滇重樓產(chǎn)業(yè)鏈上游質(zhì)量控制關(guān)鍵影響因素探究

陳達菊楊 青茹瑞紅陳顯梅楊羚鈺申世安

（云南省文山壯族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南 文山663099）

滇重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.??Mazz 是黑藥花科重樓屬多年生草本植物［1］，是傳統(tǒng)名貴中藥材［2］，2015年《中國藥典》 收錄主要種之一［3］?，F(xiàn)代研究表明，重樓具有抗腫瘤、抗缺血性損傷、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、止血、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗血小板聚集、抗炎等生物活性，是云南白藥、宮血寧膠囊、樓蓮膠囊、清咽膠囊、季德勝蛇藥片、熱毒清膠囊、金復(fù)康口服液等中成藥的主要原料［4?6］。近年來，人工馴化成為解決市場供需矛盾、實現(xiàn)重樓資源有效保護和可持續(xù)利用的主要途徑，但是由于種源混雜，采收沒有科學(xué)的參考指數(shù)，藥材質(zhì)量和收獲量得不到保證成為了亟待解決的主要問題。

從1962年起，國內(nèi)對重樓的研究就開始興起［7］，但是對收獲期的研究較少，均根據(jù)滇重樓皂苷含量的多少來確定收獲期，且各研究者研究得出的結(jié)果不一，略顯片面，無法作為滇重樓種植業(yè)的參考依據(jù)。重樓皂苷含量是重樓藥材的質(zhì)量評價指標之一，除了4種《中國藥典》 規(guī)定的皂苷外，重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷H 和薯蕷皂苷也具有很好的生物活性，且含量較高［8?10］。本研究基于HPLC?DAD 對滇重樓7種主要皂苷含量的動態(tài)變化以及滇重樓上游質(zhì)量控制關(guān)鍵點進行了系統(tǒng)分析，并在此基礎(chǔ)上設(shè)定了收獲指數(shù)。以期該研究結(jié)果為滇重樓種植業(yè)和藥材上游質(zhì)量控制提供科學(xué)的理論依據(jù)和手段，從而保證滇重樓藥材的質(zhì)量和藥農(nóng)的收益，同時為其他中藥材質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260 HPLC?UV（美 國Agilent 公 司）；DZF?6050MBE型電熱恒溫真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；BRANDSON 8510型超聲波清洗機（40 kHz，美國BRANDSON 公司）；eppendorf 5804 離心機、eppendorf 移液器（德國Eppendorf 公司）；CP225D型分析天平（德國Sartorius 公司）；boekel 干浴鍋（美國Boekel 公司）。

重樓皂苷Ⅰ（批號HN1116XB13）、重樓皂苷Ⅱ（批號R2206F4766）、重樓皂苷Ⅵ（批號Z10F3B1）、重樓皂苷Ⅶ（批號R26A6F2816）、重樓皂苷Ⅴ（批號Y19F7H9835）、重樓皂苷H（批號C12A8G33615）和薯蕷皂苷（批號P20J7F18116）對照品購自上海源葉生物科技有限公司。色譜純甲醇、乙腈購于美國賽默飛公司，其他試劑均為分析純。

滇樓新鮮根莖根據(jù)實驗需要分別收集于云南省內(nèi)不同地區(qū)、文山州內(nèi)不同縣市等，皂苷含量動態(tài)變化的實驗材料取自同一個基地、同一個類型。樣品設(shè)2個重復(fù)，滇重樓基源由中國科學(xué)院昆明植物研究所李恒鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Thermo C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相水（A）? 乙腈（B），梯度洗脫（0～40 min，35%～40%B；40～50 min，55%～60%B；60～70 min，35%B）；體積流量0.8 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm；進樣量20 μL。按照上述色譜條件進行分析，各成分分離度良好，色譜圖見圖1～2。

2.2 對照品溶液制備分別精密稱定減壓干燥至恒定質(zhì)量的重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷H 和薯蕷皂苷對照品適量，加純甲醇溶解并制備成混合質(zhì)量濃度分別為0.414、0.512、0.103、0.313、0.668、0.204、0.107 mg／mL 的對照品貯備液。精確量取對照品混合貯備液1.0、2.5、5.0、7.5、10 mL添加甲醇適量，精密定容到10 mL，得到不同梯度濃度對照品。置于4 ℃的冰箱內(nèi)，臨用前經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，備用。

2.3 線性關(guān)系考察 精確吸取“2.2”項下系列混合對照品溶液各20 μL，在“2.1”色譜條件下進樣，以對照品的峰面積縱坐標（Y），相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，得回歸方程分別為重樓皂苷ⅠY＝9 460.4X－4.900 8（r＝0.999 4）；重樓皂苷ⅡY＝7 080.4X＋7.949 9（r＝0.998 3）；重樓皂苷ⅥY＝9 842.1X－0.313（r＝0.999 4）；重樓皂苷ⅦY＝6 668.1X＋12.945（r＝0.999 5）；重樓皂苷ⅤY＝10 865X＋1.942 2（r＝0.999 4）；重樓皂苷HY＝7 294.1X－23.8（r＝0.999 4）；薯蕷皂苷Y＝9 691.7X＋59.899（r＝0.998 0）。表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 供試品溶液制備分別精密稱定干燥重樓粉末（過50 目篩）0.25 g，置15 mL 離心管中，精密加甲醇5 mL，稱定質(zhì)量，混勻，密封，室溫下超聲提取30 min（300 W，40 kHz），取 出，放至室溫，用甲醇補 足減失質(zhì) 量，10 000 r／min離心8 min，取上清1.5 mL，60 ℃干浴鍋揮干，300 μL 乙腈溶解，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

按“2.2”項下方法制備對照品溶液，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下進樣檢測，得到液相色譜圖。

2.5 不同種及類型對重樓質(zhì)量的影響 七葉一枝花采自馬關(guān)（野生），南重樓采自麻栗坡（野生），五子蓮采自紅河（野生），滇重樓采自紅河（栽培），采回材料清洗干凈，瀝干水分，稱定質(zhì)量（鮮質(zhì)量），切片，40 ℃烘干，稱定質(zhì)量（干質(zhì)量），打粉，過50 目篩，陰涼低溫處保存。

從圖1 可以看出，不同種重樓液相色譜指紋不一樣，峰也不一樣，只有七葉一枝花和滇重樓含有樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ等4種《中國藥典》規(guī)定的皂苷，其他2種重樓皂苷皆不達標?？梢姴煌N間重樓的有效成分含量差異極大，部分成分甚至沒有，所以種的識別應(yīng)該作為重樓原料質(zhì)量控制的主要手段。

圖1 不同種重樓液相色譜指紋差異

圖2 混合對照品及樣品對照色譜圖

2.6 不同齡期滇重樓皂苷含量變化 2～7年栽培滇重樓皆為基地育苗移栽，樣品均采自文山市平壩鎮(zhèn)重樓種植基地，3～10年野生滇重樓均采自富寧縣（判斷依據(jù)為莖痕），野生及栽培7年生重樓對比材料均采自富寧縣，從圖3～4 可見在對比材料的產(chǎn)地一致、滇重樓種質(zhì)類型一致，方法一致的情況下，種植滇重樓（2～7年）各皂苷色譜峰面積隨著年限增加都呈上升趨勢，重樓皂苷Ⅰ表現(xiàn)更為明顯，野生滇重樓（3～10年）各皂苷色譜峰面積呈上升趨勢。即在10年生長期內(nèi)皂苷含量是隨著年限增加而上升，第7年增加最為明顯，7年后1～7種皂苷升高趨勢變緩，而5 和6之間的皂苷峰升高顯著。圖5 栽培和野生滇重樓同種類型、產(chǎn)地相同，液相指紋色譜圖基本一致，總含量差異不明顯，1～3號皂苷栽培重樓偏高，4～7號皂苷是野生重樓偏高。

圖3 2～7年栽培滇重樓皂苷積累動態(tài)變化

圖4 3～10年野生滇重樓皂苷積累動態(tài)變化

圖5 7年野生與栽培重樓圖譜

2.7 不同收獲時間對滇重樓皂苷的影響 由于生產(chǎn)中藥農(nóng)主要以收獲的滇重樓根莖鮮質(zhì)量或者是干質(zhì)量作為收獲的主要指標，保證不了藥材質(zhì)量，甚至有的藥農(nóng)收獲地下部分是根據(jù)農(nóng)事安排，不能保證質(zhì)量的同時也不能保證收獲量，所以設(shè)定一個既能反映干物質(zhì)收獲量又能反映有效成分的指數(shù)作為藥材種植收獲參考指標具有必要性。課題組根據(jù)長期調(diào)查種植業(yè)收獲和實驗測定數(shù)據(jù)設(shè)定了收獲指數(shù)，即每克藥材中干燥以后所能收獲的有效成分含量。

材料均采集于文山州文山市平壩鎮(zhèn)，滇重樓3年種苗（野生重樓根莖）來源于滇西北，在平壩鎮(zhèn)已經(jīng)種植5年，每月25～28 d 采一次材料，每次采樣為5年生滇重樓根莖尾端。設(shè)2 次重復(fù)。取13 批重樓藥材粉末，進行峰面積測定，計算重樓藥材中7種成分的含量，結(jié)果見表1。

表1 顯示，不同收獲時間滇重樓藥材均含有7種皂苷成分。7種皂苷的動態(tài)變化，總體基本一致，都呈現(xiàn)2個峰值，集中在6 至9 月和10 至1 月，可見皂苷積累較多主要集中在滇重樓的盛花期和果實成熟期。測定結(jié)果表明，滇重樓折干率隨著不同收獲時間變化而變化，9 至12 月折干率均在40%以上，生長量趨于恒定，6～8、11 這4個月皂苷含量較高，收獲指數(shù)7 至12 月較高，最高為11 月，11 月份種子已經(jīng)收獲，根據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗，地下部分生長也基本達到最大，地上部分仍可作為產(chǎn)品利用，故一年之中最適宜收獲的時間為11 月份。

表1 不同收獲期折干率和皂苷含量（mg／g）

2.8 不同產(chǎn)地來源滇重樓皂苷含量差異分別從云南省滇重樓主產(chǎn)地曲靖、景洪、紅河和文山采集滇重樓樣品，文山州廣南、麻栗坡、馬關(guān)、西疇、富寧和文山采集滇重樓樣品，年限差距小于2年。按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，得到液相指紋色譜圖6～7。從圖6 可以看出雖然峰面積差異顯著，除景洪外，不同產(chǎn)地滇重樓液相指紋圖譜基本一致；從圖7 可以看出，文山州不同縣市分布滇重樓皂苷指紋圖譜基本一致，含量有所差異，文山和馬關(guān)產(chǎn)的滇重樓中峰4 和峰6 明顯比其他幾個產(chǎn)區(qū)偏高，但不同成分間峰面積比例基本一致，部分差異由于材料不完全一致影響。可見不同產(chǎn)地滇重樓皂苷含量差異顯著，目前暫未找到變化規(guī)律，景洪樣品為市場上購買根莖，類型、亞種上不能準確鑒定。

圖6 云南省不同地區(qū)滇重樓HPLC 指紋圖譜

圖7 文山州不同產(chǎn)區(qū)滇重樓HPLC 指紋圖譜

3 討論

黃偉光等［11］采用J.W.Rothiock 等氏方法水解提取了重樓薯蕷皂素。近年來，研究人員對滇重樓主要皂苷含量的進行了不同方法的測定分析，并與近源種進行了對比研究［7，12?14］不同產(chǎn)地滇重樓皂苷含量，其品質(zhì)受產(chǎn)地、環(huán)境因素影響較大，表現(xiàn)出一定的地域性及生境依賴性［15］，滇重樓生長年限不同，收獲期不同，其皂苷含量也有較大差異，1～7年生重樓隨年齡增加基本呈上升趨勢［16?20］。HPLC在中藥化學(xué)成分分析方面應(yīng)用較多，采用HPLC 對滇重樓皂苷進行檢測分析簡便、準確，具有良好的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性，可用于滇重樓的質(zhì)量控制及綜合評價［12?23］。

不同種及亞種間皂苷含量有顯著差異，目前研究結(jié)果表明含有重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ的重樓有七葉一枝花，滇重樓［7］，本實驗中的七葉一枝花和滇重樓液相色譜圖也都包含了這4種皂苷的4個主要色譜峰。不同產(chǎn)地重樓的有效成分含量存在明顯差異［15］；尹顯梅等［20］同時測定華重樓6種皂苷，認為最佳種植年限為8年、最佳采收季節(jié)為11 月份。趙廷周等、夏從龍等［18?19］也對滇重樓收獲期進行了研究，但是結(jié)果不一。本實驗結(jié)果表明了隨著時間的變化總皂苷變化的規(guī)律與重樓的發(fā)芽、開花、結(jié)實等有一定關(guān)系。滇重樓皂苷含量是衡量滇重樓質(zhì)量的主要指標之一，重樓除了2015年版《中國藥典》 中規(guī)定的4種主要皂苷外，重樓皂苷V、重樓皂苷H、薯蕷皂苷等也是滇重樓中的主要皂苷，且含量較高，同樣具有鎮(zhèn)痛、止血、抗腫瘤等功效，所以本實驗中主要以這7種皂苷作為重樓的主要考察指標，結(jié)合折干率，設(shè)定了收獲指數(shù)。

不同種決定了重樓皂苷的種類和多少，種的鑒別和限定應(yīng)該作為市場流通中控制質(zhì)量的主要手段，液相指紋圖譜、薄層、及新鮮根莖外觀均可作為鑒定手段；隨著栽培年限的增加，滇重樓皂苷含量成上升趨勢，7年以后含量增加趨于平緩，建議滇重樓種植7年以后收獲；收獲時間對皂苷含量影響明顯，干物質(zhì)的積累量影響藥農(nóng)的經(jīng)濟收成，同時通過近幾年來的栽培經(jīng)驗，11 月份以后滇重樓地下部分基本達到一年中最大產(chǎn)量，故11 月為最佳收獲期，收獲指數(shù)則把兩者關(guān)聯(lián)起來，通過收獲指數(shù)測定確定藥材的收獲時間11 月份為最佳，產(chǎn)地對重樓皂苷含量的影響顯著，推測可能與海拔和種質(zhì)的鑒定有一定關(guān)系，重樓應(yīng)該有種植區(qū)域的限定和朔源體系；栽培模式對滇重樓皂苷含量的也有一定影響，但不顯著。本實驗中提出了收獲指數(shù)的定義，并作為確定滇重樓收獲期的主要參考指數(shù)，本指標既反應(yīng)了滇重樓收獲的干物質(zhì)量同時也反應(yīng)了滇重樓的皂苷含量。

致謝：本實驗在開展過程中得到了中科院昆明植物所李恒研究員的指導(dǎo)，特此謝意！