兩個(gè)漢族家族性玻璃體淀粉樣變性家系突變基因檢測(cè)及臨床表型分析

鄭巍 李海波 張雪詠 周學(xué)智 陳媛媛 毛俊峰

中南大學(xué)湘雅醫(yī)院眼科，長(zhǎng)沙 410008

家族性玻璃體淀粉樣變性(familial vitreous amyloidosis，F(xiàn)VA)是一種罕見(jiàn)的常染色體顯性遺傳疾病，因淀粉樣物質(zhì)在玻璃體內(nèi)的沉積而致病，可獨(dú)立發(fā)病，也可同時(shí)累及全身多個(gè)器官和組織[1]，其發(fā)病與轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin，TTR)基因突變密切相關(guān)。TTR主要由肝臟(約占90%)、脈絡(luò)叢及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞合成，目前已報(bào)道的TTR基因致病性突變有100多種，存在一定的種族及地域差異性[2-4]。本研究收集并分析2個(gè)FVA家系的臨床資料，以進(jìn)一步探討我國(guó)漢族人群玻璃體淀粉樣變性的臨床特征及基因突變位點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用家系調(diào)查研究，收集2015年1月至2018年12月于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院就診的2個(gè)漢族玻璃體淀粉樣變性家系。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批文號(hào)：201412463)。所有受檢者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1全身及眼部檢查 詳細(xì)記錄2個(gè)家系所有成員的病史和家族史，并進(jìn)行全身體格檢查、心電圖、胸部正側(cè)位片和眼部檢查(包括視力、裂隙燈顯微鏡、眼底、眼壓、眼部B型超聲檢查)。

1.2.2基因測(cè)序 采集家系1(湖南株洲，MZ001)中15例患者(男9例，女6例)、家系2(湖南常德，MZ002)中7例患者(男2例，女5例，I2未納入)以及家系1、家系2中各5名無(wú)臨床癥狀者外周靜脈全血各5 ml，經(jīng)乙二胺四乙酸抗凝，采用酚/氯仿法抽提gDNA。采用PCR試劑盒(上海生工生物技術(shù)有限公司)在ABI-2720 PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)上擴(kuò)增TTR基因的4個(gè)外顯子片段。gDNA參考序列版本為GRCh38/hg38(2013年12月發(fā)布)，引物設(shè)計(jì)與合成均由上海生工生物技術(shù)有限公司完成，4個(gè)外顯子的PCR引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司在ABI-3730XL型測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用SeqMan軟件和Chromas軟件進(jìn)行分析，并將測(cè)序結(jié)果與野生型TTR基因完整序列的4個(gè)外顯子進(jìn)行比對(duì)。

表1 TTR基因外顯子1、2、3、4的檢測(cè)引物Table 1 Primers of TTR gene exons 1,2,3 and 4引物名稱引物序列(5’-3’)產(chǎn)物大小(bp)外顯子1正向:AACGAATGTTCCGATGCTCT354反向:GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC外顯子2正向:CGTTCCTGATAATGGGATCA320反向:CTACCAAGTGAGGGGCAAAC外顯子3正向:GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT272反向:GCCAAAAGCAAAAACCAAAA外顯子4-1正向:TCTAAGGACTGTGCATGGTTCC504反向:TTTGGAAGGGACAATAAGGGAA外顯子4-2正向:GACGAGGGATGGGATTTCATGT483反向:TACACCACTGCATTCTAGCCTG 注:TTR:轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白 Note:TTR:transthyretin

1.2.3玻璃體切割手術(shù) MZ001家系先證者Ⅲ13和MZ002家系先證者Ⅱ11均因玻璃體嚴(yán)重混濁行經(jīng)睫狀體平坦部23G玻璃體切割手術(shù)聯(lián)合白內(nèi)障超聲乳化摘出聯(lián)合人工晶狀體植入術(shù)。行三通道玻璃體切割，術(shù)中人工誘導(dǎo)玻璃體后脫離，注入少量曲安奈德對(duì)玻璃體進(jìn)行染色，頂壓鞏膜盡量切割周邊部玻璃體，并仔細(xì)檢查，未見(jiàn)視網(wǎng)膜裂孔，術(shù)中取玻璃體標(biāo)本后送組織病理學(xué)檢查，術(shù)畢灌注液填充玻璃體腔。

1.2.4玻璃體標(biāo)本的組織病理學(xué)檢查 術(shù)中開(kāi)放氣體灌注維持眼壓，從玻璃體切割管道中直接抽取病變玻璃體進(jìn)行鋪片、脫水固定。切片浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%剛果紅染液15 min，水洗后光學(xué)顯微鏡下觀察，淀粉樣變性組織呈紅色陽(yáng)性反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 2個(gè)FVA家系成員的臨床特征

2個(gè)家系均符合常染色體顯性遺傳。MZ001家系4代共63名家系成員，其中男29人，女34人；FVA患者15例，均為雙眼發(fā)病，發(fā)病率為23.8%，發(fā)病年齡為36～51歲，平均(43.6±5.8)歲。MZ002家系4代共49人，其中男23人，女26人；FVA患者共7例，均雙眼發(fā)病，發(fā)病率為14.3%，發(fā)病年齡為43～59歲，平均(50.4±5.5)歲(圖1)。

圖1 2個(gè)FVA家系圖 A：MZ001家系 B：MZ002家系 □：健康男性；○：健康女性；■：男性患者；●：女性患者；/：已故；：先證者Figure 1 Pedigree map of MZ001 and MZ002 A:MZ001 pedigree B:MZ002 pedigree □:healthy male；○:healthy female；■:male patient；●:female patient;/:deceased；:the proband

2個(gè)家系的FVA患者具有相似的眼部臨床表現(xiàn)，雙眼同時(shí)或先后發(fā)病，結(jié)膜、角膜、前房未見(jiàn)淀粉樣物質(zhì)沉積，房角鏡檢查各方向房角開(kāi)放。晶狀體后囊可見(jiàn)玻璃體混濁物黏附，呈足盤樣。玻璃體內(nèi)可見(jiàn)大量白色顆粒樣混濁物，飄動(dòng)如棉紗樣，玻璃體混濁的嚴(yán)重程度隨發(fā)病時(shí)間延長(zhǎng)而加重，嚴(yán)重者眼底結(jié)構(gòu)模糊不清。B型超聲檢查顯示玻璃體中度混濁，MZ001家系先證者Ⅲ13無(wú)玻璃體后脫離，MZ002家系先證者Ⅱ11伴有扁平狀玻璃體后脫離(圖2，3)。

MZ001家系中患者均未發(fā)現(xiàn)伴有神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、腎臟、肝臟等全身其他器官系統(tǒng)疾病。MZ002家系中，有3例患者出現(xiàn)不同程度的手足麻木癥狀，無(wú)腹瀉、高血壓或頭暈等。MZ002家系Ⅱ3患者因雙眼玻璃體混濁曾先后2次在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院行玻璃體切割術(shù)，該患者去世時(shí)有四肢麻木、嚴(yán)重的肌力下降和肌肉萎縮癥狀。

2.2 FVA患者的術(shù)中、術(shù)后臨床表現(xiàn)和特征

MZ001家系Ⅲ13患者術(shù)中發(fā)現(xiàn)玻璃體混濁黏稠、致密，誘導(dǎo)玻璃體后脫離較困難，在赤道部附近，玻璃體與視網(wǎng)膜粘連緊密，玻璃體難以切割干凈。MZ002家系Ⅱ11患者玻璃體混濁較松軟，術(shù)中易于誘導(dǎo)完全的玻璃體后脫離，并可將周邊玻璃體混濁徹底清除。玻璃體組織鋪片剛果紅染色結(jié)果顯示,淀粉樣物質(zhì)呈紅色陽(yáng)性反應(yīng)(圖2，3)。

MZ001家系Ⅲ13患者術(shù)前眼壓為15 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，術(shù)后6個(gè)月眼壓升高至30 mmHg，診斷為開(kāi)角型青光眼，酒石酸溴莫尼定滴眼液點(diǎn)眼后眼壓可控制在正常范圍，術(shù)后1年復(fù)查發(fā)現(xiàn)玻璃體內(nèi)再次出現(xiàn)白色顆粒樣混濁。MZ002家系Ⅱ11患者術(shù)前眼壓為16 mmHg，術(shù)后眼壓為13 mmHg，隨訪2年未見(jiàn)眼壓升高及玻璃體混濁復(fù)發(fā)。

2.3 2個(gè)FVA家系成員TTR基因序列變化

在MZ001家系的所有患者中，TTR基因第3外顯子第83位氨基酸發(fā)生突變，cDNA307位的G峰下方出現(xiàn)1個(gè)C堿基套峰，野生型無(wú)此套峰，相應(yīng)的密碼子由GGC突變?yōu)镃GC(圖2)，即由甘氨酸突變?yōu)榫彼?Gly83Arg)。

圖2 MZ001家系先證者Ⅲ13眼部臨床表現(xiàn)及基因測(cè)序結(jié)果 A：裂隙燈顯微鏡照相可見(jiàn)足盤樣玻璃體混濁黏附于晶狀體后囊 B：眼底照相可見(jiàn)玻璃體大量混濁物如棉紗樣 C：B型超聲檢查示玻璃體中度混濁，無(wú)玻璃體后脫離 D：玻璃體切割術(shù)中可見(jiàn)后極部覆蓋曲安奈德染色的玻璃體 E：玻璃體組織病理學(xué)檢查可見(jiàn)玻璃體組織淀粉樣物質(zhì)呈紅色陽(yáng)性反應(yīng)(剛果紅，標(biāo)尺=200 μm) F：基因測(cè)序結(jié)果顯示TTR基因第83位氨基酸出現(xiàn)雜合突變，由GGC突變?yōu)镃GC(箭頭)，由甘氨酸突變?yōu)榫彼?Gly83Arg)Figure 2 Ocular clinical manifestations and gene sequencing of proband Ⅲ13 in MZ001 family A:The pedal disc shaped deposits were attached to the posterior lens capsule by slit lamp microscopy B:Cotton wool-like deposits in the vitreous observed by fundus photography C:Moderate vitreous opacity with no posterior detachment was found by B-ultrasound D:During vitrectomy，the posterior pole of fundus was covered with triamcinolone stained vitreous E:The vitreous tissue collected during vitrectomy was with positive Congo red staining by histopathological examination (Congo red，bar=200 μm) F:Gene sequencing results of TTR showed a G to C transversion (arrow) resulting in the replacement of glycine-83 with arginine (Gly83Arg)

在MZ002家系的所有患者中，TTR基因第2外顯子第36位氨基酸發(fā)生突變，cDNA166位的G峰出現(xiàn)1個(gè)C堿基套峰，野生型無(wú)此套峰，相應(yīng)的密碼子由GCT突變?yōu)镃CT(圖3)，即由丙氨酸突變?yōu)楦彼?Ala36Pro)。

圖3 MZ002家系先證者Ⅱ11眼部臨床表現(xiàn)及基因測(cè)序結(jié)果 A：裂隙燈顯微鏡照相示晶狀體后囊白色足盤樣混濁物附著 B：眼底照相可見(jiàn)玻璃體混濁呈棉紗樣，眼底窺不清 C：B型超聲檢查可見(jiàn)玻璃體中度混濁，伴部分玻璃體后脫離 D：玻璃體切割術(shù)中可見(jiàn)容易誘導(dǎo)玻璃體后脫離，周邊玻璃體松軟 E：玻璃體組織病理學(xué)檢查可見(jiàn)淀粉樣物質(zhì)呈紅色陽(yáng)性反應(yīng)(剛果紅，標(biāo)尺=200 μm) F：基因測(cè)序結(jié)果顯示TTR基因第36位氨基酸出現(xiàn)雜合突變，由GCT突變?yōu)镃CT(箭頭)，由丙氨酸突變?yōu)楦彼?Ala36Pro)Figure 3 Ocular clinical manifestations and gene sequencing of the proband Ⅱ11 in MZ002 family A:The pedal disc shaped deposits were attached to the posterior lens capsule by slit lamp microscopy B:Cotton wool-like deposits in the vitreous were found by fundus photography，which lead to the blurred fundus C:Moderate vitreous opacity with no posterior detachment was found by B-ultrasound D:During vitrectomy，it was easy to induce the vitreous detachment，and the peripheral vitreous was loose E:The vitreous tissue collected during vitrectomy was with positive Congo red staining by histopathological examination (Congo red，bar=200 μm) F:Gene sequencing results of TTR showed a G to C transversion (arrow) resulting in the replacement of alanine-36 with proline (Ala36Pro)

3 討論

FVA是一種臨床罕見(jiàn)的常染色體顯性遺傳性疾病，其發(fā)病與TTR基因突變密切相關(guān)，本研究中納入的2個(gè)家系有著不同基因突變位點(diǎn)，呈現(xiàn)出不同的臨床特征。MZ001家系較MZ002家系發(fā)病早，玻璃體混濁癥狀更重，其先證者周邊部玻璃體皮質(zhì)黏稠致密，術(shù)中切割時(shí)需謹(jǐn)慎操作，避免發(fā)生醫(yī)源性視網(wǎng)膜裂孔；MZ002家系先證者的玻璃體松軟，容易誘導(dǎo)玻璃體后脫離，周邊的混濁玻璃體較易切凈。MZ001家系患者均不合并全身其他系統(tǒng)異常癥狀；MZ002家系中有3例患者有不同程度的手足麻木感，Ⅱ3還出現(xiàn)了嚴(yán)重的肌力下降合并肌肉萎縮癥狀，提示可能有淀粉樣物質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)沉積。

FVA可單獨(dú)發(fā)病，也可表現(xiàn)為家族性淀粉樣變性多發(fā)神經(jīng)病變(familial amyloid polyneuropathy，F(xiàn)AP)的眼部受累。FAP是一組常染色體顯性遺傳疾病，由淀粉樣纖維在各組織器官沉積引起，可累及全身多個(gè)系統(tǒng)，甚至危及生命[5]。淀粉樣物質(zhì)在玻璃體的沉積可以是孤立發(fā)病，也可伴隨全身多系統(tǒng)受累，在目前已知的7種可導(dǎo)致FVA發(fā)生的突變基因中，以TTR基因突變最為常見(jiàn)。以往文獻(xiàn)報(bào)道中，Val30Met是全球范圍內(nèi)TTR最常見(jiàn)的突變[6]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)也有一些與FAP有關(guān)TTR基因突變的報(bào)道，如Lys35Thr、Gly83Arg、Ala36Pro、Ala97Ser、Tyr114Cys等[3,7-15]。本研究中對(duì)2個(gè)漢族FVA家系患者的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)家系盡管均是TTR基因突變，但突變位點(diǎn)并不相同，分別是c.307G>C和c.166G>C，推測(cè)其可能是導(dǎo)致2個(gè)家系臨床表現(xiàn)存在差異的根本原因，這2個(gè)突變位點(diǎn)導(dǎo)致臨床表型不同的具體原因還有待進(jìn)一步研究。目前，Gly83Arg突變僅在國(guó)內(nèi)漢族家系中有發(fā)現(xiàn)，在國(guó)外其他種族中尚未見(jiàn)報(bào)道，該突變引起的FAP癥狀不同于其他突變，往往以眼部癥狀先發(fā)，且全身其他系統(tǒng)癥狀出現(xiàn)晚、癥狀輕，甚至不出現(xiàn)，本研究中MZ001家系FVA患者僅出現(xiàn)雙眼玻璃體混濁。也有研究表明，在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中Gly83Arg突變導(dǎo)致玻璃體淀粉樣物質(zhì)沉積是其唯一癥狀[16]。因此，本研究推測(cè)Gly83Arg可能是我國(guó)漢族人群玻璃體淀粉樣變性特有的突變。

玻璃體切割術(shù)是治療FVA最直接和有效的方式，但術(shù)后仍有可能復(fù)發(fā)[17-18]，術(shù)后應(yīng)特別注意繼發(fā)性青光眼的監(jiān)測(cè)。MZ001家系Ⅲ13術(shù)后出現(xiàn)了開(kāi)角型青光眼癥狀，而MZ002家系Ⅱ11術(shù)后并無(wú)眼壓升高。青光眼的發(fā)生一般與淀粉樣物質(zhì)在小梁網(wǎng)沉積進(jìn)而阻滯房水排出有關(guān)[19]。此外，MZ002家系中Ⅳ7也檢測(cè)到攜帶TTR基因Ala36Pro突變，因年齡較小目前尚未發(fā)病，有待進(jìn)一步的隨訪觀察。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示FVA可能與TTR基因的Gly83Arg或Ala36Pro突變有關(guān)，二者引起的臨床表型有所不同，其中Gly83Arg突變的患者玻璃體混濁更嚴(yán)重，發(fā)病年齡更早，不伴有全身其他器官系統(tǒng)受累，術(shù)后可伴發(fā)青光眼；而Ala36Pro突變的患者多伴有四肢麻木、肌力下降等全身癥狀，雙眼可先后發(fā)病，雙眼玻璃體混濁程度不一致，術(shù)后未伴發(fā)青光眼。本研究著重對(duì)2種突變引起FVA患者的臨床表型進(jìn)行了分析和對(duì)比，對(duì)2種突變?cè)诓Ａw切割手術(shù)難易度、繼發(fā)青光眼、全身伴隨癥狀等方面進(jìn)行了闡述，突變位點(diǎn)的致病性仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突