IL-18通過下調(diào)CXCL9/CXCL10募集腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞促進(jìn)口腔鱗癌病灶轉(zhuǎn)移

周 衛(wèi) 曾華興 肖才文（江漢大學(xué)附屬醫(yī)院，武漢市第六醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，武漢430056）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是一種臨床常見口腔惡性腫瘤，85%頭頸癌主要發(fā)生于口腔［1］。目前口腔相關(guān)腫瘤是頭頸部癌癥患者死亡的主要原因［2］。OSCC發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，由多因素導(dǎo)致，腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是近年研究熱點。

腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞賴以生存的的重要環(huán)境，由多種細(xì)胞外基質(zhì)和基質(zhì)細(xì)胞組成。TAMs是浸潤于腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞，是腫瘤微環(huán)境中存在數(shù)量最多的免疫細(xì)胞，對腫瘤發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用。OSCC增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲過程與TAMs密切相關(guān)［3］。但浸潤巨噬細(xì)胞對OSCC增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲過程的調(diào)控作用及機(jī)制尚未明確。研究表明，巨噬細(xì)胞來源的IL-6可誘導(dǎo)GSK3b磷酸化以穩(wěn)定β-catenin增強(qiáng)T細(xì)胞因子（TCF）依賴性基因激活腫瘤細(xì)胞，也可增強(qiáng)炎癥反應(yīng)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌通過激活STAT3及其下游抗凋亡促增殖基因表達(dá)。CXCL（C-X-C motif chemokine ligand）是一類與細(xì)胞相關(guān)的趨化因子，可結(jié)合并激活CXC趨化因子受體2（CXCR2）活化PI3K信號通路，從而介導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）發(fā)生［4-5］。CXCL9和CXCL10在多種腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲等過程中起重要作用［6-10］。IL-18是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，其生物學(xué)功能尚未明確。研究顯示，IL-18可抑制Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17和IL-22等炎癥介質(zhì)，發(fā)揮抑炎作用［11-14］。但I(xiàn)L-18在OSCC中的作用鮮有報道。本研究探討IL-18在OSCC患者腫瘤組織中的表達(dá)水平，以及TAMs在OSCC肺轉(zhuǎn)移病灶形成過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選取2015年1月至2017年12月我院收治的38例OSCC患者，其中男性27例，女性11例，年齡27～72歲，平均年齡（47.3±12.6）歲，經(jīng)病理科診斷證實為OSCC。另選取47例同期在我院體檢中心體檢的健康志愿者作為對照，其中男性31例，女性16例，年齡19～78歲，平均年齡（48.7±16.3）歲。兩組研究對象年齡、性別等基本資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。所有患者知情同意，研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。

表1 一般臨床資料［±s，例（%）］Tab.1 General clinical information［±s，n（%）］

表1 一般臨床資料［±s，例（%）］Tab.1 General clinical information［±s，n（%）］

Items Age Male Female OSCC 47.3±12.6 27（71）11（29）Normal 48.7±16.3 31（66）16（34）P 0.654 0.743 0.632

1.1.2 實驗動物與細(xì)胞 裸鼠由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供；Tac8113細(xì)胞購自美國ATCC公司；Tac8113-IL-8細(xì)胞系由上海吉凱公司轉(zhuǎn)染。

1.1.3 主要試劑與儀器 人IL-18、CXCL9、CXCL10、CSF-1和CCL-2 ELISA試劑盒、RNA提取、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Realtime-PCR試劑（美國羅氏公司）；IL-18、CXCL9、CXCL10抗體、AKT、P-AKT、mTOR和P-mTOR抗體（Abcam公司）；β-actin抗體（西安壯志公司）；SDS-PAGE試劑（上海碧云天）；CXCL9、CXCL10、CSF-1和CCL-2引物（上海吉凱）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）（美國Gibco公司）；青鏈霉素（美國Sigma公司）；化學(xué)發(fā)光儀（ChemiScope 3600 Mini，上海勤翔公司）。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型建立 取對數(shù)生長期Tac8113與Tac8113-IL-8細(xì)胞，胰酶消化，1 000 r/min離心，PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個/ml，經(jīng)小鼠尾靜脈注射（1×106個/只），建立Tac8113與Tac8113-IL-8細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型。

1.2.2 ELISA檢測血清IL-18表達(dá) 采集OSCC患者及健康志愿者靜脈血，低溫離心，取上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測上清IL-18含量。

1.2.3 免疫組化染色 取OSCC患者術(shù)后腫瘤組織及癌旁組織，經(jīng)病理科處理后，石蠟切片脫蠟和水化，修復(fù)抗原，滴加封閉液，加入一抗，PBS沖洗，滴加生物素標(biāo)記的二抗，PBS沖洗。滴加鏈親和素-過氧化酶溶液孵育。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，陽性細(xì)胞漿著色為棕黃色。

1.2.4 qRT-PCR 取裸鼠肺組織液氮冷凍，碾磨，按照試劑盒說明書提取總RNA，取1μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。設(shè)計CXCL9、CXCL10、CSF-1、CCL-2和β-actin上下游引物，PCR循環(huán)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃5 s，60℃30 s，共40個循環(huán)。

1.2.5 Western blot 調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml，接種至6孔板，設(shè)3個復(fù)孔，48 h后細(xì)胞貼壁，取出6孔板，棄上清，PBS清洗1 min，加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液并吹打細(xì)胞團(tuán)，冰上裂解30 min，刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 ml試管，高速離心，抽取上清（提取的蛋白）。取小鼠肺組織液氮冷凍，碾磨，裂解液裂解，低溫離心取上清（組織蛋白）。BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加入上樣緩沖液，煮沸5 min，-80℃保存。SDS-PACE電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，PBST清洗，裁剪條帶并分別加入相應(yīng)抗體（1∶1 000）室溫孵育1 h，4℃孵育過夜。次日反復(fù)清洗條帶，加入二抗室溫孵育90 min，PBS沖洗，ECL發(fā)光，化學(xué)發(fā)光儀檢測并拍照。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤原代細(xì)胞 取小鼠肺部腫瘤組織，無菌條件下除去脂肪和結(jié)締組織等，PBS清洗3次，放入無菌培養(yǎng)皿，加入少量DMEM培養(yǎng)液，剪成1 mm3組織碎塊，PBS清洗3次，轉(zhuǎn)入15 ml培養(yǎng)瓶，加入膠原酶和雙抗，37℃恒溫?fù)u床消化組織至光鏡下呈絮狀，離心棄上清，加入PBS反復(fù)吹打，離心棄上清，加入DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，鏡下可見貼壁腫瘤細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至80%融合，胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，70μm濾膜過濾，加入CD11b和F4/80（TAMs標(biāo)志物）抗體孵育，加入含0.1%BSA的預(yù)冷PBS 4℃孵育60 min，0.1%BSA的預(yù)冷PBS沖洗2次，1%多聚甲醛固定，流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者血清IL-18及OSCC腫瘤組織和癌旁組織IL-18表達(dá) ELISA結(jié)果顯示，OSCC患者血清IL-18水平［（81.2±11.6）pg/ml］顯著高于健康志愿者［（23.8±3.5）pg/ml］（P＜0.05）。免 疫 組 化 和Western blot結(jié)果顯示，OSCC腫瘤組織中IL-18表達(dá)顯著高于癌旁組織（P＜0.05，圖1）。

圖1 患者血清IL-18及OSCC腫瘤組織和癌旁組織IL-18表達(dá)Fig.1 IL-18 expressions in serum，tumor tissues and paracancerous tissues of patients

2.2 Tac8113-IL-18細(xì)胞系和裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建結(jié)果 慢病毒轉(zhuǎn)染OSCC細(xì)胞系Tac8113，Western blot檢測IL-18表達(dá)，結(jié)果顯示，Tac8113-IL-18細(xì)胞IL-18表達(dá)明顯高于Tac8113細(xì)胞（P＜0.05）。裸鼠尾靜脈注射Tac8113與Tac8113-IL-18細(xì)胞45 d后建模成功，脫頸處死裸鼠，取完整肺組織拍照保存［7］，結(jié)果顯示，Tac8113-IL-18細(xì)胞在小鼠肺部形成的轉(zhuǎn)移病灶數(shù)顯著多于Tac8113細(xì)胞（P＜0.05，圖2）。

圖2 Tac8113-IL-18細(xì)胞系和裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建Fig.2 Construction of TAC8113-IL-18 cell line and lung metastasis model in nude mice

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD11b和F4/80陽性（TAMs標(biāo)志物）表達(dá)細(xì)胞 流式細(xì)胞術(shù)檢測2組裸鼠肺部腫瘤組織體外培養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)果顯示，Tac8113-IL-18組腫TAMs數(shù)明顯多于Tac8113組（P＜0.05，圖3）。

圖3 Tac8113與Tac8113-IL-18細(xì)胞TAMs分布情況Fig.3 Distribution of TAMs in Tac8113 and Tac8113-IL-18 cells

2.4 ELISA檢測裸鼠血清CXCL9、CXCL10、CSF-1和CCL-2表達(dá) Tca8113-IL-18組小鼠血清CXCL9和CXCL10表達(dá)明顯低于Tca8113組，而CSF-1和CCL-2表達(dá)明顯升高（P＜0.05，圖4）。

圖4 血清CXCL9和CXCL10及CSF-1和CCL-2表達(dá)Fig.4 Expressions of CXCL9，CXCL10，CSF-1 and CCL-2 in serum

2.5 qRT-PCR檢測裸鼠腫瘤組織CXCL9、CXCL10、CSF-1和CCL-2表達(dá) Tca8113-IL-18組小鼠腫瘤組織中CXCL9和CXCL10表達(dá)明顯低于Tca8113組，而CSF-1和CCL-2表達(dá)明顯增加（P＜0.05，圖5）。

圖5 裸鼠腫瘤組織中CXCL 9、CXCL10、CSF-1和CCL-2表達(dá)Fig.5 Expressionsof CXCL9，CXCL10，CSF-1and CCL-2 in nudemousetumor tissues

2.6 Western blot檢測2組細(xì)胞系和裸鼠腫瘤組織CXCL9、CXCL10、AKT、P-AKT、mTOR和P-mTOR表達(dá) Tca8113-IL-18組小鼠腫瘤組織和細(xì)胞系中CXCL9、CXCL10表達(dá)降低，而P-AKT和P-mTOR表達(dá)升高（P＜0.05，圖6）。

圖6 在細(xì)胞系和腫瘤組織中CXCL9、CXCL10、P-AKT和P-mTOR表達(dá)Fig.6 CXCL9，CXCL10，P-AKT and P-mTOR expressions in cell lines and tumor tissues

3 討論

口腔癌是頭頸部常見腫瘤，以鱗狀細(xì)胞癌為高發(fā)，發(fā)病年齡呈年輕化，當(dāng)發(fā)生舌鱗狀細(xì)胞癌時，其診斷與治療更加棘手［15］。腫瘤微環(huán)境對腫瘤生長起重要作用，研究表明，無論是體外還是體內(nèi)，腫瘤微環(huán)境均可為腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為提供有利環(huán)境，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展［16］。巨噬細(xì)胞存在于腫瘤微環(huán)境，但其對腫瘤細(xì)胞，尤其是OSCC增殖調(diào)控作用如何，以及受何種因素調(diào)控尚未明確。研究表明，巨噬細(xì)胞來源的IL-6可誘導(dǎo)GSK3b磷酸化以穩(wěn)定β-catenin增強(qiáng)T細(xì)胞因子（TCF）依賴性基因激活腫瘤細(xì)胞［4］。IL-6也可增強(qiáng)炎癥反應(yīng)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌激活A(yù)KT及其下游抗凋亡促增殖基因。IL-18是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，其生物學(xué)功能尚未明確［17］。IL-18可通過p53激活NF-kB信號通路影響巨噬細(xì)胞作用［18-19］。但I(xiàn)L-18在OSCC中的作用鮮有報道。CXCL9和CXCL10作為CXC家族成員，在體內(nèi)起抑制腫瘤作用，CXCL9和CXCL10聚集的組織中，TAMs分布較少。

本研究探討IL-18在OSCC中的作用，臨床數(shù)據(jù)顯示，OSCC患者血清中IL-18含量遠(yuǎn)高于健康志愿者，說明IL-18對OSCC發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用。OSCC患者腫瘤組織和癌旁組織分析結(jié)果顯示，CXCL9和CXCL10在癌旁組織的分布明顯高于腫瘤組織，提示CXCL9和CXCL10是OSCC的抑癌基因。裸鼠肺組織轉(zhuǎn)移模型中，ELISA、qRT-PCR、Western blot結(jié)果顯示，CXCL9和CXCL10在Tca8113-IL-18裸鼠腫瘤組織中表達(dá)較低，說明IL-18可下調(diào)CXCL9和CXCL10表達(dá)。為驗證TAMs在OSCC組織中的作用，課題組檢測TAMs標(biāo)志物CD11b+F4/80結(jié)果顯示，Tca8113-IL-18裸鼠腫瘤組織中TAMs數(shù)明顯多于Tca8113組，說明IL-18可增強(qiáng)TAMs在腫瘤組織中的侵潤作用。為驗證CXCL9和CXCL10和TAMs的作用，課題組檢測TAMs分泌因子CSF-1和CCL-2表達(dá)結(jié)果顯示，腫瘤組織中CXCL9和CXCL10表達(dá)降低的同時CSF-1和CCL-2表達(dá)增高，提示CXCL9和CXCL10下調(diào)可促進(jìn)TAMs功能。PI3K/AKT/mTOR信號通路在CXCL1與IL-8促腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，Western blot結(jié)果顯示，無論是在IL-18高表達(dá)細(xì)胞系還是腫瘤組織中，P-AKT和P-mTOR表達(dá)均明顯增加，說明IL-18可能激活腫瘤組織中PI3K/AKT/mTOR信號通路，從而促進(jìn)OSCC增殖及肺部轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在OSCC中，IL-18可能通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路下調(diào)CXCL9、CXCL10表達(dá)，從而募集TAMs促進(jìn)OSCC肺部轉(zhuǎn)移病灶形成，為OSCC治理提供新的靶點和治療方案。