶液，5組連續(xù)給藥14 d，1次/d。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 5組頸動(dòng)脈血管組織HE染色：5組大鼠，于末次給藥24 h后，隨機(jī)取5只，處死，取頸動(dòng)脈血管組織，置于-80℃冰箱保存，剩余5只，處死后取頸動(dòng)脈血管組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，進(jìn)行常規(guī)透明、浸蠟、包埋后、切成厚度為5 μm的切片，按HE染色試劑盒說明書進(jìn)行染色、脫水、透明后封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化，并使用(Image-ProPlus,IPP)圖像分析軟件對(duì)損傷血管的管腔面積、內(nèi)膜面積、中膜面積進(jìn)行測(cè)量，并計(jì)算內(nèi)膜/中膜的面積(IA/MA)比。

1.4.2 5組大鼠血管組織炎性因子IL-6、TNF-α含量檢測(cè):取1.4.1中-80℃冰箱保存的血管組織約0.5 g，于4℃冰箱中解凍后，用組織勻漿器勻漿、離心分離后，取上清液，按 ELISA試劑盒說明書方法檢測(cè)IL-6、TNF-α含量。

1.4.3 qRT-PCR檢測(cè)5組大鼠血管組織HB-EGF mRNA、AngⅡ mRNA相對(duì)表達(dá)水平:取-80℃冰箱保存頸動(dòng)脈血管組織約0.5 g，于4℃冰箱中解凍后，用Trizol試劑盒抽提總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，按RT-qPCR試劑盒(SYBR Green)和PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，36個(gè)循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參，嚴(yán)格按試劑盒說明建立反應(yīng)體系及參數(shù)，檢測(cè)5組大鼠血管組織中HB-EGF mRNA、AngⅡ mRNA相對(duì)表達(dá)量，qRT-PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用2-ΔΔCt算法計(jì)算HB-EGF mRNA、AngⅡ mRNA相對(duì)表達(dá)量。見表1。

表1 q-RT-PCR引物序列

1.4.4 Western Blot檢測(cè)血管組織中HB-EGF、AngⅡ、Cx43蛋白相對(duì)表達(dá)水平:取-20℃冰箱保存的上清液，于4℃冰箱中解凍后，用蛋白提取試劑盒提取蛋白BCA 試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度后，取50 μg蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng)后，置于5%的脫脂奶粉溶液中，于搖床上37℃封閉2 h，將目的蛋白條帶，置于孵育盒中，加入抗體(HB-EGF、AngⅡ、Cx43、β-actin，1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000)于4℃冰箱中孵育過夜，經(jīng)TBST漂洗3次，加入1∶1 000的羊抗兔二抗溶液，于搖床上室溫孵育2 h，經(jīng)TBST再次漂洗3次，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析5組蛋白相對(duì)表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 5組大鼠血管組織HE染色結(jié)果 假手術(shù)組大鼠頸動(dòng)脈結(jié)構(gòu)正常。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠可見頸動(dòng)脈內(nèi)皮剝脫、部分內(nèi)彈力板變平坦、失去彈性，血管內(nèi)有新生內(nèi)膜形成并增厚，且內(nèi)膜血管平滑肌細(xì)胞增多，中膜血管平滑肌細(xì)胞排列紊亂，血管管腔呈向心或偏心性狹窄。與假手術(shù)組相比，LMWH低、中、高劑量組上述頸動(dòng)脈內(nèi)皮剝落、內(nèi)膜增生及管腔狹窄等病理現(xiàn)象均有不同程度的改善。見圖1、2。

2.2 5組大鼠頸動(dòng)脈血管組織管腔面積、內(nèi)膜面積、IA/MA比值檢測(cè)結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血管內(nèi)膜面積、IA/MA比值均顯著升高(P<0.05)，管腔面積顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，LMWH低、中、高劑量組大鼠內(nèi)膜面積、IA/MA比值均顯著降低(P<0.05)，血管管腔面積顯著升高(P<0.05)，且LMWH 3個(gè)劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性。見表1。

表1 5組大鼠管腔面積、內(nèi)膜面積、IA/MA比較

2.3 大鼠血管組織炎性因子IL-6、TNF-α檢測(cè)結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血管組織炎性因子IL-6、TNF-α均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，LMWH低、中、高劑量組大鼠血管組織炎性因子IL-6、TNF-α均顯著降低(P<0.05)，且LMWH各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性。見表2。

表2 5組大鼠血管組織炎性因子IL-6、TNF-α比較

2.4 5組大鼠血管組織中HB-EGF mRNA、AngⅡ mRNA相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血管組織HB-EGF mRNA、AngⅡ mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，LMWH低、中、高劑量組大鼠血管組織血管組織HB-EGF mRNA、AngⅡ mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，且LMWH各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性。見表3。

表3 5組大鼠HB-EGF mRNA、AngⅡ mRNA比較

2.5 5組大鼠血管組織中HB-EGF、AngⅡ、Cx43蛋白相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血管組織HB-EGF、AngⅡ、Cx43蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，LMWH低、中、高劑量組大鼠血管組織血管組織HB-EGF、AngⅡ、Cx43均顯著降低(P<0.05)，且LMWH 3個(gè)劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性。見圖3，表4。

圖3 5組大鼠血管組織HB-EGF、AngⅡ、Cx43蛋白表達(dá)免疫印記圖;A 假手術(shù)組；B 模型組；C LMWH低劑量組；D LMWH中劑量組；E：LMWH高劑量組

表4 5組大鼠血管組織中織HB-EGF、AngⅡ、Cx43蛋白表達(dá)水平

3 討論

PCI術(shù)的是治療冠心病的主要有效手段之一，而PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄病變的發(fā)生率相對(duì)較高，是導(dǎo)致不良心血管事件發(fā)生率較高的主要原因之一[13]。血管內(nèi)膜炎性細(xì)胞浸潤、內(nèi)皮細(xì)胞增生、VSMC從中膜遷移至內(nèi)膜而導(dǎo)致內(nèi)膜增厚，是管腔狹窄的主要原因，而抑制血管內(nèi)膜增厚、防止血管再狹窄是心血管病的研究熱點(diǎn)之一[14]。大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)可造成血管管腔狹窄、內(nèi)膜增厚，陳文明等[11]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后14 d可造成大鼠血管管腔狹窄、血管新生內(nèi)膜面積增大；尉希清等[15]發(fā)現(xiàn)大鼠球囊損傷后24 h可引起VSMC增殖、遷移，14 d后內(nèi)膜增生達(dá)到最高峰。本研究建立大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)模型后發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮剝落、有新生內(nèi)膜形成，血管管腔呈向心、偏心性狹窄，且血管內(nèi)膜面積、內(nèi)膜/中膜面積(IA/MA)、血管組織中炎性因子IL-6、TNF-α均增高，管腔面積減小，提示Model 組大鼠血管組織出現(xiàn)血管內(nèi)膜增厚和炎性反應(yīng)，表明造模成功。

目前臨床上用于PCI 術(shù)的藥物如雷帕霉素、紫杉醇等，可阻止損傷部位 VSMC增殖。但由于上述藥物在阻止VSMC 增殖遷移的同時(shí)，也會(huì)干預(yù)損傷動(dòng)脈血管再內(nèi)皮化的進(jìn)程，引起遲發(fā)性再狹窄、遲發(fā)性血栓形成，增加PCI術(shù)后心血管不良事件的發(fā)生[16]。因此尋找有效、安全的防治血管再狹窄藥物，具有重要的研究意義。LMWH對(duì)血管內(nèi)膜增生具有抑制作用，孫夫強(qiáng)等[17]發(fā)現(xiàn)LMWH可抑制急性肺栓塞大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)膜增殖。高志偉等[18]發(fā)現(xiàn)LMWH可抑制兔VSMC增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，LMWH低、中、高劑量組大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮剝落、內(nèi)膜增生、狹窄等病理損傷現(xiàn)象減小，且血管內(nèi)膜面積、內(nèi)膜/中膜面積(IA/MA)、血管組織中炎性因子IL-6、TNF-α均降低，管腔面積增大，表明LMWH可抑制頸動(dòng)脈球囊損傷模型大鼠血管內(nèi)膜增厚，但具體分子機(jī)制還不甚明確。

正常生理狀態(tài)下，位于動(dòng)脈中層的VSMC，可收縮血管、維持血管彈性，AngⅡ可誘導(dǎo)VSMC增殖和遷移。Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)在病理誘導(dǎo)下，VSMC會(huì)異常增殖、遷移，并推測(cè)AngⅡ可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期因子，促進(jìn)Cx43表達(dá)，而促進(jìn)VSMC異常增殖、遷移。張坤等[20]發(fā)現(xiàn)杜鵑素可抑制Cx43表達(dá)，抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血管內(nèi)膜組織中AngⅡ mRNA及蛋白、Cx43蛋白表達(dá)增高，提示VSMC增殖、遷移可能與血管內(nèi)膜組織中AngⅡ、Cx43高表達(dá)有關(guān)。HB-EGF可促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，與動(dòng)脈粥樣硬化形成有關(guān)，Jiang等[21]發(fā)現(xiàn)在PCI術(shù)后冠脈再狹窄患者血清和血管組織中，HB-EGF基因及蛋白表達(dá)水平均高于正常患者，并推測(cè)HB-EGF 可能促進(jìn)支架內(nèi)的內(nèi)膜增殖及血管重構(gòu)，促進(jìn)血管狹窄，是PCI冠脈再狹窄的危險(xiǎn)因素之一；然而Rattik等[22]對(duì)384例發(fā)生急性冠狀動(dòng)脈事件的患者血漿和組織中HB-EGF 水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)低于正常對(duì)照組，并推測(cè)HB-EGF 可能通過促進(jìn)斑塊穩(wěn)固來減少急性冠狀動(dòng)脈事件的發(fā)生，HB-EGF可能是心血管疾病發(fā)生的一個(gè)保護(hù)因素。而本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠頸動(dòng)脈血管組織中HB-EGF蛋白表達(dá)均高于假手術(shù)組，與Jiang等[21]研究一致，表明HB-EGF異常高表達(dá)可能促進(jìn)內(nèi)膜增殖、血管狹窄的發(fā)展。與模型組比較，LMWH低、中、高劑量組大鼠頸動(dòng)脈血管組織中AngⅡ mRNA及蛋白、HB-EGF mRNA及蛋白、Cx43蛋白表達(dá)均降低，且各劑量組呈劑量依賴性。表明LMWH抑制頸動(dòng)脈球囊損傷模型大鼠血管內(nèi)膜增厚作用，可能與抑制AngⅡ、Cx43、HB-EGF 表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，LMWH可抑制頸動(dòng)脈球囊損傷模型大鼠頸動(dòng)脈血管組織AngⅡ、HB-EGF基因及蛋白表達(dá)，抑制血管內(nèi)膜增生。為臨床治療頸動(dòng)脈球囊損傷及PCI術(shù)后冠脈再狹窄，闡明LMWH可能存在的新的分子藥理機(jī)制，提供一定的參考。但本研究也存在一定的不足，血管內(nèi)膜增生及狹窄分子機(jī)制水分復(fù)雜，AngⅡ、HB-EGF參與血管內(nèi)膜增生的靶標(biāo)分子還不明確，這有待后續(xù)繼續(xù)研究。