飼喂胡蘿卜對(duì)昆明小鼠免疫功能的影響*

劉 慧，趙明星，王玉輝，沈 今，陳增汀，許 多，秦延苓，徐德立

(曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，273165，山東省曲阜市)

0 引 言

免疫反應(yīng)一般是指生物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)識(shí)別并通過免疫應(yīng)答清除自身病變腫瘤和侵入生物體“異我”的過程[1].動(dòng)物的免疫系統(tǒng)能夠抵御環(huán)境中的病原體例如病毒、細(xì)菌和真菌等的入侵，對(duì)于保障動(dòng)物的生存具有重要作用.免疫功能是否正常對(duì)于動(dòng)物體的健康生存至關(guān)重要，它在一定程度上可以反映動(dòng)物的生存能力并影響到動(dòng)物的適合度[2].影響動(dòng)物免疫能力的因素有很多，如季節(jié)、溫度、光周期和食物等[3-5].其中食物質(zhì)量是影響動(dòng)物免疫功能重要的影響因素之一，食物的影響包括食物數(shù)量和食物成分的變化對(duì)免疫的作用.

胡蘿卜為傘形科植物，花極小，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有脂肪、蛋白質(zhì)和各類維生素等，其中含量最高的是深橘色的胡蘿卜素[6].根據(jù)功能組分，類胡蘿卜素分為葉黃素類和胡蘿卜素類.研究表明，類胡蘿卜素不僅在動(dòng)物生產(chǎn)性能和繁殖功能發(fā)揮重要作用，還可提高機(jī)體免疫能力[7-8].補(bǔ)充類胡蘿卜素可增加虹鱒(Oncorhynchusmykiss)血清補(bǔ)體、溶菌酶活性和免疫球蛋白含量[9].胡蘿卜素主要有α、β和γ共3種形式，其中β-胡蘿卜素含量最多且活性最強(qiáng)[10].在肉牛(Goveрastoka)的飼糧中添加不同水平的β-胡蘿卜素，通過對(duì)血液生理指標(biāo)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素提高了血液中中性粒細(xì)胞(neutrophil,GRNA)和淋巴細(xì)胞百分比(lymphocyte,LYM)[11].補(bǔ)充β-胡蘿卜素可以被豬(Svinja)的淋巴細(xì)胞特異性吸收進(jìn)而增強(qiáng)其免疫功能[12]；同樣補(bǔ)充β-胡蘿卜素可以增加小鼠體內(nèi)IL-2、IL-4以及抗體水平含量[13].補(bǔ)充β-胡蘿卜素也可促進(jìn)輻射小鼠T-淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的殺傷活性以及IL-2活性，提高小鼠細(xì)胞免疫水平[14].然而，飼喂胡蘿卜是否會(huì)對(duì)動(dòng)物免疫功能產(chǎn)生影響尚未可知，有必要研究胡蘿卜對(duì)不同物種免疫功能的影響.

細(xì)胞免疫屬于獲得性免疫系統(tǒng)，植物血球凝集素(Phytohaemagglutinin,PHA)反應(yīng)用于反映哺乳動(dòng)物細(xì)胞免疫能力[15].免疫器官如胸腺和脾臟也可以反映免疫功能.白細(xì)胞參與免疫反應(yīng)，因此白細(xì)胞數(shù)目也能反映動(dòng)物的健康水平[16].

本實(shí)驗(yàn)以成年雄性昆明小鼠為研究對(duì)象，探究飼喂胡蘿卜對(duì)其免疫能力的影響，我們預(yù)測(cè)喂食胡蘿卜可能會(huì)增強(qiáng)小鼠的免疫功能.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是3月齡雄性昆明小鼠(購(gòu)于濟(jì)南朋悅動(dòng)物有限公司)，單籠飼養(yǎng)(30 cm×15 cm×20 cm)，飼養(yǎng)溫度為23±1 ℃，光周期為12L∶12D(Light∶Dark)，墊料為鋸末，食物為標(biāo)準(zhǔn)大小鼠飼料(北京科奧協(xié)力飼料有限公司)，自由取食和飲水，單籠飼養(yǎng)兩周后，將28只小鼠隨機(jī)分為胡蘿卜和飼料組(Carrot-Food group,n=8)、第二組是只投喂胡蘿卜組(Carrot group,n=10)，第三組是只投喂飼料組(Food group,n=10).飼養(yǎng)15 d后將3組小鼠處死.

1.2 體重秤量

每3天同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠體重進(jìn)行稱量，稱量?jī)x器為電子天平(0.1 g).

1.3 動(dòng)物處死和解剖及器官重量稱量

將每一只昆明小鼠用 CO2輕度麻醉后，用滅菌后的剪刀在其頸部剪開取血，將血液滴在離心管內(nèi)，每一支離心管上都標(biāo)好標(biāo)號(hào)，然后將其放在冰盒里靜置半小時(shí)左右，立即放在離心機(jī)中 4 ℃ 5000 r/m 條件下離心 30 min，取血清置于新離心管中，在超低溫冰箱(-80 ℃)內(nèi)保存，備用.取血后迅速分離肩胛骨間的褐色脂肪組織(brown adipose tissue,IBAT)，置于 1.5 mL 的離心管內(nèi)并稱重.用消毒滅菌后的手術(shù)剪刀和鑷子取出動(dòng)物的心臟、肺臟、胸腺、肝臟、脾臟、腎臟、腎上腺、睪丸、附睪、儲(chǔ)精囊等各個(gè)器官，并仔細(xì)分離各器官表面的結(jié)締組織和脂肪組織，用濾紙吸干分離出的各器官表面的血液和水分，然后稱重(精確到0.001 g)，將其作為器官鮮重并將各數(shù)據(jù)做好記錄，將各器官用錫箔紙包裹置于冰箱中冷藏.依次取出胃、小腸、盲腸、結(jié)腸并分離開，同樣方法清除表面的脂肪組織和結(jié)締組織，秤量胃及內(nèi)容物、小腸及內(nèi)容物、盲腸及內(nèi)容物、結(jié)腸及內(nèi)容物的重量并做好記錄，然后將其縱向剖開，用生理鹽水洗去內(nèi)容物，并用吸水紙吸去表面水分和血液，稱重，作為器官鮮重并做好實(shí)驗(yàn)記錄.稱量分離出的性腺周圍脂肪、腹膜后脂肪、皮下脂肪、腸系膜脂肪的重量，并計(jì)算其總重量，作為動(dòng)物體總體脂重，各脂肪重與終體重的比值為脂肪含量[17].

1.4 白細(xì)胞數(shù)目的檢測(cè)

將小鼠麻醉處死后，在其頸部取血，然后立即用移液槍吸取20 μL血液，防止血液冷凝，將其溶在實(shí)驗(yàn)前配置好的0.38 mL的白細(xì)胞稀釋液(含1.5%的冰醋酸和1%龍膽紫)，吹打混勻.接著，用移液槍吸取以上混合液20 μL滴在白細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，用10倍顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)，記錄視野下白細(xì)胞總數(shù)，血液中白細(xì)胞數(shù)(109cells/L)=視野中白細(xì)胞數(shù)×(5×107)[18-19].

1.5 細(xì)胞免疫(PHA反應(yīng))的檢測(cè)

為檢測(cè)哺乳動(dòng)物的免疫功能，我們通常在動(dòng)物足墊位置注射植物血球凝集素(PHA).具體操作步驟如下：首先用75%的酒精擦拭小鼠的左后足足墊并用數(shù)顯電子測(cè)微尺測(cè)定其厚度，每只小鼠測(cè)量6次，記錄數(shù)據(jù)取平均值作為初始足墊厚度.然后用微量注射器吸取30 μL的PHA注射液(含0.1 mg的pH值為7.4的無菌PBS緩沖液)，注射于足墊的中心處，為保證注入全部的注射液，在注射的時(shí)候要輕推.在注射PHA后的6 h,12 h,24 h,48 h，分別測(cè)定每只昆明小鼠的的足墊厚度，每次測(cè)量6次，最后取平均值作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).注意在測(cè)量過程中為了減小實(shí)驗(yàn)測(cè)量誤差，要保證所有數(shù)據(jù)都為同一人測(cè)量.PHA反應(yīng)的計(jì)算公式為(注射后足墊厚度-初始足墊厚度)/初始足墊厚度[20-21].

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析時(shí)應(yīng)用SPSS 18.0軟件.統(tǒng)計(jì)分析之前檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布，用體重做協(xié)方差校正，分析方法為單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示有顯著性影響，相反，P>0.05說明無顯著性影響.

2 結(jié)果與分析

2.1 體重

3組小鼠在Day 3 (F2,27=1.269,P=0.299)、Day 6 (F2,27=2.217,P=0.13)和Day 9 (F2,27=2.557,P=0.098)中體重?zé)o明顯差異，但在Day 12 (F2,27=3.806,P=0.036)和Day 15 (F2,27=4.524,P=0.021)中飼喂胡蘿卜組小鼠體重明顯低于其他2組.

圖1 喂食胡蘿卜對(duì)小鼠體重的影響

2.2 身體成分

喂食胡蘿卜對(duì)小鼠胴體鮮重、腸系膜脂肪重、腹膜后脂肪重及含量和脂肪總重有顯著性影響，且飼喂胡蘿卜組小鼠明顯低于其他兩組(表1).

表1 喂食胡蘿卜對(duì)昆明小鼠身體成分的影響

2.3 內(nèi)臟器官

喂食胡蘿卜使昆明小鼠肩胛間褐色脂肪組織(IBAT)、肺、肝臟、腎臟和儲(chǔ)精囊的鮮重顯著降低， 使胃及內(nèi)容物、小腸及內(nèi)容物、盲腸及內(nèi)容物、小腸長(zhǎng)度、結(jié)腸及內(nèi)容物、消化道總重、消化道總長(zhǎng)顯著增加，但是對(duì)昆明小鼠腦、下丘腦、心臟、腎上腺、盲腸長(zhǎng)度、結(jié)腸長(zhǎng)度、睪丸和附睪無顯著性影響(表2).

表2 喂食胡蘿卜對(duì)昆明小鼠內(nèi)臟器官的影響

續(xù)表

2.4 免疫器官

喂食胡蘿卜對(duì)小鼠的胸腺鮮重(F2,27=9.925,P<0.001)和脾臟鮮重(F2,27=6.775,P=0.005)有顯著性影響，且喂食胡蘿卜組免疫器官鮮重低于其2兩組.

圖2 喂食胡蘿卜對(duì)昆明小鼠胸腺(A)和脾臟(B)的影響

2.5 白細(xì)胞總數(shù)

喂食胡蘿卜對(duì)昆明小鼠的白細(xì)胞總數(shù)無顯著性影響(F2,27=0.580,P=0.567).

圖3 喂食胡蘿卜對(duì)昆明小鼠白細(xì)胞數(shù)目的影響

2.6 PHA反應(yīng)

喂食胡蘿卜顯著提高了昆明小鼠注射PHA 6h (F2,27=5.419,P=0.011)后的PHA反應(yīng)，但對(duì)注射PHA 12 h (F2,27=1.448,P=0.254)、24 h (F2,27=3.054,P=0.065)和48h (F2,27=0.003,P=0.997)后的PHA反應(yīng)無顯著性影響，PHA反應(yīng)隨時(shí)間的增加而降低.

圖4 喂食胡蘿卜對(duì)昆明小鼠PHA反應(yīng)的影響

3 討 論

喂食胡蘿卜增強(qiáng)昆明小鼠細(xì)胞免疫水平，但降低胸腺和脾臟鮮重，對(duì)白細(xì)胞數(shù)目沒有影響.

3.1 身體成分

喂食胡蘿卜不影響昆明小鼠腦、下丘腦、心臟、腎上腺、盲腸長(zhǎng)度、結(jié)腸長(zhǎng)度、睪丸、附睪以及性周脂肪、皮下脂肪等身體成分的重量.與喂食飼料組和胡蘿卜-飼料組相比，喂食胡蘿卜組的小鼠體重顯著降低，是由于只喂食胡蘿卜，提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)單一，不能滿足小鼠生長(zhǎng)的全部所需.食物對(duì)不同的動(dòng)物的影響程度不一樣，但普遍，當(dāng)食物種類單一，且數(shù)量不足時(shí)，動(dòng)物的免疫能力將會(huì)受到抑制，造成抵抗能力下降[22].且同時(shí)投喂組和只喂食飼料組小鼠體重之間也沒有顯著性差異，與Amar等研究的喂食含類胡蘿卜素的飼料不會(huì)提高虹鱒的生長(zhǎng)率和增重率相一致[9].

3.2 免 疫

對(duì)于動(dòng)物體來說，胸腺和脾臟是非常重要的免疫器官，常用來衡量免疫功能.在本實(shí)驗(yàn)中，喂食胡蘿卜對(duì)小鼠脾臟和胸腺鮮重有顯著性影響，但與我們預(yù)期不同的是，喂食胡蘿卜組脾臟和胸腺鮮重顯著低于其他兩組，我們推測(cè)可能是由于只食用胡蘿卜營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏體重下降所致.

白細(xì)胞可用來抵御病原體，但此次實(shí)驗(yàn)中，3組昆明小鼠之間白細(xì)胞數(shù)目沒有顯著性差異，說明喂食胡蘿卜對(duì)昆明小鼠白細(xì)胞數(shù)目無顯著性影響.雖然與我們預(yù)期不同，但有研究發(fā)現(xiàn)，在肉牛的飼糧中添加不同水平的β-胡蘿卜素，對(duì)其體重和白細(xì)胞數(shù)目沒有顯著性影響，與我們研究結(jié)果相一致[11].

PHA刺激淋巴細(xì)胞的增殖和局部炎癥，當(dāng)被注射到皮膚中或皮膚下時(shí)PHA會(huì)誘導(dǎo)白細(xì)胞浸潤(rùn)從而引起腫脹，其厚度被解釋為免疫應(yīng)答強(qiáng)度的度量[26].PHA可作為反映由細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力的重要指標(biāo)[27].一般而言，PHA反應(yīng)會(huì)在6 h達(dá)到最大值，在48 h的時(shí)候恢復(fù)到原始狀態(tài).本實(shí)驗(yàn)中，喂食胡蘿卜組昆明小鼠注射PHA 6 h后，PHA反應(yīng)顯著高于其他兩組，但在注射PHA 12 h、24 h和48 h后，3組小鼠PHA反應(yīng)無顯著性差異，說明喂食胡蘿卜可提高小鼠的由細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能.相關(guān)研究表明，飼喂加入β-胡蘿卜素的飼料可以顯著提高母豬初乳IgM、IgA和IgG的濃度，提高了其免疫功能[23].Von Euler等研究表明β-胡蘿卜素具有維生素A的活性，確定了β-胡蘿卜素與維生素A之間的關(guān)系[24].維生素A是一種重要的免疫增強(qiáng)劑和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，那么本實(shí)驗(yàn)中喂食胡蘿卜使昆明小鼠細(xì)胞免疫的增強(qiáng)是不是與β-胡蘿卜素中的維生素A活性有關(guān)呢？Bendich發(fā)現(xiàn)，免疫功能的增強(qiáng)是β-胡蘿卜素的作用而不是因?yàn)榫S生素A的活性[25].同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)輻射小鼠分別補(bǔ)充β-胡蘿卜素、蝦青素、斑蝥黃素和番茄紅素后，均可使輻射小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)目、NK細(xì)胞殺傷活性以及IL-2活性得到顯著的提高，除β-胡蘿卜素外均不含維生素A活性，因此細(xì)胞免疫的提高與是否轉(zhuǎn)化為維生素A無關(guān)[14].

總之，喂食胡蘿卜可增強(qiáng)昆明小鼠細(xì)胞免疫，且只喂食胡蘿卜顯著降低了昆明小鼠體重和免疫器官鮮重，對(duì)白細(xì)胞數(shù)目無顯著性影響.