銀杏內(nèi)酯A對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用①

楊鵬偉 劉春云 穆秉桃 于婧文 肖保國 馬存根 （山西中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點研究室神經(jīng)生物學(xué)研究中心，山西中醫(yī)藥大學(xué)，太原030024）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）通常被定義為由T細(xì)胞參與介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）慢性炎癥性疾病，病變可累及大腦和脊髓，表現(xiàn)為局灶性斑塊形成、軸突變性和神經(jīng)元丟失等［1］。MS的病理機制尚不明確，目前多應(yīng)用實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE），一種表現(xiàn)出與MS相似病理與臨床癥狀的動物模型，來探究MS的自身免疫相關(guān)機制。目前認(rèn)為，外周血中髓鞘特異性T細(xì)胞向CNS的遷移是EAE病程的起點，T細(xì)胞通過破壞的血腦屏障，同中樞免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞）相互作用，促使炎癥性微環(huán)境形成，損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞和軸突，導(dǎo)致脫髓鞘和神經(jīng)元功能障礙［2］。研究表明CD4+T細(xì)胞在EAE病理中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因CD4+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子功能不同，分為致炎型Th1/Th17細(xì)胞和抗炎型Th2/Tregs細(xì)胞，因此，調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞亞群間平衡，維持自身免疫微環(huán)境穩(wěn)定，是緩解EAE臨床癥狀的有效手段［3］。

血小板活化因子（platelet activing factor，PAF）是一種具有廣泛生物活性的磷脂類遞質(zhì)，涉及多種病理反應(yīng)，如神經(jīng)損傷、動脈粥樣硬化、哮喘等［4］。近年來，天然PAF拮抗劑因其安全性較高和毒副作用小的特點，受到國內(nèi)外研究者的廣泛重視，在對缺血性腦卒中的治療中，PAF拮抗劑表現(xiàn)出很好的抗炎和神經(jīng)保護作用，減輕神經(jīng)損傷，促進恢復(fù)期的神經(jīng)功能恢復(fù)［5］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，銀杏內(nèi)酯A（Ginkgolide A，GA），一種提取自銀杏葉的天然PAF拮抗劑，在改善CNS疾病上展現(xiàn)潛力。例如GA對腦缺血引起的損傷具有神經(jīng)保護作用，能夠減輕海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡等［6］。在四氯化碳誘導(dǎo)的肝硬化模型和脂多糖誘導(dǎo)的炎癥模型中，GA也表現(xiàn)出很好的抗炎作用［7］。本研究觀察GA對EAE小鼠T細(xì)胞各亞群的影響，探討GA改善EAE的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8～10周齡的雌性C57BL/6小鼠，體重18～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要試劑 髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55（myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55，MOG35-55）由西安聯(lián)美生物科技有限公司提供；完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）購自美國Sigma公司；百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）購自瑞士ENZO公司；結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，TB）購自美國BD公司；FITC標(biāo)記的CD4抗體、PE標(biāo)記的IL-17、IL-10、IFN-γ和TGF-β購自美國eBioscience公司；IL-17、IFN-γ、GAPDH一抗購自美國Abcam公司；HRP-goat antirabbit IgG二抗購自美國Pierce公司；GA購自上海嘉遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 冰凍切片機（Leica，型號：CM1950）；流式細(xì)胞儀（BD Biosciences，型號：BD FACSCaliburTMFlow Cytometer 342976）；高速冷凍離心機（Sigma，型號：3-18K）；光學(xué)熒光顯微鏡（Olympus，型號：BX51）；超聲波破碎儀（Sonics，型號：VCX800）；凝膠成像分析儀（Bio-Rad，型號：Universal HoodⅡ）。

1.2 方法

1.2.1 模型的制備 實驗前將小鼠在無病原菌動物房飼養(yǎng)1周，給予小鼠常規(guī)的飼料和水。動物房環(huán)境為（25±2）℃，晝夜循環(huán)12 h。將小鼠按體質(zhì)量分為3組，正常對照組（healthy control group，HC）、EAE對照組（EAE control group，EC）和EAE治療組（EAEtreatment group，ET），8只/組。生理鹽水溶解MOG35-55粉末，與含有結(jié)核桿菌素（TB）的完全弗氏佐劑等體積（1∶1）混合，于冰上用針管混合器反復(fù)抽推2 h形成油包水樣抗原乳劑。以0.1 ml/只在EC和ET組小鼠脊柱兩側(cè)皮下分4點注射抗原乳劑。并于免疫當(dāng)天和免疫后48 h分別腹腔注射PTX（350 ng/只）以增強免疫反應(yīng)。小鼠尾部張力下降，即為EAE開始發(fā)病，表明模型制備成功。

1.2.2 給藥和臨床觀察 將GA溶解于二甲基亞砜（DMSO），并以生理鹽水稀釋至DMSO終濃度為1.5%，ET組以15 mg/（kg·d）灌胃給藥，劑量為0.2 ml/（次·只）。從免疫后第10天持續(xù)至免疫后第28天，EC和HC組則給予同體積生理鹽水。2位實驗員每天記錄各組每只小鼠的體重和臨床癥狀，神經(jīng)功能評分標(biāo)準(zhǔn)采用國際通用的Kono 5分法，癥狀介于兩者標(biāo)準(zhǔn)之間者以±0.5分計。0分：不發(fā)??；1分：尾部張力降低；2分：尾部拖地，蹣跚步態(tài)；3分：后肢癱瘓；4分：四肢癱瘓，爬行明顯減少；5分：瀕臨死亡或死亡［8］。

1.2.3 標(biāo)本制備 免疫后第28天，取各組4只小鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉，滅菌器械無菌操作下取小鼠脾臟，置于裝有DMEM培養(yǎng)液的15 ml離心管。打開小鼠胸腔剪開右心耳，將注射器針頭刺入左心尖，推注生理鹽水觀察至肝發(fā)白，冰上快速取小鼠脊髓，置于-80℃冰箱保存待用。另各組取4只小鼠，麻醉后先推注生理鹽水，再用4%多聚甲醛灌注固定，冰上迅速取脊髓組織，OCT包埋后用液氮快速冷凍，冰凍切片機將標(biāo)本切成10μm切片，后續(xù)將脊髓冰凍切片行常規(guī)HE和LFB染色。

1.2.4 脾臟單個核細(xì)胞制備 將脾臟置于培養(yǎng)皿中沖洗后，置于40μm尼龍篩網(wǎng)上倒少許DMEM培養(yǎng)液，用一次性注射針針柄端研磨，收集細(xì)胞混懸液，離心棄上清，重懸脾細(xì)胞加ddH2O和2.7%NaCl（2∶1）破紅細(xì)胞膜，取出各組絮狀物配平離心，棄上清重懸，制備成單個核細(xì)胞（mononuclear cells，

MNCs）。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞 細(xì)胞計數(shù)后，1×PBS清洗各組MNCs，棄上清重懸后各取3×106個/ml MNCs懸于50μl 1%BSA-PBS緩沖液或50μl 0.1%saponin破膜劑，加1μl FITC-CD4+PE-IL-10、PEIFN-γ、PE-TGF-β和PE-IL-17抗體，室溫避光孵育30 min。隨后加3 ml PBS清洗2次，離心后棄去洗液，加入300μl PBS將底部細(xì)胞混勻，避光待流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 Western blot 將各組EP管中的脊髓剪碎，加預(yù)冷的裂解液置于冰上，超聲波破碎儀裂解組織，冰上靜置10 min。4℃下12 000 r/min離心5 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度后加loading buffer上樣緩沖液，煮沸7 min使蛋白變性。制備SDS-PAGE 10%分離膠和5%濃縮膠，上樣后，先調(diào)至70 V電壓跑膠，待蛋白跑至分離膠將電壓調(diào)為110 V，直至凝膠底部，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，穩(wěn)流200 mA約2 h，將膜放入TBST清洗3次，5 min/次，洗后加5%脫脂奶粉封閉2 h，再加入脫脂奶稀釋的IL-17（1∶1 000）、IFN-γ（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）一抗，置于4℃孵育過夜。第2天TBST洗膜后孵育相應(yīng)二抗，HRP偶聯(lián)羊抗兔IgG（1∶10 000）室溫孵育2 h，洗滌3次后凝膠成像分析儀成像，Image-Lab分析條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 原始數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism軟件進行分析，體重和臨床平均分?jǐn)?shù)采用秩和檢驗，其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GA延遲EAE小鼠的發(fā)病時間并緩解其臨床癥狀 免疫后第11天左右，EAE小鼠逐漸出現(xiàn)行為學(xué)變化，從尾部下垂無力、步態(tài)失調(diào)發(fā)展至后肢癱瘓、爬行減少，并伴隨形體消瘦、精神萎靡。如表1所示，EC組發(fā)病率為100%，平均最高臨床評分為（3.31±1.75）分，平均發(fā)病時間為（12.25±1.20）d；與EC組相比，ET組小鼠發(fā)病率較低，平均發(fā)病時間延緩，平均最高臨床評分顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。同時與HC組相比，EC組小鼠體重丟失伴隨臨床癥狀加重；與EC組相比，ET治療組小鼠體重減輕程度較?。≒＜0.05），臨床評分較低（P＜0.05，P＜0.01），表明GA治療可減輕EAE小鼠臨床癥狀（圖1）。

圖1 各組平均臨床評分和體重變化Fig.1 Mean clinical scores and weight changes in each group

表1 HC、EC、ET組臨床發(fā)病情況（xˉ±s，n=8）Tab.1 Clinical morbidity in HC，EC and ET groups（xˉ±s，n=8）

2.2 GA緩解EAE小鼠脊髓病理變化 正常小鼠脊髓切片HE染色下炎癥細(xì)胞浸潤較少，LFB染色下髓鞘組織完整；EC組小鼠表現(xiàn)出典型病理特征，炎癥細(xì)胞大量浸潤（P＜0.01），白質(zhì)區(qū)髓鞘脫失（P＜0.001）。與EC組相比，ET治療組可有效抑制炎癥細(xì) 胞 浸 潤（P＜0.05），減 輕 髓 鞘 脫 失 程 度（P＜0.001）。見圖2、3。

圖2 各組小鼠脊髓HE染色Fig.2 Spinal cord of mice in each group was stained with HE

2.3 GA調(diào)節(jié)外周T細(xì)胞亞群 免疫后第28天制備脾MNCs，檢測各組T細(xì)胞亞群變化，如圖4所示，與EC組相比，ET組IL-10和TGF-β的CD4+T細(xì)胞亞群比例表達(dá)上調(diào)（P＜0.000 1），IL-17和IFN-γ的CD4+T細(xì)胞亞群比例表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。結(jié)果表明，GA能夠調(diào)節(jié)外周T細(xì)胞亞群Th1/Th17和Th2/Tregs的平衡。

圖4 GA調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞亞群比例Fig.4 GA regulatesproportion of CD4+T cell subsets

2.4 GA影響EAE脊髓IL-17和IFN-γ表達(dá) Western blot顯示，EC組脊髓內(nèi)炎癥因子IL-17和IFN-γ表達(dá)較高，與EC組相比，ET治療后可抑制IL-17（P＜0.01）和IFN-γ（P＜0.05）表達(dá)，見圖5。

圖3 各組小鼠脊髓LFB染色Fig.3 Spinal cord of mice in each group was stained with LFB

圖5 GA抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)Fig.5 GA inhibits expressions of inflammatory cytokines

3 討論

MS病機復(fù)雜，又兼具高致殘性和易復(fù)發(fā)性的特點，臨床尚無特效藥能治愈?，F(xiàn)有治療MS的有效藥如：IFN-β，可抑制IFN-γ，減少Th1細(xì)胞活化生成；納塔利珠單抗，能阻止B細(xì)胞和T細(xì)胞遷移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)；米托蒽醌，可抑制淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞遷移，下調(diào)TNF-α和IFN-γ的分泌等［9］。這些藥物通過影響外周免疫細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤，調(diào)節(jié)炎癥誘導(dǎo)型Th1/Th17和炎癥修復(fù)型Th2/Treg細(xì)胞的失衡，從而降低復(fù)發(fā)緩解期多發(fā)性硬化（RRMS）的復(fù)發(fā)率。EAE是一種經(jīng)典的RRMS小鼠模型，表現(xiàn)出與MS相似的病理特征，如外周免疫細(xì)胞激活、血腦屏障破壞、CNS中炎癥浸潤、軸突變性和髓鞘損傷等，常用作MS的病理研究和藥物篩選［10］。近期研究表明，苦參素通過調(diào)節(jié)炎癥誘導(dǎo)型細(xì)胞Th1/Th17分化下調(diào)細(xì)胞因子IL-17和IFN-γ分泌，從而緩解EAE病程［11］；S1PR1基因慢病毒通過S1P/S1PR1信號通路使T細(xì)胞遷移受阻，改善EAE發(fā)?。?2］。因此，針對MS病理起始階段的干預(yù)，即減少外周免疫細(xì)胞向中樞遷徙浸潤，調(diào)節(jié)其不同表型介導(dǎo)的炎癥性微環(huán)境的穩(wěn)定，仍為治療MS的有效手段。

近年來，黃芪甲苷、雷公藤甲素、穿心蓮內(nèi)酯等萜類天然產(chǎn)物對EAE小鼠病程表現(xiàn)出較好的干預(yù)作用，具有療效好、作用明確、潛在安全性好等生物活性特點，可能在治療EAE的實驗研究中開辟新的領(lǐng)域［13-14］。銀杏內(nèi)酯為萜類化合物，其有效成分GA亦是高效的PAF受體拮抗劑，在多種炎癥及免疫疾病的研究中，GA的抗炎和神經(jīng)保護作用得以證實［6-7］。目前，尚無有關(guān)GA對EAE小鼠療效的探究，盡管GA具有較強的生物活性，然而最新研究提出GA的溶解性和滲透性差，導(dǎo)致其生物利用度較低，結(jié)合其應(yīng)用劑型局限性的特點，本實驗采用口服給藥以探究GA對EAE小鼠的療效［15］。

本研究應(yīng)用GA在EAE病程初期進行干預(yù)治療，結(jié)果表明ET組發(fā)病率低于EC組，延緩了EAE小鼠的平均發(fā)病時間，在臨床癥狀方面，ET組臨床評分相比EA組較低，各組體重趨勢與臨床癥狀嚴(yán)重程度相對應(yīng)，證實GA干預(yù)治療可有效緩解EAE小鼠的臨床癥狀。MS患者的脫髓鞘發(fā)生在大腦和小腦皮質(zhì)，而EAE主要影響脊髓白質(zhì)區(qū)，并伴有由淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞構(gòu)成的炎癥性病變，外周浸潤的淋巴細(xì)胞可因抗原提呈作用介導(dǎo)炎癥反應(yīng)擴大，造成少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元損傷，最終導(dǎo)致髓鞘破壞［16］。HE和LFB染色結(jié)果顯示，與EC組相比，ET組的炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)量較少，髓鞘脫失程度較輕，提示GA能夠抑制免疫細(xì)胞在中樞的募集，進而減輕炎性微環(huán)境對髓鞘的損傷。

EAE的發(fā)病機制與CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答密切相關(guān)，CD4+T細(xì)胞經(jīng)活化分化為不同的效應(yīng)亞群：Th1細(xì)胞參與機體對細(xì)胞病原體的防御，可由IL-12、IFN-γ誘導(dǎo)分化，其分泌的IFN-γ能夠激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮（NO），促進炎癥反應(yīng)和組織損傷［17］；Th2細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-10等，其中IL-10通過調(diào)節(jié)參與抗原提呈的細(xì)胞因子和分子的表達(dá)控制炎癥，IL-10可抑制單核細(xì)胞中細(xì)胞因子和趨化因子TNF、IL-1和IL-12產(chǎn)生，抑制Th1細(xì)胞分化［18］；Th17細(xì)胞是有效的細(xì)胞介導(dǎo)效應(yīng)器，其分泌的IL-17是參與EAE炎癥的重要介質(zhì)，IL-17可通過誘導(dǎo)黏附分子、促炎細(xì)胞因子、趨化因子表達(dá)促進炎癥［19］；Treg可通過分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10或TGF-β抑制炎癥和免疫反應(yīng)，在無明顯炎癥的情況下，TGF-β促進Treg細(xì)胞分化，而在促炎因子IL-6的協(xié)同下，TGF-β參與Th17細(xì)胞的誘導(dǎo)，因此維持Th17/Treg的平衡對改善EAE病程至關(guān)重要［20］。脾臟MNCs是影響EAE的主要外周免疫細(xì)胞，為探討GA治療EAE小鼠的細(xì)胞分子機制，本實驗采用流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟MNCs的CD4+T細(xì)胞各亞群比例，結(jié)果證實GA可有效抑制CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+T細(xì)胞比例，并增強CD4+IL-10+和CD4+TGF-β+T細(xì)胞表達(dá)。GA對EAE的免疫調(diào)節(jié)機制是通過促進致炎型Th1和Th17細(xì)胞向調(diào)節(jié)型Th2和Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化實現(xiàn)的。

T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥是EAE的病機核心，控制炎癥的策略除了調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞分化外，還有減少CD4+T細(xì)胞向CNS遷移。研究表明IFN-γ可上調(diào)MHCⅡ類分子和內(nèi)皮細(xì)胞上的黏附分子，促進T細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷移；此外，IL-17能誘導(dǎo)趨化因子產(chǎn)生，通過促進免疫細(xì)胞向CNS滲透，在傳播炎癥方面發(fā)揮作用［21］。本實驗結(jié)果表明，GA可抑制脊髓中IL-17和IFN-γ表達(dá)，通過抑制炎癥細(xì)胞因子釋放，減少CD4+T細(xì)胞向中樞募集，維持中樞微環(huán)境穩(wěn)定，避免EAE炎癥進一步擴大。

綜上所述，GA能改善EAE的臨床癥狀，減少CNS炎癥和髓鞘脫失情況，其作用機制可能與下調(diào)外周Th1/Th17致炎細(xì)胞、增強Th2/Treg調(diào)節(jié)性細(xì)胞表達(dá)、抑制炎癥細(xì)胞因子IL-17和IFN-γ對中樞炎性微環(huán)境的促成有關(guān)。本研究為今后GA治療EAE的免疫機制研究提供了實驗依據(jù)。