• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    積雪草酸通過調(diào)控Nrf2/NF-κB治療MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎的實驗研究

    2021-08-21 07:00:32胡義陽楊忠明泉州市第一醫(yī)院泉州362000
    中國免疫學雜志 2021年13期
    關鍵詞:積雪草積雪草酸

    胡義陽 楊忠明(泉州市第一醫(yī)院,泉州362000)

    系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種復雜的自身免疫性疾病,其特征在于自身抗體的產(chǎn)生、全身性炎癥以及對血管和器官的損害[1-2]。SLE是由遺傳和環(huán)境因素引起的多因素疾病。許多SLE易感基因負責維持免疫耐受性和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,如抗原加工和呈遞、細胞凋亡、白細胞表面受體以及細胞信號傳導和基因轉錄的分子[3-4]。近年來,氧化應激因其在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機理中的潛在作用而引起了廣泛關注。狼瘡性腎炎是SLE患者腎功能衰竭的主要原因,其氧化狀態(tài)受損,與狼瘡性腎炎的進展有關。氧化應激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡狀態(tài),可通過激活NF-κB(NFκB)并刺激隨后產(chǎn)生促炎細胞因子和趨化因子以促進慢性腎病而誘發(fā)炎癥。核因子E2相關因子2(Nrf2)的抗氧化信號通路在細胞抵抗氧化應激的防御中發(fā)揮重要作用,并且已證明Nrf2基因的消融可引起狼瘡樣自身免疫性腎炎。Nrf2通過調(diào)控抗氧化物質(zhì)的表達,減輕活性氧和親電體引起的細胞損傷,使細胞處于穩(wěn)定狀態(tài),維持機體氧化還原動態(tài)平衡[5]。在人類和小鼠模型中有研究報道Nrf2參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機制,但Nrf2在狼瘡性腎炎發(fā)展中的作用仍不清楚。積雪草酸是積雪草的三萜類衍生物,具有諸如抗氧化劑和抗炎等生物學作用,有很大的研究價值[6-7]。既往已報道積雪草酸的多種潛在治療作用,但積雪草對狼瘡性腎炎的作用了解甚少。本研究將探討積雪草酸對小鼠狼瘡性腎炎的作用及其調(diào)節(jié)機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料積雪草酸購自上海自然標準研發(fā)與生物技術有限公司(純度98.0%、分子量488.70)。本實驗一抗:Nrf2抗體、p47phox抗體、Histone H3抗體、β-actin抗體、CD3抗體、F4/80抗體、NF-κB抗體均購自Cell Signaling Technology(Danvers,MA,USA)。TRIzol試劑購自Invitrogen;凝膠電泳系統(tǒng)購自北京六一儀器廠;凝膠電泳轉移系統(tǒng)購自BIO-RAD;PVDF膜購自美國Millipore;化學發(fā)光蛋白檢測顯影液購自美國Borad。BALB/c小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司。MRL/lpr雌性小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司。熒光顯微鏡(IX53)購自日本奧林巴斯。

    1.2 方法

    1.2.1 動物分組選擇20只8周野生型雌性BALB/c小鼠為正常組(Normal組),分別選擇20只易患狼瘡的MRL/lpr雌性小鼠給予生理鹽水[10 ml/(kg·d)]和積雪草酸[10 ml/(kg·d)],作為對照組(Vehicle組)和實驗組(Asiatic acid組),均以灌胃方式給藥。實驗中對動物的處置符合3R規(guī)則。所有操作遵循動物護理和使用委員會批準(動物倫理批號:2019016)。各組手術過程和實驗數(shù)據(jù)分析采用單盲模式。將動物維持在12 h光照/12 h黑暗交替環(huán)境中并自由獲取食物和水,在實驗前適應條件至少7 d。各組小鼠12周齡進行灌胃,至34周采用頸椎脫臼處死法迅速處死小鼠進行取材。

    1.2.2 RT-PCR從腎臟組織提取總mRNA,分光光度計檢測RNA濃度和純度,按試劑盒說明書反轉錄cDNA。qPCR引物序列如下(Primer Premier 5.0軟件設計),GAPDH-F:5'-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3',GAPDH-R:5'-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3';HO-1-F:5'-AGGTACACATCCAAGCCGAGA-3',HO-1-R:5'-CATCACCAGCTTAAAGCCTTCT-3';NQO1-F:5'-GTGATATTCCAGAGTAAGAAGGCAG-3',NQO1-R:5'-ATTCTCCAGGCGTTTCTTCCAT-3'。LightCycler?80 SYBR GreenⅠMaster用于上機檢測還原型輔酶Ⅰ醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinine oxidoreductase,NQO1]和血紅素氧化酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)mRNA表達水平,使用GAPDH的mRNA表達量作為內(nèi)參進行標準化,即以NQO1/GAPDH和HO-1/GAPDH表示結果。

    1.2.3 免疫組織化學染色經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定的腎臟組織脫水,石蠟包埋切片后,在60℃烤箱中烘烤30 min以上,經(jīng)脫蠟水合后用檸檬酸鹽高壓修復。8%羊血清封閉60 min減少非特異性染色。用CD3、F4/80、NF-κB一抗孵育過夜,二抗孵育60 min后,每個組織加DAB工作液進行顯色,蘇木素復染后中心樹膠封片,在光學顯微鏡下觀察并拍照。

    1.2.4 Western blot將各組小鼠腎臟組織溶于裂解緩沖液中,采用BCA法測量蛋白濃度。組織裂解產(chǎn)物使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,然后轉移到PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉1 h。孵育一抗4℃過夜。37℃孵育二抗40 min后用ECL進行顯影。使用Image J軟件對蛋白表達水平進行定量,GAPDH為內(nèi)參蛋白。

    1.2.5 HE染色標本采集:將小鼠仰臥捆綁于小動物手術臺上,取腎臟組織,置于4%多聚甲醛溶液中,固定72 h后將其進行乙醇梯度脫水,二甲苯透明后石蠟包埋,切成5μm薄片,進行后續(xù)組織HE染色。

    1.2.6 活 性 氧(reactive oxygen species,ROS)測定通過Dihydroethidium(DHE)染色檢測活性氧的產(chǎn)生。將腎臟石蠟切片與DHE(5 μmol/L)在37℃孵育1 h,用熒光顯微鏡(IX53)觀察熒光圖像,由Image-Pro plus軟件進行分析。

    1.3 統(tǒng)計學分析使用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示。兩兩比較采用t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 各組小鼠腎臟HE染色結果如圖1所示,對照組小鼠顯示典型的腎小球增生、新月體、腎小球硬化和間質(zhì)性炎癥,表現(xiàn)為腎小球周圍單核白細胞浸潤以及伴有蛋白管型的腎小管萎縮,而正常組小鼠無異常表現(xiàn)。在積雪草酸實驗組小鼠中,上述腎臟損傷大幅減少,但與正常組小鼠比較仍表現(xiàn)出輕度腎小球增生和輕度間質(zhì)性炎癥。

    圖1 各組小鼠腎臟HE染色(×400)Fig.1 HE staining of mice kidney in each group(×400)

    2.2 各組小鼠腎臟活性氧的測量為了特異性地檢測各組腎臟中的局部活性氧產(chǎn)生情況,采用DHE染色法檢測各組小鼠腎臟中ROS表達水平。如圖2所示,DHE熒光在正常組小鼠腎臟中較低,陽性細胞率??;在對照組小鼠中顯著增加(P<0.05),與正常小鼠相比ROS水平顯著增加。在積雪草酸處理后ROS產(chǎn)生較少(P<0.05)。

    圖2 各組小鼠腎臟DHE染色(×400)Fig.2 DHE staining of kidney of mice in each group(×400)

    2.3 各組小鼠腎臟組織中的氧化應激蛋白相對表達水平比較為確定積雪草酸給藥是否影響狼瘡性腎炎的氧化應激反應,對腎臟中Nrf2向細胞核的移位和NAD(P)H氧化酶亞單位p47phox水平以及Nrf2下游酶進行了檢測。如圖3所示,與正常組相比,對照組小鼠細胞核中的Nrf2蛋白水平顯著低于正常對照組(P<0.05),然而與對照組小鼠相比,積雪草酸處理的小鼠Nrf2向細胞核的移位明顯增多(P<0.05),其水平與正常組接近。另外與正常小鼠相比,對照組小鼠中p47phox的水平顯著增加(P<0.05),而經(jīng)過積雪草酸治療的小鼠其p47phox的水平顯著降低(P<0.05)。

    圖3 各組小鼠腎臟氧化應激蛋白表達水平Fig.3 Expression level of oxidative stress protein in kidney of mice in each group

    2.4 各組小鼠腎臟組織中mRNA相對表達水平比較既往研究表明,NQO1和HO-1的表達受Nrf2調(diào)控[8]。因此本研究檢測NQO1和HO-1的mRNA在各組小鼠腎臟組織中的表達。如圖4所示,與正常組小鼠相比,對照組小鼠中NQO1和HO-1的腎mRNA水平顯著降低(P<0.05),在積雪草酸處理后的小鼠中NQO1和HO-1的腎mRNA水平與正常組相似(P<0.05)。

    圖4 各組小鼠腎臟組織中的mRNA相對表達水平Fig.4 Relative mRNA expression levels in kidney tissues of mice in each group

    2.5 各組小鼠腎臟氧化應激蛋白的表達水平免疫組化結果(圖5)顯示,與正常組相比,對照組顯示出T細胞(CD3陽性細胞)和單核細胞/巨噬細胞(F4/80陽性細胞)顯著浸潤到腎間質(zhì)的腎小球周圍區(qū)域(P<0.05),而積雪草酸處理的小鼠CD3和F4/80的表達水平顯著下降(P<0.05)。與正常組相比,對照組小鼠腎臟中的NF-κB p65活性顯著增加(P<0.05),且這種作用在積雪草酸處理的小鼠中被顯著抑制(P<0.05)。

    圖5 各組小鼠腎臟組織免疫組化染色結果Fig.5 Immunohistochemical staining results of kidney tissues of mice in each group

    3 討論

    本研究發(fā)現(xiàn)積雪草酸可抑制MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎的發(fā)生發(fā)展。積雪草酸通過減少腎小球增殖、新月體、腎小球硬化和腎小球周圍單核白細胞浸潤,抑制MRL/lpr小鼠狼瘡腎炎的發(fā)展。進一步機理研究表明,積雪草酸改善MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎是通過增強Nrf2抗氧化信號通路、抑制NF-κB炎癥信號通路以及抑制腎內(nèi)T細胞和單核細胞/巨噬細胞的浸潤實現(xiàn)的。

    狼瘡性腎炎患者的氧化狀態(tài)受損且炎癥活動明顯增加[9]。既往研究發(fā)現(xiàn)狼瘡腎炎的發(fā)展和加速都與受損的抗氧化防御系統(tǒng)有關[10-11]。積雪草酸是一種從積雪草中提取的生物活性化合物,具有多種諸如抗氧化和抗炎等藥理作用[7,12-13]。據(jù)報道,在創(chuàng)傷性腦損傷或急性肺損傷的小鼠模型中,Nrf2的破壞導致促炎細胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6的產(chǎn)生增加,并且Nrf2通過中和活性氧并負調(diào)節(jié)NF-κB和TGFβ1信號通路來改善狼瘡性腎炎[14-16]。最近的一項研究表明,通過增加Nrf2水平和肝臟抗氧化酶活性,積雪草酸顯著改善了肝功能損傷[12]。阻斷氧化應激可通過降低IL-1β和TNF-α的表達來改善腎臟炎癥[17-18]。本研究證明積雪草酸顯著抑制MRL/lpr小鼠活性氧生成,激活其Nrf2信號通路,抑制p47phox和NF-κB的表達,促進血紅素氧合酶-1和NAD(P)H氧化酶下游的NQO1表達增加。另外,T細胞和巨噬細胞向腎臟的浸潤在腎小球腎炎中也起著重要作用[19-20]。免疫組化染色結果證實積雪草酸給藥可抑制MRL/lpr小鼠腎內(nèi)T細胞和單核細胞/巨噬細胞的浸潤。

    綜上所述,本研究證明了積雪草酸通過Nrf2/NF-κB信號通路對系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎臟的氧化應激具有保護作用,具有治療狼瘡性腎炎的應用前景。

    猜你喜歡
    積雪草積雪草酸
    不打擾是一種慈悲
    意林彩版(2022年1期)2022-05-03 10:25:07
    被光陰治愈
    我們
    福建文學(2019年12期)2019-08-06 14:59:46
    大糧積雪 誰解老將廉頗心
    炎黃地理(2017年10期)2018-01-31 02:15:05
    超聲波-酶法提取積雪草中積雪草總苷的工藝研究Δ
    中國藥房(2017年13期)2017-05-16 01:29:01
    積雪
    草酸鈷制備中的形貌繼承性初探
    2000~2014年西藏高原積雪覆蓋時空變化
    飲食科學(2016年3期)2016-07-04 15:12:40
    飲食科學(2016年3期)2016-07-04 15:12:27
    方正县| 长顺县| 黑龙江省| 三台县| 淮安市| 平谷区| 博野县| 营山县| 遂昌县| 琼中| 雷波县| 门头沟区| 夹江县| 通州区| 蒲城县| 抚顺县| 宜都市| 廉江市| 横山县| 乌拉特前旗| 项城市| 陕西省| 山东省| 星子县| 章丘市| 宜阳县| 铜鼓县| 泸西县| 长兴县| 安陆市| 河南省| 黎城县| 揭东县| 资阳市| 当雄县| 望都县| 全椒县| 区。| 汉中市| 盐边县| 浦城县|