通過組織培養(yǎng)快速繁殖金錢木的研究*

劉雅鑫，葛富月，李婧璐，劉柏玲

(曲阜師范大學生命科學學院，273165，山東省曲阜市)

0 引 言

金錢木(Portulacamolokiniensis)，別稱圓貝馬齒莧、云葉、金鋮木，為馬齒莧科(Portulacaceae)馬齒莧屬(Portulaca)的多年生常綠草本，因肥厚的葉片排列整齊形似銅錢而得名，是近年來流行的室內(nèi)觀葉植物.金錢木高12～35 cm，主莖直立，呈圓柱形，具分支.葉交互對生，無柄或近無柄，肉質(zhì)，長圓形或倒卵形，沿莖的頂端部分簇生排列成4個覆瓦狀，下部葉隨著植株的生長逐漸凋落，上部葉常聚生成總苞狀.頭狀花序，黃色，清晨開放，夜晚即閉合[1].金錢木具有較高的觀賞價值和經(jīng)濟效益，目前金錢木的生產(chǎn)繁殖方式主要是分株和扦插，有較大的局限性，限制了其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.植物組織培養(yǎng)技術不受季節(jié)和環(huán)境的限制，可以克服傳統(tǒng)技術繁殖的缺點，是快速繁殖植物的簡便可靠方法[2-4].據(jù)我們所知，目前尚未發(fā)現(xiàn)有關金錢木快速繁殖方法的報道.因此我們根據(jù)同屬植物馬齒莧(portulacaoleracea)組織培養(yǎng)的研究，開展金錢木的組織培養(yǎng)快速繁殖試驗.本研究以金錢木的葉片為外植體，在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度和不同種類的植物激素研究其對金錢木葉片誘導和增殖效果的影響，探索出最佳培養(yǎng)基配方，建立了金錢木快速繁殖的組織培養(yǎng)體系，為其工廠化生產(chǎn)提供了技術參考，有利于金錢木的便捷高效生產(chǎn).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料購自杭州丹諾園藝有限公司，種植于曲阜師范大學生命科學學院溫室，以健康金錢木葉片為外植體，MS(Murashige and Skoog)為基本培養(yǎng)基進行試驗.

1.2 試驗方法

1.2.1 選材與消毒

從金錢木植株上選取生長狀態(tài)良好、肉質(zhì)化程度高的葉片為外植體.為除去葉片表面灰塵，加洗潔精清洗之后在緩水下沖洗30 min后放入已滅菌的空瓶中.在超凈工作臺中用70%酒精消毒30 s后用無菌水沖洗2～3次.之后再用0.1%升汞(HgCl2)溶液消毒5 min(加入1～2滴吐溫使消毒更充分)，期間不停地搖晃，最后用無菌水沖洗3～5次，每次1 min.將消毒后的葉片置于無菌濾紙上吸去多余的水分，之后用解剖刀切成約1 cm2大小，備用.

1.2.2 不定芽誘導培養(yǎng)

將切好的外植體接種至添加不同細胞分裂素6-BA(6-benzylaminopurine，芐胺基嘌呤)、KT(kinetin，激動素)和TDZ(thidiazuron，苯基噻二唑基脲)的MS基本培養(yǎng)基中誘導不定芽的產(chǎn)生(表1).28 d后統(tǒng)計誘導的不定芽數(shù)量和不定芽誘導率.

不定芽誘導率=(產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%.

1.2.3 不定芽增殖培養(yǎng)

選取初代培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的不定芽，切下后接種到含有不同濃度的6-BA和NAA(naphthaleneacetic acid，萘乙酸)組合的MS培養(yǎng)基中(表2)，探究不同激素濃度組合對金錢木不定芽增殖的影響.第7 d統(tǒng)計不定芽的數(shù)目、增殖系數(shù)(倍)和玻璃化率.

不定芽增殖系數(shù)=產(chǎn)生的不定芽數(shù)目/接種的不定芽數(shù)目.

玻璃化率=(不定芽發(fā)生玻璃化數(shù)目/產(chǎn)生的不定芽數(shù)目)×100%.

1.2.4 不定芽生根培養(yǎng)

選取增殖培養(yǎng)中生長狀態(tài)一致的不定芽置于不同的生根培養(yǎng)基中(表3)，探究不同濃度的NAA、IBA(indole-butyric acid吲哚丁酸)、IAA(indole-3-acetic acid 吲哚乙酸)對金錢木不定芽生根的影響.第21 d統(tǒng)計生根的數(shù)目、根長、生根率以及植株高度.

試管苗生根率=(生根試管苗數(shù)/接種試管苗數(shù))×100%.

1.2.5 煉苗與移栽

選擇根系良好、生長健壯的金錢木幼苗，打開瓶蓋煉苗.第4天，取出瓶里的無菌苗，用清水洗凈根部粘附的培養(yǎng)基，于通風處晾干.將幼苗移入混有蛭石(營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)的土壤中.一個月后統(tǒng)計成活率.

成活率=(成活的植株數(shù)/移栽的植株數(shù))×100%.

1.2.6 培養(yǎng)條件

選用MS為基本培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基中添加30 g蔗糖，6.5 g瓊脂，加入不同種類和不同濃度的激素，將pH調(diào)至5.8～6.0，分裝后，高壓滅菌(1.1 Mpa，121 ℃)15 min.外植體接種后均置于培養(yǎng)溫度為251±1 ℃，光照12 h/d，光照強度為1 500～2 000 lx的培養(yǎng)室中培養(yǎng).

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

每瓶培養(yǎng)基中接種3個外植體，每處理5瓶，重復3次.利用SPSS 17.0進行方差分析和Duncan檢驗.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同細胞分裂素對金錢木誘導不定芽的影響

為誘導金錢木的葉片形成愈傷組織進而誘導不定芽，在MS培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的6-BA、KT和TDZ(表1).結(jié)果表明，外植體切口處在第7 d開始出現(xiàn)愈傷組織，體積變大并增厚(圖1A).第14 d左右，愈傷組織上長出不定芽，極少數(shù)的不定芽直接在外植體上誘導出來，不定芽剛開始為嫩黃色，此后迅速生長增大轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色(圖1B).在不添加任何細胞分裂素時，不能誘導出愈傷組織和不定芽，而細胞分裂素6-BA在誘導金錢木愈傷組織形成的過程中起關鍵作用.在含有6-BA的MS培養(yǎng)基中，產(chǎn)生了較多的愈傷組織且誘導出不定芽，各個處理的愈傷組織較大，誘導出的不定芽數(shù)量較多，葉片較大.在含有0.5 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基中，誘導的不定芽數(shù)量最多，為5.8個；6-BA為0.5 mg/L和 1 mg/L的MS培養(yǎng)基中，不定芽誘導率分別達到了93.3%和95.6%.因此，誘導金錢木不定芽產(chǎn)生的最適培養(yǎng)基為MS + 6-BA 1.0 mg/L. KT和TDZ不利于愈傷組織的形成，不能或只能少量誘導出不定芽.

表1 不同細胞分裂素對金錢木不定芽誘導的影響

續(xù)表

2.2 不同濃度組合的6-BA和NAA對金錢木不定芽增殖的影響

將生長狀況良好的不定芽分別接種在不同濃度的6-BA和NAA培養(yǎng)基中對不定芽進行增殖培養(yǎng)(表2).結(jié)果表明，細胞分裂素6-BA濃度為0.5 mg/L時，組培苗的玻璃化現(xiàn)象較嚴重，隨著NAA濃度的增加，不定芽增殖系數(shù)逐漸降低.當6-BA濃度較高(1 mg/L)時，不定芽生長情況隨時間的延長出現(xiàn)明顯分化，由1個芽分化形成多個不定芽(圖1C).當6-BA濃度為1.0 mg/L，NAA濃度為0.1 mg/L和0.3 mg/L時不定芽增殖率基本相同，而 NAA濃度為0.1 mg/L時，不定芽的葉片較大，不定芽玻璃化程度較低.綜上所述，金錢木不定芽增殖最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA.

2.3 不同濃度的生長素對金錢木不定芽生根的影響

將生長狀況一致的不定芽接種至含有不同濃度的NAA、IBA以及IAA的生根培養(yǎng)基中，觀察并分析其對金錢木不定芽生根的影響(表3).結(jié)果表明，第7 d開始出現(xiàn)不定根，第14 d時，大部分不定芽已長出根，第21 d時，大部分植株的根出現(xiàn)了纏繞，根的數(shù)量明顯增加(圖1D，E).當IBA濃度為0.1 mg/L時，不定芽生根率最高，根最長，植株高度最高.NAA濃度為0.5 mg/L時，植株的根數(shù)最多，但很細.綜上所述，誘導金錢木不定芽生根的最佳培養(yǎng)基為 1/2MS+0.1 mg/L IBA.

續(xù)表

2.4 煉苗與移栽

選取生根狀態(tài)良好的植株煉苗3 d，然后取出植株，根部培養(yǎng)基沖洗干凈后移入混合蛭石的土壤中.每天光照12 h，溫度維持在25 ℃左右，罩上透明蓋子保濕，一個月后統(tǒng)計植株存活率達90.0%以上(圖1F).

圖1 金錢木組織培養(yǎng)過程

3 討 論

3.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對金錢木不定芽誘導、增殖和生根的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑是組織培養(yǎng)中調(diào)控植物生長分化的關鍵因素，培養(yǎng)基中不同的生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度影響器官分化的過程[2-5].金錢木的葉片外植體在不添加任何細胞分裂素時不能形成愈傷組織和不定芽，而不同的細胞分裂素對金錢木不定芽的誘導和增殖效果不同，在含有6-BA的MS培養(yǎng)基中產(chǎn)生了較多的愈傷組織并誘導出不定芽，每個處理的愈傷組織均較大，誘導出的不定芽數(shù)量均較多，說明6-BA的誘導效果最好，這與李燾[6]、黃紅梅[7]等在馬齒莧(Portulacaoleracea)組織培養(yǎng)的研究結(jié)果一致，也與Liu等人在丹參(salviamiltiorrhiza)愈傷組織誘導的研究結(jié)果一致，即與TDZ和KT相比6-BA(1.0 mg/L)的誘導效果最好[8].本研究結(jié)果表明，高濃度的6-BA對愈傷組織的形成有抑制作用，與Liu等利用6-BA誘導丹參愈傷組織的影響一致[8]，這可能是6-BA的代謝活動誘導了植物組織中其他內(nèi)源激素的反應[9].在培養(yǎng)基中添加細胞分裂素TDZ時，外植體的不定芽誘導率和不定芽數(shù)均較低，而添加低濃度的KT時，不能形成愈傷組織和不定芽，表明KT對金錢木外植體誘導不定芽的產(chǎn)生沒有效果.在金錢木不定芽增殖培養(yǎng)中，在含有6-BA的培養(yǎng)基中添加生長素NAA，結(jié)果表明在細胞分裂素和生長素的相對濃度較高的情況下，不定芽的增殖率較高，這與Sivanesan等在瓜葉菊(Seneciocruentus)中的研究結(jié)果一致[10]，即在含有細胞分裂素的培養(yǎng)基中添加一定量的生長素可以促進不定芽的形成.健壯生長的不定芽在MS基本培養(yǎng)基中時，增殖率很低，并且出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，表明植物生長調(diào)節(jié)劑是金錢木不定芽增殖所必需的.

一般情況下只用生長素處理就能誘導生根[11].在人參(Panaxginseng)組織培養(yǎng)的生根誘導階段，Kim等人證明IBA的效果比NAA更有效[12].本試驗在1/2MS培養(yǎng)基中添加NAA、IBA和IAA三種生長素，其中IBA更有利于金錢木的不定芽誘導出不定根(圖1E)，不定芽生根率最高達88.9%，這與黃策群[7]、黃紅梅[13]等在馬齒莧組織培養(yǎng)的研究結(jié)果一致，說明生長素IBA是誘導金錢木不定芽生根的有效植物生長調(diào)節(jié)劑.

3.2 金錢木組織培養(yǎng)過程中玻璃化和褐化對其生長的影響

在金錢木的不定芽增殖培養(yǎng)中，不定芽發(fā)生玻璃化較普遍.玻璃化導致組培苗形態(tài)異常，使葉片呈透明化狀態(tài)[14,15].玻璃化的發(fā)生受多種因素的影響，比如外植體的類型；組培環(huán)境的通風條件、光照、溫度；培養(yǎng)基的成分；組培苗自身發(fā)育的影響等[16-18].金錢木不定芽玻璃化可能是由于培養(yǎng)基的水分含量較高、培養(yǎng)基的成分以及不定芽的內(nèi)部激素含量不均勻等因素造成的.因此，適當提高培養(yǎng)基中瓊脂的濃度、增加自然光照、控制光照時間、改善培養(yǎng)基的成分可減少玻璃化苗的產(chǎn)生.在后續(xù)的研究中可進行不同溫度對金錢木組織培養(yǎng)過程中玻璃化的試驗，探索出最適宜的培養(yǎng)溫度從而提高生產(chǎn)效率.

在金錢木的繼代培養(yǎng)過程中會有褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生，第14 d就能觀察到部分不定芽的頂部變黃，第30 d時，不定芽由最初的鮮綠色變?yōu)榘迭S色，最后變黑枯死.褐變主要是由于組培苗酚類物質(zhì)含量的不同和多酚氧化酶活性的差異造成的[19,20].褐化也與外植體類型、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等因素有關[15].劉淑蘭等對核桃(Juglansregia)的試驗證明，不同季節(jié)、不同樹齡的外植體，褐化發(fā)生的情況不同，通常幼齡外植體比老齡外植體褐化輕、褐化率低[21].在金錢木的組織培養(yǎng)試驗時盡量選擇幼嫩的葉片，以降低組培苗的褐化程度.在金錢木不定芽誘導第14 d左右即進行不定芽增殖試驗，防止不定芽褐化影響不定芽增殖培養(yǎng).另外，也可以通過在培養(yǎng)基中添加褐變抑制劑和吸附劑，多次轉(zhuǎn)移等方式降低褐化現(xiàn)象的發(fā)生[20].如何減少金錢木組織培養(yǎng)過程中玻璃化和褐化的產(chǎn)生還有待進一步的研究.

總之，在金錢木苗木繁殖中采用組培快繁技術，可以避免地理環(huán)境、季節(jié)和母本數(shù)量的限制，并且在較短時間內(nèi)快速繁殖這種經(jīng)濟價值較高的植物.本研究結(jié)果為利用組培方法大量繁殖金錢木的工廠化生產(chǎn)具有一定的指導意義.