胃癌根治性手術(shù)前后TM4SF1水平及病理特征變化研究

郭俊龍，梁 濱，田偉軍

(1.天津市寧河區(qū)醫(yī)院，天津301500；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津300052)

由于人們生活習(xí)慣的改變，飲食不規(guī)律，生活壓力過(guò)大，胃癌的發(fā)病率逐年上升。據(jù)國(guó)家癌癥中心2015年相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，胃癌發(fā)病率僅次于肺癌，居住地惡性腫瘤發(fā)病率居第二位。胃癌(GC)是最常見的惡性胃腸道癌，也是全球第二大癌癥相關(guān)死亡原因[1-3]。盡管治療手段的進(jìn)步，GC的預(yù)后仍然很差。許多病人在診斷時(shí)被發(fā)現(xiàn)患有晚期腫瘤，無(wú)法切除。這些患者的總生存率(OS)低于12個(gè)月。胃癌的早期診斷、靶向治療和預(yù)后評(píng)估中新的生物標(biāo)志物的研究具有重要的臨床意義。手術(shù)是治療早期胃癌的主要方式，但腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及擴(kuò)散與機(jī)體免疫水平有關(guān)[4]。為了探討胃癌患者根治性手術(shù)的效果及相關(guān)指標(biāo)對(duì)預(yù)后情況的判斷，本文選取天津市寧河區(qū)醫(yī)院2016年6月到2019年6月共收治的80例胃癌患者進(jìn)行回顧性分析，探討胃癌根治性手術(shù)前后TM4SF1(跨膜4超家族成員1)水平及病理特征變化。具體報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取天津市寧河區(qū)醫(yī)院2016年6月到2019年6月共收治的80例胃癌患者進(jìn)行回顧性分析，所有患者均行胃癌根治術(shù)。入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)胃鏡檢查及組織病理學(xué)確診為胃癌；符合胃癌根治性手術(shù)指征；能夠接受紫杉醇、氟尿嘧啶等常規(guī)化療藥物治療[5]；身體狀況及血液檢查均能耐受化療；研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽字同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：胃癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，不能進(jìn)行根治性手術(shù)；合并其他嚴(yán)重惡性腫瘤；合并心、肝、腎等器官疾?。缓喜⒏腥拘曰虼x性疾??；有慢性營(yíng)養(yǎng)不良史。所有患者中男性45例，女性35例；年齡為42到68歲，平均年齡(54.32±8.92)歲；病程3個(gè)月到1年，平均(0.64±0.34)年。

1.2 方法

TM4SF1染色的免疫組化及定量分析：石蠟包埋切片(4 μm厚)去石蠟切片，再水化，在10 mmol/L檸檬酸鈉(pH 6.0)中加熱10 min，以回收抗原。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶用3%H2O2猝滅。在4℃下與一級(jí)抗體(抗TM4SF1，1∶200，Abcam)孵育后，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的聚合物與二級(jí)抗體(Max Vision)結(jié)合培養(yǎng)TM在室溫下15 min后，在二氨基聯(lián)苯胺中顯影并用蘇木精輕微復(fù)染。陰性對(duì)照組除不加原發(fā)性抗體外，其余程序均相同。免疫組化結(jié)果由兩名對(duì)臨床資料不了解的病理學(xué)家獨(dú)立評(píng)估。在×200的條件下，對(duì)每個(gè)截面進(jìn)行了5個(gè)隨機(jī)視野檢查。腫瘤組織中TM4SF1的表達(dá)程度采用分級(jí)系統(tǒng)：0，陰性染色；1，淺黃色；2，淺棕色；3，深褐色。得分0定義為TM4SF1陰性，分?jǐn)?shù)1-3為TM4SF1陽(yáng)性。

免疫分析法：將均質(zhì)化的根治性手術(shù)前胃癌組織和根治性手術(shù)后胃粘膜組織織標(biāo)本置于RIPA裂解緩沖液中進(jìn)行裂解。在4℃下將裂解物(13 800 g)離心30 min。上清液用于Western blotting分析。用十二烷基硫酸鈉(SDS)負(fù)載緩沖液變性，在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h后，用兔抗TM4SF1單克隆抗體(1∶1000稀釋度，Abcam)或小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶2000稀釋度，Sigma-Aldrich)在4℃下孵育過(guò)夜。在用Tris-緩沖鹽水和吐溫-20(TBST)洗滌3次，每次10 min后，在室溫下用辣根周氧化酶(HRP)結(jié)合的小鼠抗兔IgG抗體(1∶2000稀釋，Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)探測(cè)1 h。用TBST洗滌后，使用化學(xué)發(fā)光光電表面辣根過(guò)氧化物酶試劑盒符合制造商的說(shuō)明。用Quantity One軟件(Bio-Rad，Hercules，CA)用密度計(jì)測(cè)量譜帶強(qiáng)度。TM4SF1蛋白水平標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 80例胃癌患者根治術(shù)前胃癌組織及鄰近非胃癌組織中TM4SF1表達(dá)

我們用免疫組化方法檢測(cè)了TM4SF1在胃癌組織及其鄰近非癌組織中的表達(dá)。結(jié)果表明，在同一切段中，TM4SF1在GC組織中呈陰性表達(dá)，在相鄰非癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)(圖1A)。在我們的患者隊(duì)列中，免疫組化分析顯示，在GC組織中TM4SF1的表達(dá)率(11.25%，9/80)顯著低于非癌性胃粘膜組織(72.50%，58/80)(圖1B)。

圖1 TM4SF1表達(dá)水平高、表達(dá)強(qiáng)與GC組織分化程度高有關(guān)。用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了TM4SF1在GC組織中的表達(dá)。TM4SF1(D)在(A)分化良好、(B)中度和(C)低分化GC組織中的表達(dá)率。

2.2 80例胃癌患者根治術(shù)后胃粘膜中TM4SF1水平表達(dá)情況對(duì)比分析

為探討TM4SF1在胃癌患者根治術(shù)后胃粘膜中的表達(dá)和定位，我們用正常胃粘膜石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示，大多數(shù)心臟和幽門粘膜中沒(méi)有TM4SF1染色(圖2A，C)。TM4SF1染色見于基底粘膜(圖2B)。值得注意的是，TM4SF1蛋白主要在固有腺體中表達(dá)，而在基底粘膜的宮頸粘液細(xì)胞中不表達(dá)。腸化生粘膜中也可見TM4SF1染色(圖2D)。TM4SF1染色在基底腺的主細(xì)胞中比在壁細(xì)胞中更強(qiáng)烈(圖2E)。統(tǒng)計(jì)分析表明，TM4SF1在胃底黏膜組織中的表達(dá)率(89.65%，52/58)高于心臟(16.67%，1/6)和幽門(16.67%，2/12)黏膜組織(圖2F)。胃底和化生粘膜中TM4SF1的陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)顯著差異(75.00%，3/4)(圖2F)。提示TM4SF1在胃癌患者根治術(shù)后胃粘膜中呈異質(zhì)性表達(dá)，在胃底黏膜中有較高的表達(dá)率。

圖2 TM4SF1在胃癌根治術(shù)后胃黏膜中的表達(dá)及定位。用免疫組化法檢測(cè)根治術(shù)后胃黏膜中TM4SF1的表達(dá)。(A) 心臟黏膜，(B)胃底黏膜，(C)幽門黏膜，(D)腸化生黏膜。(E) TM4SF1在基底腺主要細(xì)胞和壁細(xì)胞中的表達(dá)，(F) 胃組織特異性表達(dá)TM4SF1。

2.3 胃癌根治術(shù)前后TM4SF1表達(dá)水平對(duì)比

為了證實(shí)根治術(shù)前胃癌組織中TM4SF1蛋白水平低于根治術(shù)后胃黏膜組織，我們用Western印跡法比較了13對(duì)新鮮冷凍GC和根治術(shù)后胃黏膜標(biāo)本中TM4SF1蛋白水平。結(jié)果顯示，與匹配的非癌組織樣本(7.69%，1/13)相比，這些配對(duì)樣本在根治術(shù)前中表現(xiàn)出較低的TM4SF1表達(dá)(61.54%，8/13)(圖3)。這些數(shù)據(jù)表明胃癌根治術(shù)前TM4SF1水平低于胃癌根治術(shù)后。

圖3 胃癌根治術(shù)前胃癌組織中TM4SF1水平低于根治術(shù)后。用免疫印跡法檢測(cè)腫瘤組織和根治術(shù)后胃黏膜組織中TM4SF1的表達(dá)。C、癌組織；N，根治術(shù)后胃黏膜組織。GAPDH是定量的負(fù)荷控制和標(biāo)準(zhǔn)化參考。

2.4 胃癌根治術(shù)前后患者的病理特征對(duì)比分析

為了探討胃癌根治術(shù)對(duì)胃癌患者的治療效果，對(duì)比分析了根治性手術(shù)前與根治性手術(shù)后1年兩組患者的病理特征，結(jié)果顯示，手術(shù)前與手術(shù)后胃癌患者的腫瘤Borrmann分型、腫瘤pTNM分期、腫瘤pN分期患者不同分期人數(shù)對(duì)比差異顯著，如表1所示。

3 討論

胃癌是一種常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率均居世界前列。胃癌大多是通過(guò)胃炎-萎縮-腸-不典型增生的過(guò)程演變而來(lái)，其中萎縮、腸和不典型增生是胃癌的癌前病變[6-7]。本病早期無(wú)明顯癥狀，導(dǎo)致大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)本病已發(fā)展到晚期，無(wú)法通過(guò)手術(shù)治愈。因此尋找能夠判定患者胃癌根治術(shù)治療前后患者預(yù)后情況判斷的指標(biāo)具有重要價(jià)值。

表1 胃癌根治術(shù)前后患者的病理特征對(duì)比分析(n=80)

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)根治性手術(shù)前胃癌組織中TM4SF1蛋白水平低于根治性手術(shù)后胃粘膜組織。而且，TM4SF1的高表達(dá)率和高分化的GC組織有關(guān)。提示TM4SF1低表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。這與肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、腎癌和前列腺癌不同，后者的TM4SF1 mRNA和蛋白水平都很高。相關(guān)研究表明[8-9]，TM4SF1在胰腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)高于對(duì)照組。TM4SF1基因敲除抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在HepG2細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)TM4SF1可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少和細(xì)胞遷移增加，并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和體內(nèi)轉(zhuǎn)移。TM4SF1在癌變和發(fā)展中的作用可能是組織特異性的[10]。

我們還評(píng)估了TM4SF1在GC患者中的預(yù)后意義，發(fā)現(xiàn)TM4SF1的低表達(dá)與較差的總體生存率相關(guān)，這表明TM4SF1可能是GC患者的一個(gè)新的預(yù)后標(biāo)記物[11]。這與肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌、胰腺癌和膠質(zhì)瘤等癌癥不同TM4SF1的過(guò)度表達(dá)與這些癌癥的預(yù)后不良有關(guān)。因此，TM4SF1表達(dá)作為預(yù)后標(biāo)志物的作用取決于癌癥的類型。

USP10、S100A12、p53和Ki67是癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的腫瘤分子標(biāo)記物,USP10是一種去泛素化酶，它能從特定的蛋白質(zhì)底物中去除泛素，使蛋白質(zhì)從蛋白酶體降解中拯救出來(lái)[12]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[13]，TM4SF1是泛素化的，泛素化對(duì)其在細(xì)胞遷移中的功能至關(guān)重要。我們先前的研究表明，S100A12的表達(dá)與侵襲深度有關(guān)，并被評(píng)估為GC整體生存率差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。p53和Ki67是癌癥進(jìn)展的既定標(biāo)志物[14]。在目前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)TM4SF1的表達(dá)與胃癌中USP10、S100A12、p53或Ki67的表達(dá)沒(méi)有相關(guān)性，這表明TM4SF1在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中起著不同于USP10、S100A12、p53或Ki67的作用，盡管它們都有助于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。TM4SF1在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的確切作用值得進(jìn)一步研究[15]。

在目前的研究中，我們鑒定了TM4SF1的胃組織學(xué)定位，發(fā)現(xiàn)TM4SF1在正常胃粘膜中呈異質(zhì)性表達(dá)，在胃底粘膜中表達(dá)水平較高。而TM4SF1是一種跨膜蛋白，也存在于細(xì)胞質(zhì)中，暫時(shí)存在于培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中，并且在肺、乳腺、結(jié)腸、卵巢、腎臟的質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)小泡中大量表達(dá)，前列腺癌和正常血管內(nèi)皮細(xì)胞低表達(dá)，TM4SF1在胃組織中的細(xì)胞定位尚不清楚。

本研究中，為了探討胃癌根治術(shù)對(duì)胃癌患者的治療效果，對(duì)比分析了根治性手術(shù)前與根治性手術(shù)后1年兩組患者的病理特征，結(jié)果顯示，手術(shù)前與手術(shù)后胃癌患者的腫瘤Borrmann分型、腫瘤pTNM分期、腫瘤pN分期患者不同分期人數(shù)對(duì)比差異顯著，因此，對(duì)位胃癌根治性手術(shù)的患者來(lái)說(shuō)，早期治療，并預(yù)測(cè)預(yù)后胃癌殘留具有重要價(jià)值。隨著臨床科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，早期胃癌檢出率的增加，不僅提升了胃癌的預(yù)后情況，同時(shí)也為胃癌根治性手術(shù)治療患者提供了更多治療可能。