免疫球蛋白對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬神經(jīng)元損傷修復的作用

劉 濤 李玉強 王賢君 張澤立（山東省濟南市第三人民醫(yī)院神經(jīng)外科，濟南250132）

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是常見出血性腦血管疾病，致死率極高，流行病學研究顯示，美國腦血管疾病患者中約5%為SAH，且發(fā)病率呈上升趨勢［1］。SAH后神經(jīng)元損傷及遲發(fā)性腦血管痙攣（cerebral vasospasm，CV）是導致SAH患者死亡及殘疾的主要原因，而神經(jīng)元損傷、CV發(fā)生受氧化應激、炎癥反應及神經(jīng)元細胞凋亡等影響［2］。研究顯示，控制SAH患者病情，預防再出血、血管痙攣及腦積水等并發(fā)癥，是降低SAH致殘率及致死率的關鍵［3］。臨床常采用抗纖維蛋白溶解液、鈣通道阻滯劑、甘露醇、鎮(zhèn)靜藥物等常規(guī)藥物治療SAH，雖然可一定程度緩解患者臨床癥狀，但效果并不理想，暫時尚無特效防治藥物［4］。免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）不僅可與抗原特異性結合，還具有固定補體、調理單核巨噬細胞吞噬能力功能；此外，研究顯示，Ig可非特異性增強抑制性T細胞功能，間接抑制炎癥因子產(chǎn)生［5-6］。Ig對腦外傷、腦出血等多種疾病具有神經(jīng)保護作用，但其對SAH神經(jīng)元的保護作用及具體機制尚未明確。本研究建立SAH大鼠模型，給予不同劑量Ig治療，觀察Ig對大鼠SAH的影響，為SAH治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性清潔級SD大鼠50只，購自山東大學醫(yī)學院動物實驗中心，6～9周齡，平均（7.05±1.02）周，體重0.17～0.24 kg，平均（0.21±0.03）kg，標準環(huán)境下飼養(yǎng)，每12 h晝夜交替1次，飲水及食物充足。

1.1.2 主要試劑 Ig購自四川遠大蜀陽藥業(yè)（300 mg/瓶）；TUNEL凋亡試劑盒購自萬類生物公司；抗胱天蛋白酶3（cysteinyl aspartate-specific proteinase-3，caspase-3）抗體購自深圳達科為生物技術有限公司；磷酸化氨基末端蛋白激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，P-JNK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷酸化c-Jun（phosphorylated c-Jun，p-c-Jun）購自美國Sigma公司；免疫組織化學試劑盒購自北京中杉會橋生物技術有限公司；蛋白分析試劑盒及發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器 切片架購自德國萊卡公司；JW-3021HR型高速臺式離心機購自安徽嘉文儀器裝備公司；顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；EppendollF移液器購自廣州威佳公司；石蠟切片機、BMJ-Ⅲ型包埋機、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀購自常州中威電子儀器廠；S60電熱恒溫水溫箱購自北京市醫(yī)療設備廠；AniRes2005軟件分析系統(tǒng)購自北京貝蘭博科技有限公司；培養(yǎng)箱購自雙捷實驗儀器廠；外科手術器械購自上海市器械廠；電子秤及低溫冰箱購自北京正開儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及處理 SD大鼠常規(guī)適應性飼養(yǎng)7 d，隨機選擇10只作為空白對照組，剩余40只建立SAH模型，建模成功后隨機分為4組，每組10只，分別設為模型組、Ig低劑量［0.2 g/（kg·d）］組、Ig中劑量［0.3 g/（kg·d）］組、Ig高劑量［0.4 g/（kg·d）］組。

1.2.2 造模 采用枕大池自體血二次注血法制作模型，所有大鼠進食12 h后，稱重，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg），常規(guī)消毒鋪巾，大鼠取仰臥位固定于手術臺，手輕觸大鼠股動脈，沿動脈波動邊緣剪開大鼠皮下組織，分離血管神經(jīng)，充分暴露于右側股動脈，備用，于即將穿刺點近心端預留結扎線，棉球壓迫止血；取大鼠俯臥位，暴露枕外隆突，沿該方向作3 cm左右切口，仔細分離肌肉，充分暴露枕環(huán)膜，采用事先經(jīng)肝素鈉鹽水沖洗后的注射器從右側股動脈抽取0.3 ml左右血液，并通過預留線結扎；于3 min內(nèi)沿環(huán)枕膜緩慢注入，針頭拔出后，采用明膠海綿封閉針口，逐層縫合切口。24 h后采用同樣方式抽取另一側股動脈血液注入枕大池。完成后，取頭低位30 min，便于血液均勻分布于蛛網(wǎng)膜下腔；空白對照組顱內(nèi)注入0.3 ml生理鹽水；制備完成后，密切關注大鼠行為及飲食情況。建立大鼠SAH模型手術結束后48 h，將所有大鼠按照上述辦法麻醉后，取仰臥位，剪開胸腔、左心室，插入導管固定，剪開右心耳，快速灌流，首先灌流生理鹽水500 ml，排空全身血液，后灌入4%多聚甲醛500 ml，結束后開顱取腦，置于多聚甲醛溶液中固定48 h，取海馬組織，石蠟包埋切片，備用。

1.2.3 尼氏（Nissl）染色觀察大鼠神經(jīng)元破壞情況 取常規(guī)石蠟包埋的大鼠海馬組織，切4 um片，浸入0.5%明膠中，用毛刷將組織片貼到載玻片上，自然風干；常規(guī)脫蠟水化后，將組織片置于0.5%甲苯胺藍或焦油紫中室溫下染色30 min，蒸餾水沖洗3次，依次浸入75%、80%、95%乙醇中；置于特殊分色液中分色15 s，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4 TUNEL染色檢測細胞凋亡 切片常規(guī)脫蠟、水化，30 ml/L過氧化氫抑制內(nèi)源性過氧化氫酶；切片浸泡于組織預處理液中20 min，吸干周圍水分，滴加試劑盒內(nèi)終止反應緩沖液終止反應；滴加過氧化物酶標記的抗體，孵育，顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精復染，常規(guī)脫水、透明、封片。計算海馬細胞凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)。

1.2.5 免疫組織化學染色檢測Bcl-2、caspase-3表達 海馬組織石蠟切片進行常規(guī)脫蠟、水化，微波爐抗原修復、30 ml/L去離子雙氧水、血清封閉；加入兔抗caspase-3抗體，孵育過夜，洗滌，加入抗兔IgG孵育30 min；顯色后，蒸餾水沖洗，蘇木精復染，常規(guī)脫水、透明、封片。顯微鏡400倍下拍照，選擇陽性細胞表達明顯區(qū)域的5個相鄰視野區(qū)，分別計算各視野區(qū)域的陽性細胞數(shù)及總細胞數(shù)，以陽性細胞百分率（陽性細胞百分率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%）平均值作為Bcl-2表達；AniRes2005軟件分析caspase-3蛋白條帶光密度，caspase-3光密度與面積比值作為海馬組織神經(jīng)細胞caspase-3蛋白表達。胞百分率（陽性細胞百分率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%）平均值作為Bcl-2表達；AniRes2005軟件分析caspase-3蛋白條帶光密度，caspase-3光密度與面積比值作為海馬組織神經(jīng)細胞caspase-3蛋白表達。

1.2.6 Western blot 取出備用海馬組織并勻漿，提取蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳，常規(guī)轉膜、封閉；分別加入兔抗c-Jun抗體（1∶1 000）、兔抗JNK抗體（1∶1 000）、兔抗P-JNK抗體（1∶1 000）等，孵育過夜，洗滌，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗IgG孵育1 h，顯色，圖像分析并測定蛋白條帶光密度值，分別計算P-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析檢驗，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Ig干預后大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡情況 如圖1所示，空白對照組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡細胞數(shù)較少，模型組大鼠神經(jīng)元凋亡細胞數(shù)較空白對照組顯著增多，經(jīng)干預后大鼠海馬神經(jīng)元凋亡細胞數(shù)較模型組減少，Ig高劑量組下降最為顯著。

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡情況（×400）Fig.1 Apoptosis of rats hippocampal neurons in each group（×400）

2.2 大鼠海馬細胞AI、Bcl-2表達 與空白對照組相比，其余4組大鼠海馬細胞AI明顯升高，Bcl-2表達明顯下降（P＜0.05），Ig高劑量組AI升高、Bcl-2下降最為顯著（P＜0.05），Ig低劑量組與Ig中劑量組大鼠海馬細胞AI、Bcl-2表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。

表1 各組大鼠海馬細胞AI、Bcl-2表達比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of AI and Bcl-2 expression of hippocampus cellsin each groups（±s，n=10）

表1 各組大鼠海馬細胞AI、Bcl-2表達比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of AI and Bcl-2 expression of hippocampus cellsin each groups（±s，n=10）

Note：Compared with blank control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with Ig low-dose，3）P＜0.05；compared with Ig middle-dose group，4）P＜0.05.

Groups Blank control Model Iglow-dose Igmiddle-dose Ig high-dose F P AI 5.12±1.33 42.36±8.581）22.63±4.361）2）20.54±4.021）2）12.03±2.361）2）3）4）85.453 P＜0.001 Bcl-2 1.02±0.08 0.33±0.041）2）0.52±0.051）2）0.53±0.081）2）0.90±0.041）2）3）4）211.027 P＜0.001

2.3 大鼠神經(jīng)元損傷指標（P-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、caspase-3）表達比較 與空白對照組相比，其余4組大鼠P-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、caspase-3表達明顯升高（P＜0.05）；Ig高劑量組指標升高情況明顯緩解（P＜0.05），Ig低劑量組與Ig中劑量組大鼠神經(jīng)元損傷指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2）。

表2 各組大鼠P-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、caspase-3表達比較（xˉ±s，n=10）Tab.2 Comparison of P-JNK/JNK，p-c-Jun/c-Jun，and caspase-3 test results of rats of each group（±s，n=10）

表2 各組大鼠P-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、caspase-3表達比較（xˉ±s，n=10）Tab.2 Comparison of P-JNK/JNK，p-c-Jun/c-Jun，and caspase-3 test results of rats of each group（±s，n=10）

Note：Compared with blank control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with Ig low-dose，3）P＜0.05；compared with Ig middle-dose group，4）P＜0.05.

Groups Blank control Model Ig low-dose Ig middle-dose Ighigh-dose F P P-JNK/JNK 0.36±0.09 1.38±0.141）1.03±0.121）2）1.02±0.101）2）0.60±0.041）2）3）4）153.623 P＜0.001 p-c-Jun/c-Jun 0.21±0.05 2.15±0.191）2.03±0.111）2）2.01±0.131）2）0.85±0.071）2）3）4）367.448 P＜0.001 caspase-3 0.47±0.10 1.26±0.171）0.92±0.121）2）0.89±0.101）2）0.66±0.061）2）3）4）67.708 P＜0.001

3 討論

SAH病因較為復雜，其中動脈瘤破裂是導致SAH發(fā)生的常見原因，約占85%，其他可能病因還有凝血功能障礙、非動脈瘤性出血、垂體卒中等［7］。研究顯示，血管破裂后血管痙攣可能導致腦組織缺血缺氧，同時神經(jīng)元、星形細胞等釋放各種炎癥因子及氧自由基，進一步加重腦組織損傷程度，進而導致海馬神經(jīng)元凋亡［8-9］。SAH主要治療方式為以預防再出血、預防腦血管痙攣、腦積水、降低顱內(nèi)壓等為目標的常規(guī)藥物治療，但SAH后致殘率及致死率仍較高，效果并不理想［10］。尋求治療SAH的其他有效治療方式具有重要意義。

Bcl-2是一種癌基因，具有顯著抑制細胞凋亡作用，研究顯示，Bcl-2過表達可減少氧自由基產(chǎn)生及脂質過氧化物形成［11］。Bcl-2可抑制鈣離子跨膜流動，提示Bcl-2可通過調節(jié)胞內(nèi)鈣離子濃度調節(jié)細胞凋亡；此外，Bcl-2還可與Bcl-2家族外的蛋白磷酸酶Calcineurin、蛋白激酶Raf-1等結合，發(fā)揮抗凋亡作用［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，SAH大鼠海馬組織Bcl-2表達均較空白對照組明顯降低，提示Bcl-2表達與SAH神經(jīng)元損傷相關。

JNK是絲裂原活化蛋白激酶（mitogenac tivatedproteinkinase，MAPK）家族成員，是含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶，可將細胞外刺激信號傳遞至細胞核，進而引發(fā)細胞生物學反應的重要信號系統(tǒng)［14］。JNK作為MAPK信號通路的重要通路，參與多種細胞生長、增殖及凋亡等過程，同時參與細胞內(nèi)外信號轉導［15］。JNK可特異性抑制腦缺血導致的神經(jīng)細胞凋亡，可阻斷凋亡因子轉入線粒體，通過激活下游底物將信號傳至細胞凋亡因子，進而釋放細胞色素C，導致細胞凋亡［16-17］。SAH早期腦損傷中，機體釋放大量炎癥因子，激活JNK，引發(fā)下游蛋白c-JNK磷酸化。p-c-Jun是一種活化狀態(tài)，可在一定程度促進凋亡啟動蛋白caspase-3表達及釋放，進一步誘導細胞凋亡［18］。故推測JNK、c-Jun、caspase-3信號通路激活與細胞凋亡密切相關。本研究顯示，SAH大鼠海馬組織中神經(jīng)元凋亡較為明顯，海馬細胞AI、P-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、caspase-3表達較空白對照組明顯升高，可見，JNK、c-Jun、caspase-3信號通路激活貫穿SAH后神經(jīng)元損傷及凋亡進程，早期抑制該通路信號可能對減輕SAH后神經(jīng)損傷具有一定作用。

Ig是與抗體分子相似的球蛋白，屬于免疫活性分子，主要存在于血清中，具有特異性結合抗原功能。近年，靜脈注射Ig已被廣泛用于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病治療，并取得較好療效，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應用不斷增加［19］。2014年一項研究顯示，Ig可通過抑制機體血漿及外周血單個核細胞產(chǎn)生IL-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎因子，進而減輕機體腦損傷及器官功能損傷［20］。但目前Ig治療SAH的有效性及安全性相關機制的研究較少，為進一步觀察Ig治療SAH的效果，本研究成功構建SAH大鼠模型，并給予Ig治療，結果顯示，與模型組相比，經(jīng)Ig治療的大鼠海馬細胞AI、P-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、caspase-3表達降低，Bcl-2表達升高，且Ig高劑量組改善效果最為理想，而低劑量與中劑量組比較未見明顯差異。提示Ig用于SAH治療可通過調節(jié)Bcl-2表達及JNK、c-Jun、caspase-3信號通路，在一定程度修復大鼠海馬神經(jīng)元損傷。但相關研究較少，機制尚未明確，且無較多循證學依據(jù)作為理論支持，本研究結果的真實性、可靠性仍需前瞻性、大樣本研究進一步驗證。

綜上所述，Ig可抑制SAH大鼠海馬細胞凋亡、PJNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、caspase-3表達，提高Bcl-2表達，在一定程度上修復SAH大鼠海馬神經(jīng)元損傷。