雙氫青蒿素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞分泌MMP-9和TIMP-1的影響

栗志英，馬景紅*，齊秀芳，單鐵英，楊志紅，馬瑞晴，魏天慧，董付存，張素華

(1.河北工程大學(xué) a.附屬醫(yī)院；b.醫(yī)學(xué)院，河北 邯鄲056002；2.邯鄲市第一醫(yī)院 a.血液科；b.兒科；c.神經(jīng)內(nèi)科；3.邯鄲市中心醫(yī)院門(mén)診部)

近幾年來(lái)，逐漸增多的生育期婦女不能孕育胎兒，通過(guò)婦產(chǎn)科檢查發(fā)現(xiàn)其中多數(shù)人的子宮內(nèi)膜表現(xiàn)為粘連且纖維化病變，此種改變較難治愈且復(fù)發(fā)率較高，故成為相關(guān)醫(yī)學(xué)專家研究的焦點(diǎn)。至今子宮內(nèi)膜粘連且纖維化的發(fā)病機(jī)理尚沒(méi)有明確的定論，大量的文獻(xiàn)研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)能刺激多種器官的組織中間質(zhì)細(xì)胞的不僅數(shù)量增加而且活性增強(qiáng)，因此使細(xì)胞外的纖維和基質(zhì)成分異常增多[1-4]，如果不采取有效的干預(yù)或治療方法，最終將會(huì)導(dǎo)致該器官呈現(xiàn)出纖維化的改變。本文通過(guò)體外分離人子宮內(nèi)膜中的間質(zhì)細(xì)胞，觀察雙氫青蒿素(DHA)對(duì)TGF-β1作用的間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量以及分泌功能的變化，為子宮內(nèi)膜纖維化的逆轉(zhuǎn)提供一個(gè)新的啟示。

1 材料與方法

1.1 材料

正常子宮內(nèi)膜組織的來(lái)源：選出2019年6月1日—2019年月12月31日在邯鄲市第一醫(yī)院婦科門(mén)診就診，近半年內(nèi)無(wú)激素用藥史的生育期患者，留取手術(shù)室中刮出的內(nèi)膜組織，立即放入4℃的孵育液中，該組織經(jīng)病理檢查為正常組織且處于增生期。

DHA、TGF-β1(廣州源生醫(yī)藥科技有限公司)；MMP-9、波形蛋白和TIMP-1抗體(南京安研生物)；SP檢測(cè)試劑盒、酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分離出內(nèi)膜組織中的間質(zhì)細(xì)胞 將內(nèi)膜組織剪碎為小顆粒狀，滴入適量消化酶，在37℃的震蕩箱中作用30 min，篩除尚未消化的顆粒，將含有細(xì)胞的消化液置于半徑為6 cm的離心儀中，設(shè)置轉(zhuǎn)速600 r/min，時(shí)間10 min，留下懸浮液，再于1 200 r/min，離心10 min后，沉淀中加入有血清的培養(yǎng)液后常規(guī)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別觀察活細(xì)胞以及染色后的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，滴加抗體鑒別細(xì)胞的種類(lèi)。

1.2.2檢測(cè)間質(zhì)細(xì)胞的增殖情況 將細(xì)胞放入一個(gè)設(shè)有96個(gè)孔的細(xì)胞培養(yǎng)板里，將6個(gè)孔安排為一組，每個(gè)孔滴加200 μl的含有細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml的培養(yǎng)液，共設(shè)置為4組，對(duì)照組：按照常規(guī)方法培養(yǎng)；DHA組：常規(guī)培養(yǎng)液中滴入DHA；TGF-β1組：常規(guī)培養(yǎng)液中滴入TGF-β1；TGF-β1+DHA組：常規(guī)培養(yǎng)液中滴入TGF-β1和DHA。滴加TGF-β1、DHA后其在培養(yǎng)液的含量分別為100、20 ng/ml。將其經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)48 h后，各孔均滴入噻唑藍(lán)溴化四唑重新孵育4 h，可見(jiàn)孔底有藍(lán)紫色結(jié)晶，板的孔向下放置在濾紙上，孔里的培養(yǎng)液被吸干凈后，滴加二甲基亞砜100 μl避光并輕震直到結(jié)晶消失，放在檢測(cè)儀里，讀取它們的吸光度數(shù)值。

1.2.3檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中Ⅰ型膠原的含量 細(xì)胞的分組情況同1.2.2，每組細(xì)胞孵育48 h后，吸取培養(yǎng)液分別放入4個(gè)試管中，按照酶聯(lián)免疫試劑盒的操作流程測(cè)出4組細(xì)胞分泌的Ⅰ型膠原的含量。

1.2.4檢測(cè)間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)MMP-9和TIMP-1含量 將細(xì)胞放入一個(gè)6個(gè)孔的板里，每個(gè)孔的底部放置蓋玻片，細(xì)胞的分組情況同1.2.2，細(xì)胞孵育48 h后，這時(shí)片上已經(jīng)長(zhǎng)滿細(xì)胞，將其取出后放入固定液中，按照細(xì)胞免疫化學(xué)染色的操作步驟，第一抗體分別為稀釋度為1∶500的MMP-9和TIMP-1的抗體，最后滴加二氨基苯聯(lián)胺對(duì)每組細(xì)胞內(nèi)的MMP-9和TIMP-1蛋白進(jìn)行顯色，通過(guò)圖像分析系統(tǒng)讀取間質(zhì)細(xì)胞質(zhì)里棕黃色的顆粒的吸光度值，最后計(jì)算出每組的平均吸光度值來(lái)衡量細(xì)胞中MMP-9和TIMP-1蛋白的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 觀察間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)

剛從內(nèi)膜組織中分離的間質(zhì)細(xì)胞形狀為圓形，放入培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)1天后就能緊貼瓶底。3天時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)大，爬滿瓶底，染色后可以清晰看出細(xì)胞向四周伸出長(zhǎng)短不一的突起，藍(lán)色的單個(gè)核居中。見(jiàn)圖1A、1B。經(jīng)波形蛋白抗體特異性的結(jié)合后，胞質(zhì)大部分顏色為棕黃色，見(jiàn)圖1C。

2.2 間質(zhì)細(xì)胞的增殖分析

對(duì)照組與DHA組的吸光度值相比無(wú)明顯差異(P>0.05)；TGF-β1組的吸光度值和對(duì)照組比較，其值顯著升高(P<0.05)；TGF-β1+DHA組與TGF-β1組相比，細(xì)胞的吸光度值明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 間質(zhì)細(xì)胞的增殖和分泌活性的分析

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)液中Ⅰ型膠原的分泌情況

對(duì)照組與DHA組的Ⅰ型膠原含量相比無(wú)明顯差異(P>0.05)；TGF-β1組與對(duì)照組比較，Ⅰ型膠原在培養(yǎng)液中的量明顯升高(P<0.05)；TGF-β1+DHA組與TGF-β1組相比，Ⅰ型膠原的含量明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.4 間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)MMP-9和TIMP-1蛋白的含量分析

對(duì)照組與DHA組胞質(zhì)內(nèi)兩種蛋白含量相比無(wú)明顯差異(P>0.05)；TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)MMP-9的含量稍微高于對(duì)照組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)無(wú)明顯差異(P>0.05)，TIMP-1的含量超過(guò)對(duì)照組(P<0.05)，MMP-9/TIMP-1的值小于對(duì)照組(P<0.05)。TGF-β1+DHA組細(xì)胞內(nèi)MMP-9的含量明顯超過(guò)TGF-β1組(P<0.05)，TIMP-1的含量明顯少于TGF-β1組(P<0.05)，MMP-9/TIMP-1的值大TGF-β1組(P<0.05)，見(jiàn)圖2，表1。

注：TGF-β1—轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；DHA—雙氫青蒿素；MMP-9—基質(zhì)金屬蛋白酶-9；TIMP-1—基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1

3 討論

宮腔粘連或纖維化是指靠近子宮腔面的子宮內(nèi)膜組織發(fā)生了纖維化，纖維化的組織容易粘連在一起使宮腔局部或全部消失，通過(guò)宮腔鏡可以看見(jiàn)，纖維化的組織失去了正常質(zhì)軟和紅潤(rùn)的顏色，變得色白且質(zhì)硬[5-7]。病理組織學(xué)檢查，纖維化的部位表面沒(méi)有上皮組織，只有纖維成分較多的結(jié)締組織[8]。影響子宮內(nèi)膜纖維化發(fā)生、發(fā)展的因素較多，作用機(jī)理也比較復(fù)雜，其最終的作用結(jié)局是正常的內(nèi)膜組織被纖維成分較多的結(jié)締組織代替。醫(yī)學(xué)研究表明，在為數(shù)多種的導(dǎo)致纖維化的因子中，TGF-β1的作用較為重要。實(shí)驗(yàn)證明，它在心臟[9]、腎臟[10]、肺臟[11]以及肝臟[12]等人體的多種器官組織的纖維化的發(fā)生和發(fā)展中均扮演者重要的角色。歸納其作用機(jī)理：第一，它能刺激組織中的間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多，并能增強(qiáng)其分泌膠原纖維等基質(zhì)成分到細(xì)胞外；第二，在它的刺激下，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為能分泌基質(zhì)成分的間充質(zhì)細(xì)胞；第三，它還能影響分解細(xì)胞外成分的酶—MMPs和它的特異性拮抗劑TIMPs的含量，使基質(zhì)金屬蛋白酶的量增加，而其抑制劑的含量降低。已經(jīng)有研究已經(jīng)證明，TGF-β1和MMP-9在子宮內(nèi)膜纖維化的所起作用[13-14]。

MMPs共有5種亞型，均能特異性地分解細(xì)胞外基質(zhì)中的組成成分，其中MMP-9，可以專門(mén)作用于Ⅳ、Ⅴ型膠原以及纖纖維連接蛋白等。TIMPs共有4種亞型，其作用與MMPs的作用相反，TIMP-1是MMP-9的拮抗劑[15-16]。在正常的組織器官里，二者的水平維持著基質(zhì)中某些成分的平衡，當(dāng)組織中MMP-9/ TIMP-1 的值下降時(shí)，基質(zhì)中的Ⅳ、Ⅴ型膠原以及纖纖維連接蛋白等成分含量就會(huì)過(guò)多，組織就會(huì)出現(xiàn)纖維化。

青蒿素為眾所周知的抗瘧疾的藥物，雙氫青蒿素(DHA)是它的一種衍生物，文獻(xiàn)報(bào)道DHA的藥理學(xué)作用較多，它具有改變免疫系統(tǒng)的活性、消滅腫瘤細(xì)胞以及降低炎癥反應(yīng)等[17-19]。近年來(lái)也有研究顯示，青蒿琥酯通拮抗肝組織內(nèi)的星狀細(xì)胞的數(shù)量和活性來(lái)減輕其組織的纖維化進(jìn)程[20]。本研究的體外培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)照組的子宮內(nèi)膜細(xì)胞中含有微量的MMP-9和TIMP-1，經(jīng)TGF-β1刺激的細(xì)胞中MMP-9的水平雖有所上升，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)顯示二者沒(méi)有差異(P>0.05)，TIMP-1的水平比對(duì)照組明顯增加(P<0.05)，MMP-9/TIMP-1的值比對(duì)照組減少(P<0.05)。TGF-β1+DHA組的細(xì)胞中MMP-9的水平比TGF-β1組明顯上升(P<0.05)，TIMP-1的的水平比TGF-β1組明顯下降(P<0.05)，MMP-9/TIMP-1的值比TGF-β1組增加(P<0.05)。因此得出，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜纖維化改變的原因不能簡(jiǎn)單的定義為MMP-9的降低以及TIMP-1水平的上升，而是要看這兩種酶的比值的波動(dòng)情況，即TIMP-1水平上升的值能全部抵消MMP-9水平增高所帶來(lái)的間質(zhì)成分增加的后果。向經(jīng)TGF-β1細(xì)胞培養(yǎng)液中加入DHA 后，MMP-9水平明顯上升但是TIMP-1水平明顯下降，MMP-9/TIMP-1的比值上升，也就是說(shuō)TIMP-1的功效相對(duì)降低，MMP-9的溶解間質(zhì)成分的能力相對(duì)增強(qiáng)，可以起到抑制子宮內(nèi)膜纖維化的效果。