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    rAAV2-ND4基因玻璃體腔注射對Leber遺傳性視神經(jīng)病變的療效評價

    2021-08-23 02:30:46李欣田朕陳彰李斌張勇
    中華實驗眼科雜志 2021年8期
    關鍵詞:基因治療體腔眼壓

    李欣 田朕 陳彰 李斌,2,3 張勇

    1十堰市太和醫(yī)院眼科 湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院,十堰 442000;2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院眼科,武漢 430030;3武漢紐福斯生物科技有限公司 420200

    Leber遺傳性視神經(jīng)病變(Leber hereditary optic neuropathy,LHON)是由線粒體DNA突變所致的遺傳性眼病,常見的突變位點為11778[1],臨床表現(xiàn)為雙眼視力同時或先后急性或亞急性下降[2]。本病好發(fā)于青少年男性,是導致青少年雙眼盲的常見原因之一,很多患者在較短時間內(nèi)雙眼視力急劇降至0.1以下。目前LHON的治療方法包括口服Q10、艾地苯醌、EPI-743等[3-5],但均未獲得確切的療效。本研究團隊前期進行了一系列基礎研究,證實重組腺相關病毒2-還原型輔酶Ⅰ脫氫酶4(recombinant adeno associated virus 2-NADH dehydrogenase 4,rAAV2-ND4)能夠正常表達于線粒體或注射后進入細胞的線粒體內(nèi)[6],驗證了rAAV2-ND4玻璃體腔內(nèi)注射的安全性和有效性,確定了注射劑量[7]。在完成前期基礎研究后,本研究團隊于2011—2012年對9例LHON患者進行了首次基因治療臨床試驗,隨訪36個月發(fā)現(xiàn)6例患者視力顯著提高,未見嚴重并發(fā)癥發(fā)生[8-9],初步證實了基因治療LHON的安全性和有效性。此后,法國和美國的研究團隊也分別進行了基因治療LHON的臨床試驗,但均出現(xiàn)較嚴重的眼部并發(fā)癥[10-11]。為了進一步擴大樣本量以證實基因治療藥物的安全性和有效性,本團隊開展第2次基因治療LHON的臨床試驗,以期為rAAV2-ND4玻璃體腔內(nèi)注射治療LHON提供方法學和臨床療效評價依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    采用多中心前瞻性非隨機對照臨床試驗研究設計,研究團隊由十堰市太和醫(yī)院、華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院、武漢大學附屬鄂州市中心醫(yī)院以及阿根廷布宜諾斯艾利斯的佩德羅·拉格萊澤眼科醫(yī)院臨床醫(yī)生組成,并于2017年12月至2018年2月在十堰市太和醫(yī)院眼科中心招募線粒體DNA 11778位點突變的LHON患者40例。選擇視力較差眼或右眼(雙眼視力相等時)行rAAV2-ND4玻璃體腔內(nèi)注射作為注射眼組,對側(cè)眼作為未注射眼組,每組40眼。LHON診斷標準:(1)急性或亞急性起病,無痛性視力下降;(2)單眼發(fā)病或雙眼相繼發(fā)病;(3)視覺誘發(fā)電位提示P100波潛伏期延長、振幅降低;(4)中心視野缺失或色覺障礙;(5)早期視盤正?;蜉p度充血、水腫,視盤旁局部微血管擴張,無出血、滲出,晚期視盤顳側(cè)蒼白;(6)基因測序結(jié)果符合LHON診斷。納入標準:(1)符合LHON診斷標準,并且通過基因測序確定為11778位點突變,近3個月未經(jīng)其他治療,且視力未提高;(2)年齡12~65歲,病程>6個月且視力穩(wěn)定;(3)同意治療期間不使用其他針對此疾病的藥物或治療方法。排除標準:(1)合并有糖尿病等慢性疾病,嚴重的心血管、腦血管、肝臟、腎臟等原發(fā)病,其他全身神經(jīng)性疾病者,心臟病手術后恢復期患者,有精神障礙的患者,腫瘤患者;(2)合并有青光眼等其他影響視力的眼部疾病患者;(3)近3個月內(nèi)參加其他臨床研究的患者;(4)酗酒、吸煙、吸毒或有藥物濫用史、有毒物質(zhì)接觸史者;(5)孕婦、哺乳期婦女或12個月內(nèi)有計劃懷孕者;(6)術前免疫實驗檢查結(jié)果明顯異常者,如AAV2體液免疫反應陽性、CD3/CD8異常等。40例患者均雙眼發(fā)病,其中男33例,女7例;病程為7~312個月,平均(41.30±56.08)個月;年齡為12~42歲,平均(20.30±6.39)歲;注射眼和未注射眼平均最佳矯正視力(best corrected visual acuity,BCVA)分別為(1.83±0.47)LogMAR和(1.75±0.46)LogMAR,差異無統(tǒng)計學意義(t=0.813,P=0.419);注射眼組和未注射眼組平均基線眼壓分別為(17.63±2.56)mmHg和(17.88±2.64)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),差異無統(tǒng)計學意義(t=0.430,P=0.669)。本研究遵循《赫爾辛基宣言》,研究方案獲得十堰市太和醫(yī)院倫理委員會批準(批文號:201807)。在充分告知研究內(nèi)容及手術風險后,所有患者和監(jiān)護人均自愿簽署知情同意書。

    1.2 方法

    1.2.1手術方法 手術在手術室進行,患者取平臥位,術眼用鹽酸丙美卡因滴眼液點眼3次;常規(guī)消毒鋪巾,做好面部及眼部消毒;術眼用開瞼器開瞼,體積分數(shù)0.5%聚維酮碘消毒液沖洗結(jié)膜囊,10 s后用質(zhì)量分數(shù)0.9%氯化鈉溶液沖洗,洗凈消毒液;用1 ml注射器吸取0.05 ml rAAV2-ND4(1×1010vg)(武漢紐福斯生物科技有限公司),沿注射眼順時針7:00~8:00位角膜緣后4 mm處進針,緩慢推注藥物,拔出針頭后無菌棉簽按壓注射點2 min;術眼涂抗生素眼膏并包蓋,患者平臥30 min后返回病房。手術操作均由同一高年資醫(yī)師進行。

    1.2.2隨訪及評價指標 術后1、3、6、12個月定期檢查視力、眼壓、眼前節(jié)及眼底等。評估患者治療的有效率,定義為末次隨訪時視力提高≥0.3 LogMAR。主要終點指標為視力變化,由同一醫(yī)生采用兩用對數(shù)視力表(溫州星康醫(yī)學科技有限公司)檢查視力,并轉(zhuǎn)換成LogMAR視力;采用Full Auto Tonometer(日本Canon公司)噴氣式非接觸眼壓計測量眼壓3次,取平均值;采用裂隙燈顯微鏡檢查眼前節(jié)情況;采用CR-2免擴瞳眼底照相機(日本Canon公司)檢查眼底。

    1.3 統(tǒng)計學方法

    采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗證實接近正態(tài)分布,以mean±SD表示;計數(shù)資料以頻數(shù)及百分率表示。注射眼組和未注射眼組基因治療前后BCVA和眼壓總體比較均采用重復測量兩因素方差分析,多重比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 患者治療有效率

    治療后,注射眼組視力提高6眼,未注射眼組視力提高4眼,雙眼視力同時提高13例。40例患者中23例患者視力提高≥0.3 LogMAR,有效率為57.5%。

    2.2 各組術眼治療前后BCVA比較

    2個組BCVA總體比較差異無統(tǒng)計學意義(F組別=0.084,P=0.772),治療前后BCVA總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F時間=34.109,P<0.01);治療后12個月2個組BCVA均較治療前提高,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)(表1)。

    表1 2個組治療前和治療后12個月BCVA比較(mesn±SD,LogMAR)Table 1 Comparison of BCVA between the two groups before and after 12-month treatment (mesn±SD,LogMAR)組別眼數(shù)治療前后BCVA治療前治療后12個月未注射眼組401.75±0.461.51±0.62a注射眼組401.83±0.471.62±0.58a 注:F組別=0.084,P=0.772;F時間=34.109,P<0.01.與治療前比較,aP<0.01(重復測量兩因素方差分析,LSD-t檢驗) BCVA:最佳矯正視力 Note:Fgroup=0.084,P=0.772;Ftime=34.109,P<0.01.Compared with pre-treatment,aP<0.01 (Repeated measurement two-way ANOVA,LSD-t test) BCVA:best corrected visual acuity

    2.3 各組術眼治療前后眼壓比較

    2個組術眼治療前后眼壓總體比較差異均無統(tǒng)計學意義(F組別=0.557,P=0.575;F時間=2.314,P=0.106)(表2)。

    表2 2個組治療前后眼壓比較(mesn±SD,mmHg)Table 2 Comparison of intraocular pressure between the two groups before and after treatment (mesn±SD,mmHg)組別眼數(shù)治療前后不同時間點眼壓治療前治療后1個月治療后12個月未注射眼組4017.88±2.6418.25±2.2317.93±2.46注射眼組4017.63±2.5618.55±3.1417.85±2.51 注:F組別=0.557,P=0.575;F時間=2.314,P=0.106(重復測量兩因素方差分析) 1mmHg=0.133kPa Note:Fgroup=0.557,P=0.575;Ftime=2.314,P=0.106 (Repeated measurement two-way ANOVA) 1mmHg=0.133kPa

    2.4 注射眼并發(fā)癥發(fā)生情況

    隨訪期內(nèi),所有患者rAAV2-ND4玻璃體腔內(nèi)注射后均無結(jié)膜炎、角膜炎、前房炎癥、玻璃體炎癥及視網(wǎng)膜脫離出現(xiàn)。2眼注射治療后眼壓偏高,約為26 mmHg,使用鹽酸卡替洛爾滴眼液點眼,每日2次,眼壓恢復至正常。

    3 討論

    2007年,美國和英國3個研究小組針對Leber先天性黑矇成功開展了基因治療臨床試驗[12-13],開啟了眼部疾病的基因治療時代。LHON的發(fā)生是由于11778位點突變造成呼吸鏈上ND4基因編碼的第340位氨基酸由精氨酸變?yōu)榻M氨酸所致,導致ND4蛋白功能異常?;蛑委熅褪前盐赐蛔兊腘D4基因轉(zhuǎn)染到患者病變部位的細胞,編碼正常的ND4蛋白,替代患者體內(nèi)突變的ND4蛋白的功能。基因治療是目前治療LHON最有前景的方法,其安全性是首先要保證的問題。由于玻璃體腔內(nèi)注射AAV2載體會誘發(fā)機體的免疫排斥反應,從而影響藥物效果,本課題組在前期動物實驗階段確定了AAV2引起機體免疫反應的時間和峰值及用藥方案[14],從而降低了機體免疫排斥發(fā)生的風險。法國GenSight Biologics公司和美國Guy教授研究團隊用AAV2作為載體對LHON患者進行基因治療后,均出現(xiàn)不同程度的玻璃體炎癥或葡萄膜炎[10-11]。此后法國GenSight Biologics公司證實了眼內(nèi)炎癥反應與AAV2載體有關,并提出預防性系統(tǒng)地使用糖皮質(zhì)激素可以減輕炎癥反應[15]。本研究中所有患者基因治療前1周和治療后4周均應用糖皮質(zhì)激素,以減少免疫排斥反應的發(fā)生機會,術中及術后隨訪期內(nèi)均未發(fā)生任何嚴重并發(fā)癥,證實了基因治療的安全性。

    2011—2012年,本研究團隊首次使用rAAV2-ND4治療9例LHON患者并隨訪7年,有6例患者視力顯著提高(視力提高≥0.3 LogMAR),有效率超過60%[16]。本研究結(jié)果顯示,rAAV2-ND4玻璃體腔內(nèi)注射后有效率達57.5%,與前期研究結(jié)果一致,進一步證實了LHON基因治療的有效性。此外,值得注意的是,2次基因治療結(jié)果顯示,不僅注射眼視力較基線提高,未注射眼視力也出現(xiàn)不同程度的提高。Yu-Wai-Man等[17]對37例m.11778G突變的LHON患者注射眼采用隨機分配原則,選擇1眼進行rAAV2/2-ND4治療,在96周的隨訪期間觀察到雙眼視力的持續(xù)改善,結(jié)果顯示在第96周,68%(25/37)的受試者至少有1眼的BCVA較基線水平有臨床相關的恢復,78%(29/37)的受試者雙眼視力改善,表明單眼基因治療可以明顯改善雙眼視力。造成這種雙眼視力提高的機制仍不完全明確。一項非人靈長類動物的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),病毒載體DNA可從注射眼轉(zhuǎn)移到對側(cè)未注射眼的前節(jié)、視網(wǎng)膜和視神經(jīng)(https://www.gensight-biologics.com)。此外,Yang等[18]將熒光金注射到鼠一側(cè)眼的玻璃體腔內(nèi),2周后可見熒光金上行到對側(cè)視交叉,經(jīng)過視交叉后,部分進入對側(cè)眼的視神經(jīng),這為藥物單眼注射后雙眼視覺功能改善提供了一個合理的解釋,但物質(zhì)轉(zhuǎn)移是通過軸漿運輸、軸突再生或其他方式仍不清楚,需要進一步探索。

    本研究的優(yōu)勢在于國內(nèi)缺少基因治療臨床實踐的相關報道,僅限于對外文文獻的參考和總結(jié),本研究為我國LHON的基因治療提供了臨床依據(jù)。因本研究未設置正常對照組,而且單眼基因治療改變的是雙眼視功能,故未進行玻璃體腔內(nèi)注射rAAV2-ND4治療的眼不能作為對照組。因此,40例患者80眼均以基因治療前后的視力變化進行對比分析。本研究的不足之處在于未設置自然病程作為對照組,同時缺少自然病程患者分析。本研究未進行視力提高與未提高患者的相關性影響因素分析,未納入視野、視神經(jīng)纖維層厚度和視覺誘發(fā)電位等客觀檢測指標。

    本研究結(jié)果表明,玻璃體腔內(nèi)注射rAAV2-ND4治療LHON是安全、有效的,研究結(jié)果為未來LHON基因治療走向臨床提供了理論依據(jù)。本研究團隊將繼續(xù)對40例患者進行長期跟蹤隨訪,觀察患者全身情況,并結(jié)合視野、視神經(jīng)纖維層厚度和視覺誘發(fā)電位等客觀檢查資料評價基因治療后患者視功能的改善情況,探討基因治療LHON的遠期安全性和有效性。

    利益沖突李斌教授為武漢紐福斯生物科技有限公司董事長,是基因藥物rAAV2/2-ND4的發(fā)明者;本研究所用基因藥物來自武漢紐福斯生物科技有限公司;本研究承擔單位為公立三級甲等醫(yī)院,所有數(shù)據(jù)均為客觀檢查獲得,研究結(jié)果不會受到影響;其余作者均聲明不存在利益沖突

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