磐龍玉及磐龍墨玉的礦物元素分析及磐龍墨玉提取物腫瘤細(xì)胞毒活性初探

王 力 劉夢璠＃ 鄭昌武* 席志超* 張 彤

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海201203； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心，上海201203）

礦物藥在我國應(yīng)用歷史悠久，迄今為止各種典籍中有記載的礦物類藥材已多達(dá)370 余種［1］，是我國中醫(yī)藥寶庫中重要的組成部分之一?！渡胶＝?jīng)》 是最早記載礦物藥的著作，其中記載了60 余種礦物類藥材［2］；2020年版《中國藥典》 中，收錄23種礦物藥［3］。

玉石是一類天然礦物藥?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》 中將玉石分為上下兩部，最早記載了玉石的藥用價值為“玉是陽精之純者，食之以御水氣?！薄侗静萁?jīng)集注》 將玉石分為上中下三品，記載玉屑，味甘性平、無毒，主除胃中惹、喘息、煩滿，止渴［4］。磐龍玉因產(chǎn)自吉林省磐石市龍崗山脈而得名，根據(jù)顏色和質(zhì)地的不同，該玉石又可進(jìn)一步分為“磐龍墨玉”“磐龍玉”［5］。目前已有專業(yè)的地質(zhì)研究人員對其礦物學(xué)特征、結(jié)構(gòu)特征、礦物成分、化學(xué)成分、地質(zhì)成因等做了較為詳盡的考察。磐龍玉含有多種礦物質(zhì)，如云母，石英，綠泥石及方解石等［6］。這些礦物組成很早被祖國的古醫(yī)籍收錄，積累了大量的醫(yī)療實踐經(jīng)驗?！侗静菥V目》中記載，云母石有安神鎮(zhèn)驚、納氣墜痰、止血斂瘡功效?？捎糜谥委熜募隆⑹?、眩暈、癲癇、虛喘、寒瘧、久痢、金創(chuàng)出血、癰疽瘡毒、濕疹。而白石英有溫肺腎、安心神、利小便的功效?？芍畏魏却?、陽痿、消渴、心神不安、驚悸善忘、小便不利、黃疸、石水、風(fēng)寒濕痹等癥［7］。《證類本草》 中描述紫石英有鎮(zhèn)心、安神、降逆氣、暖子宮功效?？捎糜谛募?、怔忡、驚癇、肺寒咳逆上氣、女子宮寒不孕［8］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明雄黃、膽礬、硝石等礦物藥對腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用［9?11］。研究還表明云母石還可通過抑制NF?κB 活性，下調(diào)炎癥因子TNF?α 表達(dá)和提高修復(fù)因子EGF 水平等通路，起到抑制結(jié)腸炎的作用［12?14］。因此對磐龍（墨）玉的元素成分以及初步的腫瘤細(xì)胞毒活性研究有助于了解該類礦物的藥用價值。

本研究采用微波消解?電感耦合等離子體質(zhì)譜法對磐龍玉及磐龍墨中的微量元素進(jìn)行含量測定［15?17］。通過MTT 法測定磐龍墨玉乙醇、甲醇和水提取物的細(xì)胞毒活性［18?19］，以期探討磐龍玉的潛在藥用價值。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 7700X 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司）；全能型微波化學(xué)工作平臺（上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司）；梅特勒ME204／02分析天平（瑞士梅特勒公司）；G?400 智能溫控電加熱器（上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司）；Master?S30UV 純水儀（上海和泰儀器有限公司）；光學(xué)倒置顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國PerkinElmer 公司）。

1.2 試劑與藥物 混標(biāo)試劑標(biāo)準(zhǔn)品（包含41種元素，國家有色金屬及電子材料分析測試中心，國標(biāo)（北京）檢驗認(rèn)證有限公司聯(lián)合研制）。超純水、硝酸、鹽酸、氫氟酸等。RPMI?1640、DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；胎牛血清（以色列Biological Industries 公司）；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，美國Sigma 公司）；DMSO（美國Sigma 公司）。人胰腺癌細(xì)胞MIA PaCa?2、人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人肝癌細(xì)胞Hep G2、人肺癌細(xì)胞A549、人乳腺癌細(xì)胞MDA?MB?231、小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10、人黑色素瘤細(xì)胞A375、人食管癌細(xì)胞Eca109 購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，人前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC?3 購自美國ATCC細(xì)胞庫。磐龍墨玉樣品1～4號，磐龍玉樣品5～12號，均采自吉林省磐石市龍崗山脈（吉林省三河礦業(yè)開發(fā)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 元素分析

2.1.1 樣品消解 取樣品0.1～0.3 g，加入聚四氟乙烯消解罐中；向聚四氟乙烯的消解罐中加入6 mL 硝酸，3 mL鹽酸，2 mL 氫氟酸，將消解罐置于消解支架上，放入微波消解儀中，消解程序見表1。

表1 消解程序

確認(rèn)消解罐中樣品已全部消解完畢；冷卻至室溫，取出加入1 mL 高氯酸，將消解罐轉(zhuǎn)移到智能溫控電加熱器，進(jìn)行趕酸處理，趕酸溫度150 ℃；待消解罐中液體剩余1 mL左右，移出消解罐，室溫冷卻；待消解罐冷卻后，將剩余液體轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，并用超純水清洗消解罐3～4 次，清洗液轉(zhuǎn)移至量瓶中，用超純水定容待測。

2.1.2 樣品元素分析儀器參數(shù) 儀器工作之前，進(jìn)行自動調(diào)諧、質(zhì)量校正、檢測器校正等設(shè)定工作參數(shù)，以靈敏度、背景、穩(wěn)定性等各項指標(biāo)對儀器的工作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，保證儀器獲得最佳的靈敏度和精確的質(zhì)量準(zhǔn)確度。等離子體質(zhì)譜中的干擾可分為2 大類：“質(zhì)譜干擾”和“非質(zhì)譜干擾”或稱“基體效應(yīng)”。質(zhì)譜干擾又可分為雙電荷離子干擾；同量異位素重疊干擾；多原子離子干擾；難熔氧化物干擾等。ICP?MS 自動調(diào)諧的工作參數(shù)和分析過程的工作參數(shù)見表2～3。自動調(diào)諧過程能夠在一定程度上消除上述干擾。

表2 ICP?MS 調(diào)諧主要工作參數(shù)

表3 ICP?MS 主要工作參數(shù)

2.1.3 檢測結(jié)果 本次檢測總計12 批樣品，編號1～4 為磐龍墨玉，編號5～12 為磐龍玉，來源于不同礦井或同一礦井的不同深度。結(jié)果見表4。

表4 各元素ICP?MS 檢測結(jié)果（mg／kg）

檢測結(jié)果表明磐龍玉和“磐龍墨玉”樣品中含有多種礦物元素，與云母、石英、綠泥石的元素成分基本相同。為便于比較分析，本實驗把磐龍玉、磐龍墨玉所含元素數(shù)量值計算平均值，結(jié)果見表5。

表5 樣品中各元素平均含量（mg／kg）

表5 顯示，4 份磐龍墨玉樣品中含有Li、As、B、Ba、Cr、Se、Cu、Mo、Ni、P、Pb、Cd、Sn、Sr、V、Zn、Zr 元素，其中一份磐龍墨玉中檢測出少量的 Hg 元素（0.03 mg／kg），磐龍墨玉中元素平均含量由高到低依次是Ba、P、B、Pb、Zr、Zn、V、Sr、Cr、Ni、Mo、As、Sn、Li、Cu、Se、Cd、Hg。8 份磐龍玉樣品中含有As、B、Ba、Cr、Se、Cu、Mo、Ni、P、Pb、Cd、Sn、Sr、V、Zn、Zr 元素，其中一份樣品的Sn 元素（1.97×103mg／kg）含量遠(yuǎn)高于其他樣品。磐龍玉中元素平均含量由高到低依次是Sn、Ba、B、Zr、P、Sr、Zn、As、Pb、Mo、Cr、Ni、V、Cu、Cd、Se。磐龍玉和磐龍墨玉二者所含元素差異不大。

為了探究磐龍玉和磐龍墨玉是否具有潛在的礦物藥用價值，本實驗初步檢測了其潛在的抗腫瘤活性。因二者所含元素差異不大，選取磐龍墨玉為研究對象，分別用甲醇、乙醇、水進(jìn)行提取，并對其提取物進(jìn)行腫瘤細(xì)胞毒活性檢測。

2.2 細(xì)胞毒性實驗

2.2.1 樣品制備 稱取150 mg 的磐龍墨玉樣品（2號）于50 mL 的離心管中，加入5 mL 提取溶劑（甲醇、乙醇水），超聲提取2 h。4 000 r／min 離心30 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，旋干。用1 mL 提取劑復(fù)溶于1.5 mL EP 管中，減壓干燥。

2.2.2 MTT 法 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整密度為2×105個／mL，用含10% 胎牛血清的RPMI?1640 或DMEM 培養(yǎng)基將細(xì)胞接種于96 孔板中于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，按照分組加入含藥培養(yǎng)基100μL。共分為7組，DMSO 對照組、磐龍墨玉甲醇提取物組（100 μg／μL）、磐龍墨玉乙醇提取物組（100 μg／μL）、磐龍墨玉水提取物組（100 μg／μL）、二氧化硒（15 μmol／L）和多西他賽（1 μmol／L），置培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。向各孔細(xì)胞中加入10 μL 的MTT（5 g／L），孵育4 h后吸棄上清，每孔再加入100 μL DMSO，振蕩混勻后，用酶標(biāo)儀（波長為570 nm）測定各孔OD值，記錄結(jié)果并計算細(xì)胞增殖率，實驗重復(fù)3 次。細(xì)胞增殖率＝（OD值各實驗組－OD值空白組）／（OD值對照組－OD值空白組）×100%。

2.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2020 軟件及SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，并計算腫瘤細(xì)胞生長的半數(shù)抑制濃度IC50，用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行作圖，最終結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式表示。多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA），以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2.4 結(jié)果

2.2.4.1 細(xì)胞毒活性比較 為檢測磐龍墨玉不同溶劑提取物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用，本實驗分別在10種腫瘤細(xì)胞株上測定了細(xì)胞毒活性。結(jié)果見圖1，磐龍墨玉的甲醇、乙醇提取物（100 μg／μL）體外作用48 h 對人胰腺癌細(xì)胞MIA PaCa?2、人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人肝癌細(xì)胞Hep G2、人肺癌細(xì)胞A549、人乳腺癌細(xì)胞MDA?MB?231、小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10、人黑色素瘤細(xì)胞A375、人食管癌細(xì)胞Eca109、人前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC?3 的細(xì)胞增殖均具有明顯的抑制作用（P＜0.001），且乙醇提取物的細(xì)胞毒作用強(qiáng)于甲醇提取物。通過進(jìn)一步比較磐龍墨玉甲醇及乙醇提取物對不同細(xì)胞株增殖率的影響，發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細(xì)胞B16F10 和A375 對磐龍墨玉甲醇及乙醇提取物最為敏感，表明磐龍墨玉對黑色素瘤具有一定的選擇性。

圖1 磐龍墨玉提取物對不同細(xì)胞株增殖率的影響

水提取物的抑制作用相對較弱，僅在 LNCaP、B16F10、A375、HeLa、Hep G2 和Eca109細(xì)胞上顯示出較弱的腫瘤細(xì)胞毒活性。陽性對照藥二氧化硒和多西他賽在不同種類的細(xì)胞中表現(xiàn)出不同程度的抑制作用（P＜0.001）。以上結(jié)果表明，磐龍墨玉的乙醇提取物具有一定的廣譜細(xì)胞毒活性，其有效成分值得進(jìn)一步探索。

2.2.4.2 抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖 進(jìn)一步檢測了不同濃度的磐龍墨玉甲醇和乙醇提取物對黑色素瘤細(xì)胞B16F10 和A375 的抑制作用，并測定了半數(shù)抑制生長所需的濃度（IC50）。結(jié)果見圖2，不同濃度的甲醇、乙醇提取物（25、50、75、100 μg／μL）作用于B16F10 和A375細(xì)胞48 h，隨著濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。磐龍墨玉的2種醇提物對黑色素瘤細(xì)胞的IC50值見表6。以上實驗結(jié)果表明，磐龍墨玉的甲醇和乙醇提取物可有效地抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖，且呈劑量依賴關(guān)系。

表6 磐龍墨玉各提取物對黑色素瘤細(xì)胞的IC50值（，μg／μL）

表6 磐龍墨玉各提取物對黑色素瘤細(xì)胞的IC50值（，μg／μL）

3 討論與結(jié)論

本課題采用的ICP?MS 方法，能準(zhǔn)確分析礦物中所含元素的種類和含量，在研究礦物藥的組成、元素含量及品種差異等方面應(yīng)用廣泛，因此是評價礦物藥安全性及其質(zhì)量的重要依據(jù)［20］。采用該方法，全正香等［21］測定了藏藥南寒水石樣品中的金屬元素成分，其中含有大量Ca、Si、Mg、Fe、Al、Na、K、Zn、Mn、Pb、As、Hg 等元素。胡蓮［22］比較了琥珀等8種礦物類中藥傳統(tǒng)飲片和其配方顆粒中微量元素Pb、Cu、Mn、Ni、Cr、Zn、As、Sb、Cd 的含量差異，指出Mn 元素與鎮(zhèn)驚安神藥治療心神不寧、頭暈?zāi)垦５雀侮柹峡褐C有關(guān)。周杰等［23］對生龍骨、煅龍骨、生牡蠣、煅牡蠣、生石膏、滑石6種礦物藥進(jìn)行了微量元素測定，得出6種礦物類中藥均含有人體必需微量元素Mn和Zn，而滑石中含有較大量的Mn、Ni、Cr。本研究初步對磐龍玉和磐龍墨玉進(jìn)行了元素分析，磐龍玉和磐龍墨玉中含有As、B、Ba、Cr、Se、Cu、Mo、Ni、P、Pb、Cd、Sn、Sr、V、Zn、Zr 等多種礦物元素，兩者所含元素種類基本一致，所存在的差別為磐龍墨玉中還檢測到含有Li 元素，個別編號的磐龍墨玉還含有微量的Hg 元素。磐龍玉中元素平均含量由高到低依次是Sn、Ba、B、Zr、P、Sr、Zn、As、Pb、Mo、Cr、Ni、V、Cu、Cd、Se；而磐龍墨玉中元素平均含量由高到低依次是Ba、P、B、Pb、Zr、Zn、V、Sr、Cr、Ni、Mo、As、Sn、Li、Cu、Se、Cd、Hg。總體來看，二者所含元素種類差異不大，但元素含量比例有所不同。磐龍玉和磐龍墨玉中所含有的As、Cr、Se、Cu、Mo、Ni、Cd、Sn、Sr、V、Zn 等元素已被確認(rèn)在人體中具有特殊的生理功能［24］。

在元素分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步的細(xì)胞實驗證實磐龍墨玉的甲醇和乙醇提取物對10種腫瘤細(xì)胞株均具有一定的細(xì)胞毒活性，而磐龍墨玉的水提取物對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性較弱。其中磐龍墨玉的甲醇和乙醇提取物對黑色素瘤細(xì)胞B16F10 和A375 的細(xì)胞毒活性最強(qiáng)，可呈濃度依賴的抑制黑色素瘤細(xì)胞的生長。但提取物中究竟是何種成分在發(fā)揮作用以及這些成分抗腫瘤作用的確切機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。磐龍玉和磐龍墨玉中富含多種與人體生理功能相關(guān)的微量元素，微量元素在中藥的藥效及安全性方面起著重要作用［25］。通過該研究，初步確認(rèn)了磐龍墨玉具有一定的腫瘤細(xì)胞毒活性，以期在一定程度上豐富礦物藥的研究類型和方法，同時為進(jìn)一步研究磐龍玉和磐龍墨玉提供了科學(xué)依據(jù)。