多裂烏頭生藥學(xué)探究

丁 榮趙明明汪中江 黃旭峰 王毓杰 古 銳* 天喜格勒奪吉澤讓

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都611137； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都611137；3.四川金瑞和集團(tuán)有限公司，四川 金川624100； 4.四川省阿壩州食品藥品檢驗(yàn)所，四川 馬爾康624000）

鐵棒錘是多民族習(xí)用大宗藥材，具有祛風(fēng)除濕、止痛、消腫散瘀的功效［1?3］，為云南白藥等成藥的原料藥材。多裂烏頭Aconitum polyschistumHand.?Mazz.為毛茛科烏頭屬植物，是四川省阿壩、甘孜兩州習(xí)用鐵棒錘的原植物［4］，該品種目前被馴化為栽培品種，在阿壩州高半山農(nóng)區(qū)廣泛栽培，是本地精準(zhǔn)扶貧的重要品種，其藥材大量供給省外藥廠。但是，由于缺乏基礎(chǔ)研究，該品種在產(chǎn)地被誤認(rèn)為鐵棒錘Aconitum pendulumBusch 和伏毛鐵棒錘Aconitum flavumHand.?Mazz.，缺乏質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，缺乏栽培馴化前后藥材品質(zhì)比較，影響了本品的合理使用。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)開展多裂烏頭生藥學(xué)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，以期為本品的深入開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，并為建立本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

美國AgiLent 1260 高效液相色譜儀（檢測(cè)器1260 DAD VL，美國AgiLent 公司）；SB?5200D 超聲波清洗機(jī)（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）；OLYMPUS（CX41）光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；FA1004型分析電子天平（萬分之一，上海良平儀器儀表有限公司）。

樣品為自采，共9 批，1 批為野生品，8 批為栽培品，2號(hào)樣品采樣地金川縣勒烏鄉(xiāng)前鋒村是3～9號(hào)栽培品種源地。經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院古銳教授鑒定為多裂烏頭Aconitum polyschistumHand.?Mazz.的干燥子根。烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品購于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司（純度≥98%）。見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 原植物形態(tài)鑒別 本品野生品子根近紡錘形，長約3～10 cm，栽培品子根多，子根呈長圓柱形，長約為5～20 cm。莖稍粗，疏被反曲而緊貼的短柔毛，等距離著生葉，常有分枝。莖下部葉有稍長柄，莖中部葉有短柄；葉片寬卵形，分裂極細(xì)，長6～8 cm，寬5～8 cm，中央全裂片卵形，近羽狀細(xì)裂，末回裂片極狹條形，兩面無毛；下部葉柄長約2 cm，中上部葉柄長約0.5 cm。頂生總狀花序狹長，長15～28 cm，有多數(shù)密集的花，有時(shí)在花序軸下部有側(cè)生花序；軸和花梗密被反曲的短柔毛；下部苞片葉狀，其他的線形；頂生花序花梗較短，長約1 cm，通常側(cè)生花序的花梗較長，長2～3 cm；小苞片生花梗中部之上，線形；萼片藍(lán)紫色，外面密被短柔毛，上萼片盔狀船形，高0.8～1.2 cm，自基部至喙長1.5～1.7 cm，下緣向上斜伸，凹；花瓣無毛，距短，稍向后彎；花絲被短柔毛，全緣；心皮3，子房密被緊貼的短柔毛。種子倒卵狀三棱形，沿棱具狹翅?；ㄆ?～10 月。

2.2.1 栽培品 子根呈不規(guī)則的長圓柱形，長5～20 cm，直徑0.5～1.5 cm；表面灰棕色，有縱皺紋及側(cè)根痕。質(zhì)脆，易折斷，斷面白色，粉性，有黑棕色環(huán)。氣微，味苦、麻。

2.2.2 野生品 子根呈短圓柱形、圓錐形，表面呈黃棕色，有淺縱皺紋，長3～10 cm，直徑0.5～1 cm。

由此可見，兩者的區(qū)別主要是栽培品子根較野生品數(shù)量增多，變長，變細(xì)，部分彎曲，且顏色有一定差異。

2.3 顯微鑒別

2.3.1 子根橫切面 后生皮層為2～3 層，壁栓化稍增厚；皮層緊密排列，類長方形，方形或長圓形；內(nèi)生皮層明顯且不見石細(xì)胞；韌皮部寬廣，隨處可見篩管群；形成層呈不規(guī)則的多角形或類圓形；木質(zhì)部內(nèi)導(dǎo)管1～4個(gè)相聚或者成列，位于形成層內(nèi)側(cè)；髓部較大。見圖1。

圖1 多裂烏頭根橫切面構(gòu)造圖（×100）

2.3.2 粉末 本品粉末呈白色。后生皮層細(xì)胞較大，細(xì)胞成類方形、長方形，壁增厚，內(nèi)含棕色物質(zhì)，易破碎。淀粉粒多成類圓形，水滴狀，單粒多，復(fù)粒由2～3 粒組成，層紋不明顯，臍點(diǎn)人字狀，一字狀，點(diǎn)狀，縫隙狀，直徑2.5 ～48 μm。纖維單個(gè)散在，長梭形，多破碎，壁不甚厚，胞腔小，紋孔明顯，直徑10～24 μm。導(dǎo)管多為網(wǎng)紋導(dǎo)管，還有環(huán)紋導(dǎo)管，直徑為18～32 μm。見圖2。野生品與家種品粉末特征無差異。

圖2 多裂烏頭粉末特征（×400）

2.4 薄層鑒別 稱取批號(hào)1～4號(hào)的干燥的多裂烏頭粉末（過2號(hào)篩）約2 g，置250 mL 具塞錐形瓶中，加入40 mL甲醇溶液，超聲處理30 min（250 W，40 kHz），濾過，用5 mL 甲醇溶液洗滌濾渣2 次，合并濾液，低溫蒸干，加入3 mL 甲醇溶液溶解，得供試品溶液，備用。取烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品，加甲醇溶液制成每1 mL 含有1 mg的對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（2015年版《中國藥典》 附錄ⅥB）試驗(yàn)，分別吸取上述溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上。以正己烷?乙酸乙酯?甲醇（6.4∶5∶1）為展開劑［5］，展開，取出晾干后噴以稀碘化鉍鉀試液。結(jié)果各樣品與對(duì)照品在相同位置顯相同顏色斑點(diǎn)，見圖3。

門窗在建筑中的作用是采光、通風(fēng)和圍護(hù)，是最容易造成熱損失的構(gòu)件，為增大采光通風(fēng)面積，建筑物的門窗面積逐步增大，這就給建筑節(jié)能方面提出了更高的挑戰(zhàn)。對(duì)門窗構(gòu)件的節(jié)能處理是通過改善保溫隔熱性能和提高門窗的密閉性能實(shí)現(xiàn)。目前推廣使用的新型環(huán)保節(jié)能窗戶有鋁合金斷熱型材、鋁木復(fù)合型材、鋼塑整體擠出型材、塑木復(fù)合型材以及UPVC塑料型材等一些技術(shù)含量較高的節(jié)能產(chǎn)品。

圖3 多裂烏頭薄層色譜圖

2.5 檢查總灰分、酸不溶性灰分 按照2015年版《中國藥典》 四部方法（通則2302）測(cè)定［6］。不同產(chǎn)地的多裂烏頭總灰分含量為2.65%～5.09%；酸不溶性灰分含量為0.08%～1.25%。

2.6 含量測(cè)定

2.6.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品適量，分別置于10 mL 量瓶中，加入甲醇制備成質(zhì)量濃度0.417 2 mg／mL 烏頭堿、0.108 8 mg／mL 苯甲酰烏頭原堿的溶液，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。

2.6.2 供試品溶液制備 稱取干燥的多裂烏頭粉末（過2號(hào)篩）約2 g，置250 mL 具塞錐形瓶中，加入40 mL 甲醇溶液，超聲處理30 min（250 W，40 kHz），濾過，用5 mL甲醇溶液洗滌濾渣2 次，合并濾液，低溫蒸干，加入5 mL甲醇溶液溶解，即得［7?8］。

2.6.3 色譜條件 Welchrom C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相0.1 moL／L 醋酸銨（A）?乙腈?四氫呋喃（5∶3）（B），梯度洗脫，洗脫程序見表2；檢測(cè)波長235 nm［9?12］。色譜圖見圖4。

表2 梯度洗脫條件

圖4 各成分HPLC 色譜圖

2.6.4 線性關(guān)系考察 依次精密量取烏頭堿（0.417 2 mg／mL）、苯甲酰烏頭原堿（0.108 8 mg／mL）的對(duì)照品貯備溶液。在“2.6.3”項(xiàng)色譜條件 下，分 別進(jìn)樣1、2、6、10、12、14 μL，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為烏頭堿Y＝1 199.1X（r＝0.999 9）和苯甲酰烏頭原堿Y＝1 073.9X（r＝0.999 9）。表明烏頭堿和苯甲酰烏頭分別在0.417 2～5.840 8、0.108 8～1.523 2 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.5 精密度試驗(yàn) 精密量取混合對(duì)照品溶液10 μL，在“2.6.3”項(xiàng)色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿峰面積RSD分別為0.52%、0.40%，表明儀器精密度良好。

2.6.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批干燥的多裂烏頭樣品6 份，按“2.6.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.6.3”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣，測(cè)定烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿的峰面積，結(jié)果烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿含量RSD分別為1.99%、1.91%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一多裂烏頭供試品溶液，在“2.6.3”項(xiàng)色譜條件下，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣10 μL，測(cè)定烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿的峰面積，結(jié)果烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿RSD分別為0.45%、1.98%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品共6 份，每份約0.5 g，分別加入適量的混合對(duì)照品溶液，按“2.6.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.6.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.6.9 樣品含量測(cè)定 取9 批不同產(chǎn)地不同時(shí)間采集的多裂烏頭樣品，每批樣品平行制樣2 份，按“2.6.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.6.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果見表4。

表4 樣品灰分與含量測(cè)定結(jié)果（n＝2）

3 討論

本研究參考《中國植物志》［13］與羅艷等［14］對(duì)烏頭屬的形態(tài)描述進(jìn)行鑒定，多裂烏頭A.polyschistum與伏毛鐵棒錘A.flavum形態(tài)特征極為相似。本研究主要以心皮數(shù)為3 作為鑒定本品為多裂烏頭A.polyschistum的主要依據(jù)，但本品葉并不符合文獻(xiàn)中多裂烏頭葉片似茴香葉描述［7］，而更符合《中國植物志》 對(duì)多裂烏頭葉形態(tài)的描述。

本研究通過對(duì)多裂烏頭A.polyschistum系統(tǒng)的生藥學(xué)研究，找出了藥材性狀的主要鑒別特征為野生品子根呈短圓柱形、圓錐形，表面呈黃棕色，有淺縱皺紋，長3～10 cm，直徑0.5～1 cm，栽培品子根呈不規(guī)則的長圓柱形，長5～20 cm，直徑0.5～1.5 cm；表面灰棕色，有縱皺紋及側(cè)根痕。質(zhì)脆，易折斷，斷面白色，粉性，有黑棕色環(huán)。氣微，味苦、麻。

子根橫切面后生皮層為2～3 層，壁栓化稍增厚；皮層緊密排列，內(nèi)生皮層明顯且不見石細(xì)胞；韌皮部寬廣，隨處可見篩管群，木質(zhì)部內(nèi)導(dǎo)管1～4個(gè)相聚或者成列；粉末上后生皮層細(xì)胞較大，壁增厚，內(nèi)含棕色物質(zhì)；纖維單個(gè)散在，長梭形，壁不甚厚，胞腔小；導(dǎo)管多為網(wǎng)紋導(dǎo)管、環(huán)紋導(dǎo)管。

本研究采用正己烷?乙酸乙酯?甲醇（6.4∶5.0∶1）與樣品提取方法建立的薄層色譜鑒別方法斑點(diǎn)清晰，可以采用此方法鑒別出多裂烏頭藥材；采用HPLC，同時(shí)測(cè)定了烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿2種成分的含量，考察了供試品超聲提取與回流提取方法；考察了提取溶劑，包括甲醇、乙醇、75%甲醇、50%甲醇；考察了提取溶劑用量；考察了提取時(shí)間；溶解溶劑考察，最終確定40 mL 甲醇超聲處理30 min 后過濾，低溫蒸干，5 mL 甲醇溶解為最佳提取條件［15?17］。

前期對(duì)烏頭屬類植物的苯甲酰烏頭原堿開展的研究較少，而且多裂烏頭Aconitum polyschistum植物成分差異較大，因此在本實(shí)驗(yàn)中所測(cè)藥材中均含有烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿，可以作為多裂烏頭含量測(cè)定的指標(biāo)，其中苯甲酰烏頭原堿具有抗炎鎮(zhèn)痛、治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種生物活性［18?19］。

本研究表明多裂烏頭家種藥材形態(tài)與野生品區(qū)別較大，從根的特點(diǎn)上能夠直觀區(qū)分野生與家種。在含量測(cè)定中，家種品種的烏頭堿與苯甲酰烏頭原堿總量都大于野生品，能夠替代野生品。