HLA-A2限制性CDKN1A編碼突變肽的預(yù)測及其在膀胱癌中的應(yīng)答性分析

王 晨 劉源涌 夏維敏 季 萍 余奇文 曹志偉 王 穎 沈海波

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院泌尿外科，上海200082）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，也是全身十大常見腫瘤之一。2020年美國最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，膀胱腫瘤約有81 400例新發(fā)病例，17 980例死亡病例［1］，中國2015年的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，膀胱腫瘤約有80 500例新發(fā)病例，32 900例死亡病例［2］。膀胱癌可以發(fā)生在任何年齡，且有兒童發(fā)病的報(bào)道，隨年齡增長，其發(fā)病率也在增加，高發(fā)年齡為60歲左右，男性膀胱癌發(fā)病率高于女性。2016年美國的一項(xiàng)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，35%的膀胱癌患者被診斷為侵襲性膀胱癌，5年生存率為70%，其中肌層浸潤型膀胱癌預(yù)后更差，5年生存率約為47%［3］。因此，提高膀胱癌的臨床診斷和治療手段仍然是泌尿外科面臨的重大挑戰(zhàn)。

二代測序技術(shù)產(chǎn)生的腫瘤基因組數(shù)據(jù)為研究腫瘤的進(jìn)化提供了越來越多的實(shí)證，其中通過分析腫瘤局部和正常組織（或是外周血）的全外顯子測序則為研究體細(xì)胞突變特征提供了直接的證據(jù)，由此產(chǎn)生的腫瘤新抗原譜的概念也在新技術(shù)的背景下應(yīng)運(yùn)而生［4］。相較于經(jīng)典的腫瘤相關(guān)抗原或是腫瘤特異性抗原的概念更加關(guān)注于完整抗原分子在腫瘤和正常組織中表達(dá)格局的差異，腫瘤新抗原則根據(jù)腫瘤產(chǎn)生過程中的突變累積理論，突出了在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中所出現(xiàn)的各種體細(xì)胞突變所產(chǎn)生的新抗原表位，通過二代測序技術(shù)和高通量生物信息學(xué)手段，獲得更加全面的由單核苷酸突變或是框移突變或是缺失導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞的突變譜，由此所獲得的抗原新表位既有腫瘤共性，也存在個(gè)性化［5-6］。這些突變的腫瘤新抗原一旦被提呈到細(xì)胞膜表面，就有可能被特異性的T細(xì)胞識別，成為抗腫瘤免疫應(yīng)答的最有功效的細(xì)胞［7］。近年來，在各類腫瘤中開展了腫瘤新抗原的篩選，并在實(shí)驗(yàn)動物的抗腫瘤研究中獲得良好結(jié)果，在小規(guī)模人群樣本中也得到驗(yàn)證［8-9］。如在小鼠腫瘤模型中（肺癌、卵巢癌、黑色素瘤等），腫瘤新抗原疫苗能夠引起足夠的T細(xì)胞反應(yīng)，控制腫瘤細(xì)胞生長，為腫瘤新抗原療法的臨床應(yīng)用提供了理論支撐［10］。在人類，基于腫瘤新抗原的腫瘤疫苗在黑色素瘤患者中顯示出一定的臨床抗腫瘤成效，即使未得到控制的患者，在聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療后，也達(dá)到臨床治愈的標(biāo)準(zhǔn)［11-12］。因此，基于腫瘤新抗原的免疫治療顯示出了良好的臨床應(yīng)用前景。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫中膀胱癌全外顯子數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)方法篩選獲得一個(gè)具有高表達(dá)量的基因CDKN1A存在HLA-A2限制性的突變位點(diǎn)，對該基因編碼的野生型和突變型肽段親和力進(jìn)行檢測，另外在中國膀胱癌人群中驗(yàn)證了肽段特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)性［7］。

1 材料與方法

1.1 材料 T2細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫，并在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存；IMDM完全培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素（PS）和磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Gibco公司；β2微球蛋白購自美國Sigma-Aldrich公司；抗原肽由上海生工公司合成；96孔U底板購自美國BD公司；PE-抗HLA-A2分子的抗體（克隆號BB7.2）購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 患者信息 本研究招募了140例于2017年9月至2019年6月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院泌尿外科接受手術(shù)治療的膀胱癌患者。術(shù)前采集全血20 ml，置于抗凝管中，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：①未使用免疫抑制劑；②病理證實(shí)的尿路上皮癌；③術(shù)前全血檢測為HLA-A2陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：①術(shù)前接受化療/放療的患者；②有血液病或自身免疫??；③缺乏臨床資料或?qū)嶒?yàn)室檢測資料。本研究共排除100例患者，其中HLA-A2陰性82例，4例為血液病或自身免疫病患者，6例患者缺乏臨床資料，8例患者的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)不完整。最后，共有40例患者被納入本研究，其臨床病理特征見表1。此項(xiàng)研究通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院倫理委員會的倫理論證，且所有參與研究的患者都已知情，并簽署知情同意書，研究程序遵循赫爾辛基宣言。

表1 40例HLA-A2陽性患者臨床特征的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述［±s，例（%）］Tab.1 Statistical description of clinical characteristics of 40 HLA-A2（+）patients［±s，n（%）］

表1 40例HLA-A2陽性患者臨床特征的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述［±s，例（%）］Tab.1 Statistical description of clinical characteristics of 40 HLA-A2（+）patients［±s，n（%）］

Characteristics Mean age±SD（year）Gender Male Female Pathology Pathologic tumor stage Ta，T1 T2 T3 T4 Pathologic nodal stage N0 Histology Urothelial carcinoma Cohort（n=40）68±13 33（82.5）7（17.5）32（80）4（10）3（7.5）1（2.5）40（100）40（100）

1.2.2 生物信息學(xué)篩選 412例膀胱癌全外顯子測序的突變數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//gdac.broadinstitute.org/），轉(zhuǎn)錄蛋白序列信息來源于美國國家生物信息學(xué)中心（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。對于存在突變序列的基因，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得蛋白質(zhì)序列，利用一個(gè)9肽的滑窗產(chǎn)生覆蓋突變氨基酸位點(diǎn)的突變肽段序列，相對應(yīng)的野生型肽段序列來自配對外周血的全外顯子數(shù)據(jù)。最后，利用NetMHCpan-3.0算法在線計(jì)算所有野生型及突變型肽段與HLA-A*02：01分子的結(jié)合力（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan-

3.0/）。按照結(jié)合力不同分成3類，其中結(jié)合力＜50為強(qiáng)結(jié)合，50～500為弱結(jié)合，＞500為無結(jié)合，選取突變型肽段強(qiáng)結(jié)合而對應(yīng)野生型肽段無結(jié)合的配對抗原肽，送合成。

1.2.3 體外親和力測定 T2細(xì)胞復(fù)蘇之后，在IMDM完全培養(yǎng)基（IMDM培養(yǎng)基+10%FBS和1%PS）中培養(yǎng)至第七代，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50 ml離心管中，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度0.5×106個(gè)/ml。在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，T2細(xì)胞（0.5×106個(gè)/ml）、β2微球蛋白和候選肽段在96孔U底板（美國BD公司）的200μl體系中共孵育4 h。L235肽段為陽性對照［13］，不加入肽段只包含T2細(xì)胞的IMDM完全培養(yǎng)基為陰性對照。

孵育結(jié)束后，使用流式細(xì)胞儀檢測T2細(xì)胞表面的HLA-A2分子表達(dá)量。T2細(xì)胞用PBS離心（2 000 r/min離心5 min）洗滌后，將T2細(xì)胞和PE-抗HLA-A2分子的抗體在4℃避光孵育40 min，孵育結(jié)束后再用PBS洗滌2次，洗去殘留的抗體后使用200μl PBS重懸，轉(zhuǎn)入流式管，使用FACSCantoⅡ流式儀收集細(xì)胞；采用FlowJo軟件（TreeStar公司）進(jìn)行分析，以平均熒光強(qiáng)度（MFI）來代表肽段刺激引起的T2細(xì)胞表面HLA-A2分子的表達(dá)量。

為了確認(rèn)候選肽段的親和力常數(shù)，我們將T2細(xì)胞、β2微球蛋白和不同濃度（0、0.4、2、10、20μg/ml）的HLA-A2限制性抗原肽共同孵育4 h后，經(jīng)PE-抗HLA-A2抗體標(biāo)記T2細(xì)胞后，由FACSCantoⅡ流式儀收集T2細(xì)胞并檢測細(xì)胞表面HLA-A2分子的表達(dá)，選擇以呈現(xiàn)50%的最強(qiáng)MFI的候選肽段濃度（即Kd值）來表示HLA-A2限制性候選肽段的親和力。擬合曲線的Kd值由Graphpad Prism 6.0軟件（Graphpad software Inc.，CA，USA）計(jì)算得出，用于代表抗原肽的親和力水平。

1.2.4 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn) 使用密度梯度離心法從新鮮采集的膀胱癌患者20 ml全血中分離外周血單 個(gè) 核 細(xì) 胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）。在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，用肽段（2μg/ml）在37℃下刺激PBMCs（0.25×106個(gè)/孔）20 h。孵育結(jié)束后收集細(xì)胞，按照說明書（human IFN-γELISpot kit，U-CyTech，Utrecht，Netherlands）檢測抗原肽特異性IFN-γ分泌量。板晾干后用ELISpot計(jì) 數(shù) 儀（BioReader Model 4000；Bio-Sys GmbH，Karben，Germany）對斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。以單個(gè)肽段每2.5×105個(gè)細(xì)胞的斑點(diǎn)形成單位（spot forming units，SFUs）減空白對照的斑點(diǎn)形成單位計(jì)算抗原肽特異性IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS21軟件（IBM SPSS Software，USA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDKN1A突變抗原肽的預(yù)測 根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫分析，CDKN1A基因在膀胱癌中的表達(dá)量為115.12，位于較高方位。利用TCGA數(shù)據(jù)中412例膀胱癌和配對外周血，結(jié)合美國國家生物信息學(xué)中心的序列檢索和突變位點(diǎn)與HLA-A*0201的親和力預(yù)測，我們篩選獲得了一個(gè)在膀胱癌中高表達(dá)的基因CDKN1A，其在腫瘤全外顯子測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)272位含有1個(gè)錯(cuò)義突變，所產(chǎn)生的突變肽段FVTETPLEV和外周血中的野生型抗原肽相比，第61位的氨基酸殘基從G變?yōu)閂，使其與HLA-A*0201的預(yù)測親和力提高了600倍（表2）。

表2 CDKN1A基因編碼的HLA-A*02：01限制性預(yù)測肽段的信息Tab.2 Information of CDKN1A coded HLA-A*02：01 restricted prediction peptides

2.2 CDKN1A突變抗原肽的親和力測定 將上述兩個(gè)抗原肽合成后，我們進(jìn)一步采用T2細(xì)胞進(jìn)行親和力的體外測定，將兩個(gè)抗原肽分別和T2細(xì)胞共培養(yǎng)4 h后，與CDKN1A突變肽段孵育的T2細(xì)胞表面HLA-A2分子的MFI顯著高于野生型抗原肽段的MFI，顯示突變肽段與HLA-A2分子的親和力要顯著高于野生型肽段，與生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果一致（圖1）。當(dāng)將不同濃度的突變型和野生型抗原肽分別與T2細(xì)胞共孵育之后，突變型抗原肽隨著孵育濃度的增加，其MFI的值也隨之升高，而野生型抗原肽的MFI并未隨濃度變化而增大。對不同濃度的突變型肽段MFI進(jìn)行曲線擬合和計(jì)算后，CDKN1A突變型抗原肽的Kd值為3.724 mg/ml（圖2）。

圖1 CDKN1A突變型和野生型抗原肽與HLA-A2的結(jié)合力測定Fig.1 Detection of affinity between CDKN1A coded peptides and HLA-A2 molecule

圖2 基于T2細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)的抗原肽親和力常數(shù)測定Fig.2 Determination of affinity constant of peptide based on T2 cell experiment in vitro

2.3 CDKN1A突變型和野生型抗原肽在膀胱癌患者中的免疫反應(yīng)性評價(jià) 我們在40例HLA-A2陽性膀胱癌患者中進(jìn)行外周突變型和野生型抗原肽特異性免疫反應(yīng)測定，將外周PBMCs分別用野生型和突變型抗原肽刺激后，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)檢測CDKN1A野生型和突變型抗原肽特異性分泌IFNγ的細(xì)胞數(shù)（SFUs）（圖3）。結(jié)果顯示，在40例膀胱癌患者中，具有突變型抗原肽特異性的陽性反應(yīng)率（SFUs＞5）為25%（10/40），而野生型抗原肽特異性的陽性率為7.5%（3/40），兩組反應(yīng)率之間有顯著性差異（P=0.034）。

圖3 CDKN1A基因編碼突變型和野生型抗原肽在40例HLA-A2（+）膀胱癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的特異性免疫反應(yīng)檢測Fig.3 Immunoreactivity of CDKN1A coded WT and MT peptides which detected in 40 HLA-A2（+）bladder cancer patients peripheral blood mononuclear cells

進(jìn)一步比較40例患者中陽性反應(yīng)性的突變型和野生型抗原肽特異性的平均SFUs，結(jié)果如圖4所示突變型抗原肽特異性的SFUs為4.16，野生型抗原肽特異性的SFUs為2.44，兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.045）。上述結(jié)果表明，CDKN1A突變型抗原肽在膀胱癌患者外周的免疫反應(yīng)性要高于野生型抗原肽。

圖4 CDKN1A突變型和野生型抗原肽的應(yīng)答水平比較Fig.4 Comparison of CDKN1A coded MT and WT peptide response

3 討論

本研究利用TCGA公共數(shù)據(jù)庫中的WES數(shù)據(jù)篩選獲得了在膀胱癌中高表達(dá)的CDKN1A基因編碼的HLA-A2限制性的突變型抗原肽，該肽段和野生型肽段相比，具有和HLA-A2分子更高的結(jié)合力，并在膀胱癌患者外周表現(xiàn)出較高和較為廣泛的免疫反應(yīng)性，為將該突變抗原肽應(yīng)用于臨床提供了理論基礎(chǔ)。

CDKN1A基因全稱為細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑-1A，該基因編碼的蛋白屬于強(qiáng)效的細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑，又稱為p21蛋白，p21蛋白可與細(xì)胞周期依賴性激酶CDK2或者CDK4復(fù)合物結(jié)合并抑制其活性，在G1期發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用［14］。該基因的表達(dá)受抑癌蛋白p53的嚴(yán)格控制，通過p53介導(dǎo)的細(xì)胞周期G1期阻滯，以應(yīng)對各種應(yīng)激刺激［15］。CDKN1A基因是膀胱癌腫瘤抑制基因，該基因突變與膀胱癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16］。伴隨著CDKN1A基因在腫瘤細(xì)胞中的突變，不僅會影響其生物學(xué)功能，同時(shí)所產(chǎn)生的突變型位點(diǎn)導(dǎo)致的突變抗原肽也可能成為腫瘤新抗原，被T細(xì)胞識別，導(dǎo)致T細(xì)胞的激活和特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。本研究通過生物信息學(xué)的方法，獲得了在膀胱癌中多個(gè)CDKN1A基因的突變位點(diǎn)，其中預(yù)測能夠與HLA-A2結(jié)合的抗原肽僅此一對，分析該突變位點(diǎn)，可以發(fā)現(xiàn)雖然位于編碼區(qū)，但是并不影響蛋白功能。而由此產(chǎn)生的HLA-A2限制性的突變抗原肽成為具有應(yīng)用潛力的腫瘤新抗原的候選抗原肽，不僅具有比野生型抗原肽更高的與HLA-A2的結(jié)合力（親和力），同時(shí)在膀胱癌患者中具有較廣的免疫反應(yīng)性和免疫應(yīng)答水平。

另外我們也注意到，WT抗原肽在膀胱癌患者的PBMC中也刺激產(chǎn)生了少量的免疫應(yīng)答。最近發(fā)表的一項(xiàng)關(guān)于從健康人體內(nèi)獲取腫瘤新抗原特異性T細(xì)胞的研究，表明腫瘤新抗原對應(yīng)的野生型肽段也能夠誘導(dǎo)與突變型肽段反應(yīng)類似的抗原特異性T細(xì)胞［17］，這表明野生型肽段本身也具有一定程度的免疫原性，能夠部分支持我們在膀胱癌患者中檢測到WT特異性T細(xì)胞反應(yīng)的結(jié)果。

一項(xiàng)針對TCGA數(shù)據(jù)庫中的膀胱癌分子特征的研究，顯示膀胱癌中的高突變負(fù)荷主要來源于載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽（apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide，APOBEC）家族介導(dǎo)的基因突變，具有APOBEC相關(guān)突變特征的膀胱癌患者的5年生存率達(dá)到了75%，高突變負(fù)荷帶來的大量腫瘤新抗原也為膀胱癌患者的生存提供了獲益［18］。另一項(xiàng)針對腫瘤新抗原反應(yīng)性的腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）的研究，表明膀胱癌中存在腫瘤新抗原反應(yīng)性TILs，這可能有助于解釋免疫檢查點(diǎn)抑制劑在膀胱癌中有效的原因，也為未來靶向新抗原的過繼性T細(xì)胞治療提供了理論依據(jù)［19］。

在此項(xiàng)研究中篩選獲得的腫瘤新抗原，可以作為治療性疫苗開展臨床應(yīng)用，如黑色素瘤、胰腺癌等，有臨床研究在黑色素瘤中篩選得到潛在的腫瘤新抗原，制備成為疫苗后，回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，大多數(shù)患者的黑色素瘤得到控制，未得到控制的患者經(jīng)過免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療后，也達(dá)到臨床治愈的標(biāo)準(zhǔn)［11］。更重要的是隨著免疫檢查點(diǎn)抑制劑在包括膀胱癌在內(nèi)的多種腫瘤中的臨床治療的成功［20］，將所篩選獲得腫瘤新抗原聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑的應(yīng)用也正成為腫瘤免疫治療聯(lián)合應(yīng)用的策略之一，如卵巢癌、黑色素瘤等，研究發(fā)現(xiàn)接受腫瘤新抗原和免疫檢查點(diǎn)抑制劑組合治療的卵巢癌患者表現(xiàn)出了較好的臨床獲益，同時(shí)在卵巢癌小鼠模型中，聯(lián)合使用腫瘤新抗原疫苗明顯提高了免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療效果［21］。

在此項(xiàng)研究中，我們只挑選了CDKN1A基因編碼的HLA-A*02：01限制性肽段進(jìn)行了合成，還有其他HLA亞型限制的肽段未納入我們的研究范圍。另有研究表明，MHC-Ⅱ類分子限制的肽段（主要引起CD4+T細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答）也有可能成為腫瘤新抗原，但是MHC-Ⅱ類分子的結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，表位長度更長，變量更多，并且需要更多的數(shù)據(jù)來支撐模型，所以預(yù)測算法尚未完善。

我們所篩選獲得的CDKN1A基因編碼突變抗原肽可以直接用于治療性疫苗的臨床研究，通過對患者組織樣本中CDKN1A基因突變的篩查，進(jìn)行個(gè)性化的疫苗使用或是和免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用，從而為膀胱癌的臨床治療提供更有針對性的方案。