電針對高脂肥胖大鼠脂質(zhì)蓄積及瘦素抵抗的影響

龔美蓉， 李 茜， 張無雙， 陳 璐， 戴欣露，達明志， 湯棟梁， 畢肖林*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 針?biāo)幗Y(jié)合教育部重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

肥胖癥是由特定生化因子引起的一系列進食與能量調(diào)控的紊亂，過多攝入的能量以甘油三酯的形式過量蓄積以至于患者體重異常增加從而引起的一種代謝性疾病。近年來肥胖發(fā)病率逐年增加，因其伴隨諸多并發(fā)癥，如2型糖尿病、高血脂、心腦血管疾病等而備受關(guān)注。臨床和實驗研究發(fā)現(xiàn)瘦素抵抗是食源性肥胖癥的顯著特征，故提高機體對瘦素的敏感性是解決肥胖癥的一個關(guān)鍵步驟。在肥胖癥眾多治療方法中，針刺治療因其簡、便、效、廉而備受人們關(guān)注。針刺可以疏通經(jīng)絡(luò)，平衡陰陽，降低患者的食欲，同時增加其能量的消耗。本研究擬通過觀察電針對肥胖大鼠脂質(zhì)蓄積與瘦素抵抗的影響，為臨床上治療與預(yù)防肥胖癥的提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

健康SD大鼠42只，雄性，3周齡，體重70～90 g，由上海斯萊克實驗動物由限責(zé)任公司提供，動物合格證號：SCXK(滬)2012-0002。所有動物均飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心動物房內(nèi)，溫度20～22 ℃，期間可以自由飲水和進食。該批動物實驗由南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(201809A015)。

1.2 儀器與試劑

熒光定量PCR儀(Stratagene公司)，核酸蛋白測定儀(Eppendorf公司)，高速低溫離心機(Eppendorf公司)，PCR儀(Bio-RAD公司)。瘦素ELISA試劑盒(R&D公司)，Trizol試劑(Takara公司)，熒光PCR試劑盒(Takara公司)，轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)。

1.3 肥胖大鼠模型的建立

將42 只3周齡SD雄性大鼠，在動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，肥胖造模方法參考孫志等提出的高脂飼養(yǎng)，隨機挑選6只給予普通飼料，簡稱正常組；另一組36只給予高脂飼料，簡稱高脂組。造模期間每周測量體重用以觀察大鼠的造模情況。12周后，篩選出體重大于正常組15%的SD定義為肥胖鼠，成功造模18只肥胖SD鼠。將此18只肥胖鼠平均分為3組(n=6/組)：模型組、電針組、假針刺組。

1.4 電針治療

電針組：操作時，將大鼠固定在自制的固定器上，常規(guī)酒精消毒后，無菌針刺大鼠一側(cè)“足三里”和“內(nèi)庭”穴，接通電針儀，電流為2 mA，頻率2/15 Hz，留針時間每次15 min，每日治療1次，左右側(cè)輪流轉(zhuǎn)換取穴針刺，連續(xù)針刺6 d/周，休息1 d/周，治療時間為28 d。假針刺組：將針灸針貼于大鼠相應(yīng)穴位的皮膚上，然后連接電針儀，參數(shù)同電針組。正常組與模型組用同樣的方式固定15 min，不進行針刺治療。

1.5 標(biāo)本采集

針刺治療28天后，禁食12 h，眼球取血，分離血清待測，常溫低速離心20 min。處死動物，剝離項后脂肪、附睪脂肪、腎周脂肪質(zhì)量并測量濕重。斷頭開顱，迅速分離下丘腦。所取組織經(jīng)過液氮迅速冷凍后，立即轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。取出肝臟組織，稱重，切合適大小浸泡于10%的甲醛溶液中。

1.6 血清指標(biāo)測定

大鼠血清總膽固醇(TCL)與甘油三酯(TG)的含量用全自動生化儀進行檢測(南京市中醫(yī)院)，大鼠血清中瘦素水平采用ELISA方法檢測，嚴(yán)格按照大鼠瘦素ELISA試劑盒上的步驟操作。

1.7 實時定量PCR檢測

GeneBank上查找OBRb mRNA序列，并設(shè)計特異性引物，β-actin：上游為CACTATCGGCAATGAGCG，下游為AGGAGCCAGGGCAGTAATC；OBRb:上游為TCCAGGTGAGGAGCAAGAG，下游為TTCAGCGTAGCGGTGATG，上海生工公司合成。100 mg下丘腦總RNA提取按照Trizol試劑盒說明書進行。A/A≈2.0，并測定RNA濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，總RNA取0.5 μg，42 ℃15 min，85 ℃15 s，合成cDNA。根據(jù)熒光定量PCR試劑盒，反應(yīng)體系：總體系為20 μL，進行1個循環(huán)(95 ℃ 30 s)，繼而進行40個循環(huán)(95 ℃ 5 s→60 ℃ 30 s)。熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，計算基因表達的相對變化，以β-actin為內(nèi)參進行標(biāo)準(zhǔn)化，2分析。

1.8 HE染色

將浸泡固定于10%甲醛溶液中的肝臟組織取出來，進行石蠟包埋，切片，HE染色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察(40×)，并拍照記錄肝臟細胞形態(tài)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 電針治療前后體質(zhì)量的變化

治療前，與正常組相比，模型組、電針組與假針刺組大鼠的體重均明顯升高(

P

<0.01)，提示肥胖大鼠造模成功。電針治療28 d后，電針組大鼠的體重明顯低于較模型組(

P

<0.05)。假針刺組較模型組大鼠體重?zé)o明顯差異(

P

>0.05)(表1)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量的變化(n=6)

2.2 電針對肥胖大鼠不同部位脂肪量的影響

與正常組相比，模型組大鼠內(nèi)臟脂肪質(zhì)量(附睪脂肪與腎周脂肪量之和)、項后脂肪量、脂體比與項后脂體均顯著升高(

P

<0.05)。電針治療28 d后，電針組大鼠內(nèi)臟脂肪質(zhì)量、項后脂肪量、脂體比與項后脂體顯著低于模型組(

P

<0.05)。假針刺組大鼠內(nèi)臟脂肪質(zhì)量與脂體比較模型組無明顯差異(

P

>0.05)。假針刺組項后脂肪量與項后脂體明顯低于模型組(

P

<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠不同部位脂肪量的比較(n=6)

2.3 電針對肥胖大鼠TCL、TG、Leptin的影響

與正常組比較，模型組大鼠TCL、TG、Leptin含量顯著上升(

P

<0.05)。電針治療后，電針組大鼠TCL、TG、Leptin水平明顯明顯低于模型組(

P

<0.05)。假針刺組大鼠TCL、TG、Leptin水平與模型組無明顯差異(

P

>0.05)(表3)。

表3 各組大鼠的血清生化指標(biāo)的比較(n=6)

2.4 電針對肥胖大鼠下丘腦瘦素受體水平的影響

與正常組比較，模型組瘦素受體mRNA表達量顯著下降(

P

<0.01)。電針治療后，電針組瘦素受體mRNA表達量明顯高于模型組(

P

<0.05)。假針刺組大鼠瘦素受體mRNA表達量與模型組無明顯差異(

P

>0.05)(表4)。

表4 各組大鼠下丘腦瘦素受體mRNA表達量的比較(n=3)

2.5 電針對肥胖大鼠肝臟細胞形態(tài)學(xué)影響

正常組大鼠的肝臟細胞整齊排列。觀察模型組大鼠肝臟細胞，發(fā)現(xiàn)有較多的脂滴的空泡，顯明其細胞中存在較重的脂肪浸潤。電針治療后，電針組大鼠肝臟細胞較模型組大鼠脂滴空泡明顯減少，其形態(tài)與正常組接近。假電針組大鼠脂滴空泡較模型組大鼠略有減少，但與電針組大鼠明顯增加(圖1)。

圖1 各組大鼠肝臟細胞形態(tài)觀察(HE染色，40×)

3 結(jié)論與討論

相比手術(shù)減肥和藥物減肥，臨床上針刺作為中醫(yī)診療的一種常規(guī)療法被應(yīng)用于肥胖的治療，因其療效顯著、不易反彈、簡便經(jīng)濟、安全無毒副作用被廣大患者所接受。本研究通過高脂飲食喂養(yǎng)建立肥胖大鼠模型，治療采用足三里與內(nèi)廷為有效配伍穴位，此二穴都屬足陽明胃經(jīng)，二穴合用可增加傳導(dǎo)運化的作用。結(jié)果表明電針干預(yù)后肥胖大鼠的體質(zhì)量明顯降低，實現(xiàn)較好的減肥效應(yīng)。

肥胖是體內(nèi)脂肪過量堆積的狀態(tài)，脂肪分布特征與肥胖癥及其并發(fā)癥的發(fā)生關(guān)系密切，有研究表明控制肥胖的危害關(guān)鍵在于使其脂肪分布更加良性。腹型肥胖由于其內(nèi)臟脂肪堆積過量，二型糖尿病與冠心病發(fā)病率隨之增加，所以觀察脂質(zhì)蓄積的狀況是治療肥胖的重要指標(biāo)。本研究觀察電針對肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪量、血脂中TG和TCL含量、肝臟中脂滴的影響。結(jié)果表明電針治療后肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪量顯著下降，同時改善紊亂的血漿脂代謝，肝臟中異位存儲的脂滴明顯較少。電針治療之后脂質(zhì)的蓄積量明顯較少。瘦素含量反映機體內(nèi)脂肪儲存的狀況，也是衡量肥胖程度以及評價減肥療效的一項重要指標(biāo)。瘦素主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，減少能量攝入，增加能量的消耗，從而使得機體內(nèi)的脂質(zhì)量保持相對的穩(wěn)定。瘦素的效應(yīng)由其瘦素受體OB-R介導(dǎo)，其中OB-Rb在下丘腦的弓狀核廣泛分布，瘦素與其結(jié)合后改變下丘腦神經(jīng)元產(chǎn)生特定的神經(jīng)肽，從而調(diào)節(jié)機體能量的平衡。本研究表明較正常大鼠，肥胖大鼠血清中瘦素含量明顯上升，下丘腦中瘦素受體mRNA表達量明顯下降，機體中表現(xiàn)出瘦素抵抗，使瘦素不能發(fā)揮正常的生物學(xué)效應(yīng)導(dǎo)致脂質(zhì)堆積而肥胖。電針干預(yù)治療后肥胖大鼠瘦素抵抗的狀況得到明顯改善，使得瘦素降脂作用得到正常發(fā)揮，繼而肥胖大鼠的內(nèi)臟脂肪、血脂、肝臟異位脂肪堆積減少，改善其肥胖程度。

綜上所述，本研究觀察了電針治療對肥胖大鼠體重、體脂、血脂、肝臟異位脂肪堆積的影響，同時觀察了電針對血清中瘦素含量與下丘腦瘦素受體mRNA水平表達的影響。推測電針治療肥胖的機理可能與改善瘦素抵抗有關(guān)，進而減少脂質(zhì)在機體中的蓄積，為針刺減肥的臨床推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。