散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對縮宮素誘導(dǎo)小鼠痛經(jīng)的作用機制

孫 蘭李家春劉莉娜 皇立衛(wèi) 魏天楊王振中*

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安223003； 2.江蘇財經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安223003；3.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港222001； 4.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室，江蘇連云港222001）

痛經(jīng)是指月經(jīng)期間下腹部出現(xiàn)痙攣性疼痛，是最常見的婦科疾病之一，有時伴有惡心、嘔吐、腹瀉、頭痛和頭暈等全身癥狀［1］。臨床上痛經(jīng)分為原發(fā)性痛經(jīng)和繼發(fā)性痛經(jīng)2種類型，前者是指生殖器官無器質(zhì)性病變的痛經(jīng)，后者是指盆腔器質(zhì)性疾病所引起的痛經(jīng)［2］。育齡婦女原發(fā)性痛經(jīng)的患病率為30%～50%，有10%左右的病人，疼痛難于忍受，每月有1～3 d 或更長時間不能正常工作、生活，必須接受治療［3］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)生與月經(jīng)時子宮內(nèi)膜前列腺素（prostaglandin，PG）水平增高有關(guān)［4］。研究表明痛經(jīng)患者子宮內(nèi)膜和月經(jīng)血中前列腺素F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）水平較正常婦女明顯升高［5］。另外，痛經(jīng)也與子宮平滑肌不協(xié)調(diào)收縮，造成子宮供血不足，導(dǎo)致厭氧代謝物積貯，刺激疼痛神經(jīng)元有關(guān)［6］。

散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊由龍血竭、三七、浙貝、薏苡仁4 味藥材組成，臨床用于治療子宮內(nèi)膜異位所致的繼發(fā)性痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、盆腔包塊、不孕等。研究表明，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊顯著減輕原發(fā)性痛經(jīng)患者的癥狀，降低經(jīng)期血漿PGF2α水平［7］，課題組在研究中發(fā)現(xiàn)，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊能抑制小鼠子宮平滑肌細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流，減輕子宮平滑肌細胞收縮［8］。但散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊治療原發(fā)性痛經(jīng)的機制尚不明確，本實驗通過縮宮素誘導(dǎo)的小鼠痛經(jīng)模型，研究散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊體內(nèi)抗痛經(jīng)作用，并探討其作用機制，以期為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 ICR 小鼠，雌性，體質(zhì)量18～22 g，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2017?0007，分籠飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2 試劑與藥物 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊（批號20180216，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司）；布洛芬緩釋膠囊（批號171106，福建太平洋制藥有限公司）；苯甲酸雌二醇注射液（批號20171116，寧波第二激素廠）；縮宮素注射液（批號170516，上海禾豐制藥有限公司）；生理鹽水（山東齊都藥業(yè)股份有限公司）；羧甲基纖維素鈉（批號20161012，中國醫(yī)藥［集團］上?；瘜W(xué)試劑公司）；PGF2αELISA 檢測試劑盒（批號20190928，南京建成生物有限公司）；一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；RIPA 裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所）；BCA 蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因有限公司）；兔抗COX?2 抗體（cyclooxygenase?2，ab15191，英國Abcam 公司）；兔 抗 P?MLC20 抗 體（myosin light chain 20 phosphorylation，3675，美國CST 公司）；羊抗兔的IgG?HRP 二抗（ab6721，美 國CST 公司）；ECL Western Blotting Substrate 試劑盒（英國Abcam公司）。

1.3 儀器 BS224S型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；ChemiDoc XRS型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio?Rad 公司）；FlexStation 3 多功能酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；5840型冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；勻漿器（德國IKA公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 參照文獻［9］的方法復(fù)制小鼠痛經(jīng)模型。60 只雌性ICR 小鼠按體質(zhì)量隨機分成6組，即正常組、模型組、陽性組（布洛芬緩釋膠囊，0.1 g／kg），散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊高、中、低劑量組（1.80、0.90、0.45 g／kg）組，每組10只。除正常組外（背部注射生理鹽水），其余組小鼠皮下注射雌激素0.05 mg／只，連續(xù)7 d，注射激素同時開始灌胃給藥，1 次／d，連續(xù)7 d，正常組、模型組灌胃等體積0.5 %羧甲基纖維素鈉混懸液，給藥容量20 mL／kg。末次灌胃1 h 后，除正常組外，其余組各鼠腹部注射縮宮素注射液2 IU／只。觀察并記錄腹腔注射后30 min 內(nèi)小鼠扭體次數(shù)。根據(jù)公式計算扭體次數(shù)抑制率（IR%），扭體抑制率% ＝（模型組扭體次數(shù)－藥物組扭體次數(shù)）／模型組×100%。

2.2 血清E2、NO 水平檢測 觀察扭體后眼眶取血，分離血清，采用放免法檢測E2 水平，根據(jù)說明書檢測NO 水平。

2.3 子宮組織PGF2α、Ca2＋水平檢測 脫頸椎處死小鼠取子宮，按照子宮組織?生理鹽水＝1∶9 比例，放入2 mL EP 管中，用勻漿器充分勻漿，3 000 r／min離心分離上清，用ELISA 法按操作說明書檢測PGF2α水平，采用比色法檢測Ca2＋水平。

2.4 免疫印跡法檢測子宮組織COX?2、P?MLC20蛋白表達 用電子天平精確稱量子宮濕質(zhì)量后，提取子宮組織總蛋白，用BCA 方法進行蛋白定量。各組取50 μg 的蛋白質(zhì)進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF 膜上后，用20 mL 5% BSA封閉，放在水平搖床上室溫平穩(wěn)搖動2 h。TBST 洗滌3 次后，PVDF 膜加入稀釋的一抗（COX?2、P?MLC20、GAPDH 稀釋的比例分別為1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000），4 ℃孵育過夜。第2 天用TBST洗PVDF 膜3 次，隨后加入稀釋二抗（1∶5 000 稀釋），室溫輕搖孵育2 h。TBST 漂洗膜3 次，加入ECL 化學(xué)發(fā)光劑，進行顯影，用凝膠圖象處理系統(tǒng)自動分析目的條帶分子量和灰度值進行定性定量分析。

2.5 免疫組化法檢測子宮組織ERα 蛋白表達 子宮組織標本經(jīng)4%多聚甲醛固定后，常規(guī)脫水，石蠟包埋。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。PBS 洗3 次，每遍5 min。用蒸餾水或PBS 配置新鮮的3% H2O2室溫封閉10 min，蒸餾水洗1 次，抗原修復(fù)，PBS 洗5 min，甩去多余液體滴加一抗（ERα，1∶200 稀釋）室溫下孵育60 min 或4 ℃過夜（過夜后在37 ℃復(fù)溫45 min），PBS 洗3 次各5 min，甩去PBS 液，每張切片加50 μL MaxVision TM 試劑，室溫下孵育15 min，PBS 洗3 次各5 min，每張切片加100 μL 新鮮配制的DAB 溶液，顯微鏡下觀察3 min，陽性顯色為棕色。蒸餾水洗終止染色，蘇木素復(fù)染，0.1 %鹽酸分化，自來水沖洗，PBS 沖洗返藍，梯度乙醇脫水，透明，封片。每張切片取5個高倍視野，用Image Pro Plus 5.0.2圖像分析軟件測定各組光密度值。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 通過Graphpad Prism 5.0 軟件進行處理，結(jié)果以（）表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對縮宮素誘導(dǎo)小鼠扭體反應(yīng)的影響 與模型組比較，布洛芬組（0.10 g／kg）、散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊 低、中、高劑量組（0.45、0.90、1.80 g／kg）小鼠扭體次數(shù)減少（P＜0.05，P＜0.01），其抑制率分別為74.6%、47.5%、57.6%、68.2%。結(jié)果提示，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對縮宮素誘導(dǎo)的小鼠痛經(jīng)具有抑制作用。結(jié)果見表1。

表1 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對縮宮素誘導(dǎo)小鼠扭體反應(yīng)的影響（， n＝10）Tab.1 Effects of Sanjie Zhentong Capsules on frequency of oxytocin?induced writhing in mice（， n ＝10）

表1 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對縮宮素誘導(dǎo)小鼠扭體反應(yīng)的影響（， n＝10）Tab.1 Effects of Sanjie Zhentong Capsules on frequency of oxytocin?induced writhing in mice（， n ＝10）

注：與正常組比較，＃＃ P ＜0.01；與模型組比較，* P ＜0.05，**P＜0.01。

3.2 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對縮宮素誘導(dǎo)小鼠血清E2、NO 水平的影響 與正常組比較，模型組血清中E2水平升高，NO 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊低、中、高劑量組血清E2 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），NO 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對縮宮素誘導(dǎo)小鼠血清E2、NO 水平的影響（， n＝10）Tab.2 Effects of Sanjie Zhentong Capsules on serum E2 and NO levels of oxytocin?induced mice（， n＝10）

表2 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對縮宮素誘導(dǎo)小鼠血清E2、NO 水平的影響（， n＝10）Tab.2 Effects of Sanjie Zhentong Capsules on serum E2 and NO levels of oxytocin?induced mice（， n＝10）

注：與正常組比較，＃＃ P ＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對縮宮素誘導(dǎo)小鼠子宮組織PGF2α、Ca2＋水平的影響 與正常組比較，模型組子宮組織PGF2α、Ca2＋水平增加（P＜0.01）；與模型組比較，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊中、高劑量組子宮組織PGF2α、Ca2＋水平降低（P＜0.05，P＜0.01），散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊低劑量組子宮組織Ca2＋水平降低（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對縮宮素誘導(dǎo)小鼠子宮組織PGF2α、Ca2＋水平的影響（， n＝10）Tab.3 Effects of Sanjie Zhentong Capsules on uteric PGF2αand Ca2＋levels in the oxytocin?induced mice（， n＝10）

表3 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對縮宮素誘導(dǎo)小鼠子宮組織PGF2α、Ca2＋水平的影響（， n＝10）Tab.3 Effects of Sanjie Zhentong Capsules on uteric PGF2αand Ca2＋levels in the oxytocin?induced mice（， n＝10）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對縮宮素誘導(dǎo)小鼠子宮組織COX?2、P?MLC20、ERα 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組COX?2、P?MLC20、ERα 蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組COX?2、P?MLC20、ERα 蛋白表達均降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1～2、表4。

圖1 各組子宮組織COX?2、P?MLC20 及GAPDH 蛋白表達Fig.1 Uteric protein expressions of COX?2， P?MLC20 and GAPDH in mice

圖2 各組子宮組織ERα 蛋白表達（IHC， ×200）Fig.2 Uteric ERα protein expression in mice（IHC， ×200）

表4 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對縮宮素誘導(dǎo)小鼠子宮組織COX?2、P?MLC20、ERα 蛋白表達的影響（， n＝3）Tab.4 Effects of Sanjie Zhentong Capsules on uteric protein expressions of COX?2， P?MLC20， ERα in oxytocin?induced mice（， n＝3）

表4 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對縮宮素誘導(dǎo)小鼠子宮組織COX?2、P?MLC20、ERα 蛋白表達的影響（， n＝3）Tab.4 Effects of Sanjie Zhentong Capsules on uteric protein expressions of COX?2， P?MLC20， ERα in oxytocin?induced mice（， n＝3）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為原發(fā)性痛經(jīng)與前列腺素（PGs）密切相關(guān)，痛經(jīng)患者體內(nèi)PGF2α水平明顯升高［10］。PGF2α與其動脈壁上的受體結(jié)合，使子宮平滑肌痙攣性收縮，進而導(dǎo)致子宮缺血、缺氧、酸性代謝產(chǎn)物在肌層堆積而致痛經(jīng)，降低子宮平滑肌PGF2α的分泌，可以有效抑制其痙攣性收縮，血液循環(huán)改善，缺血狀態(tài)緩解［11］?？s宮素與子宮平滑肌細胞縮宮素受體結(jié)合，生成的DAG（diacylglycerol）激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），通過絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）路徑生成PGs 類物質(zhì)，引起子宮收縮［12］。NO 由血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，通過調(diào)節(jié)子宮血管張力和血流量，進而參與痛經(jīng)的發(fā)生。NO 對血管調(diào)節(jié)主要是通過左旋精氨酸?NO?環(huán)磷鳥苷途徑實現(xiàn)，當(dāng)其含量下降時，可以促使傷害性信息傳遞而導(dǎo)致疼痛［13］。本實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠子宮組織PGF2α升高，血清NO 含量降低。給予散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊后，小鼠子宮組織PGF2α含量顯著降低，血清NO 含量顯著升高。提示散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊通過調(diào)節(jié)PGF2α及NO 而對原發(fā)性痛經(jīng)具有一定治療作用。COX 是參與PGs 的生物合成的限速酶。臨床上常用非甾體類抗炎藥治療原發(fā)性痛經(jīng)，其機制主要是通過抑制COX 而減少PGs 的生成。月經(jīng)期間，COX?2 高表達使PGF2α增加可能是原發(fā)性痛經(jīng)的主要機制［14］，這也解釋了選擇性COX?2 抑制劑改善原發(fā)性痛經(jīng)的治療效果。為進一步研究散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊調(diào)節(jié)PGs 產(chǎn)生的機制，對子宮組織COX?2 蛋白的表達進行了分析。實驗結(jié)果表明，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊能夠顯著抑制COX?2 蛋白表達，結(jié)果提示，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊治療痛經(jīng)與抑制COX?2 信號通路有關(guān)。

Ca2＋在細胞收縮等反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。在子宮發(fā)生缺血等損傷后，誘導(dǎo)鈣離子通道開放，使細胞質(zhì)內(nèi)Ca2＋濃度急劇增高，進而導(dǎo)致細胞膜受損，致使子宮痙攣，產(chǎn)生疼痛［15］。本實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠子宮組織Ca2＋升高。給予散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊后，小鼠子宮組織Ca2＋含量顯著降低。提示散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對原發(fā)性痛經(jīng)的治療與減少Ca2＋相關(guān)。子宮平滑肌收縮與肌球蛋白輕鏈（MLC20）的磷酸化相關(guān)［16］。在本研究中，可觀察到原發(fā)性痛經(jīng)動物子宮組織模型中P?MLC20 表達均顯著增加，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊能顯著抑制P?MLC20 表達，可見，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊能通過抑制MLC20 的磷酸化而減輕子宮收縮，從而防治原發(fā)性痛經(jīng)。

研究認為原發(fā)性痛經(jīng)與E2 的異常升高有關(guān)，E2 的生物學(xué)效應(yīng)強弱與靶細胞內(nèi)雌激素受體（ER）的水平密切相關(guān)［17］。ERα 作為ER 的主要亞型之一，在子宮中起主導(dǎo)作用，可以通過對子宮蠕動的調(diào)節(jié)來改變子宮收縮強度，以減輕痛經(jīng)程度［18］。另外，研究發(fā)現(xiàn)，ER 表達與前列腺素的合成、釋放有關(guān)，通過影響PG 從而對痛經(jīng)產(chǎn)生影響，ER 降低則PG 合成與釋放減少，從而可緩解血管平滑肌的痙攣性收縮，減緩?fù)唇?jīng)程度［19］。本實驗結(jié)果顯示，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊可降低小鼠子宮組織ERα 蛋白表達，這一結(jié)果提示散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌而改善痛經(jīng)癥狀。

綜上所述，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊能有效抑制縮宮素引起的小鼠痛經(jīng)反應(yīng)。其機制可能是通過抑制子宮組織COX?2、P?MLC20、ERα 蛋白表達，從而減少PGF2α、Ca2＋及E2 的生成。