miR-106a-5p過表達(dá)對ACLT誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨退變和細(xì)胞外基質(zhì)降解的修復(fù)及血清炎癥因子的影響①

楊利斌 楊林 趙恩典 王善坤 梁秋冬 柳申鵬

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨外科四病區(qū)，新鄉(xiāng)453100）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的肌肉骨骼疾病，其特征在于關(guān)節(jié)進(jìn)行性結(jié)構(gòu)損傷，導(dǎo)致諸如關(guān)節(jié)僵硬和疼痛等癥狀［1］。OA為退行性關(guān)節(jié)疾病，其細(xì)胞功能喪失，細(xì)胞外基質(zhì)降解。軟骨細(xì)胞通過形成細(xì)胞外基質(zhì)分子維持關(guān)節(jié)軟骨強(qiáng)度，軟骨細(xì)胞凋亡導(dǎo)致軟骨基質(zhì)缺乏，從而引起基質(zhì)的破壞［2］。對于OA的治療，包括關(guān)節(jié)疼痛和炎癥的緩解使用非甾體抗炎藥，包括環(huán)加氧酶抑制劑［3］。但由于骨關(guān)節(jié)炎病因的復(fù)雜性和應(yīng)用藥物的局限性，預(yù)防和延緩OA的發(fā)生、發(fā)展是最佳選擇。

microRNA（miRNAs）屬于小的非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄后靶向mRNA表達(dá)，作為關(guān)鍵的基因調(diào)節(jié)因子，影響細(xì)胞的生物學(xué)或病理活動［4］。越來越多的證據(jù)將幾種miRNA途徑與OA進(jìn)展相關(guān)聯(lián)。血清和滑液中的miR-378-5p是預(yù)測膝蓋OA嚴(yán)重程度的有效miR信號［5-6］。miR-148a可抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，如MMP13和ADAMTS5在OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)［7］。miR-106a-5p作為miR-17家族的一員，在多種腫瘤中高表達(dá)。已有研究表明，關(guān)節(jié)內(nèi)注射miR-106a agomir可 改 善OA［8］。但miR-106a-5p對OA的具體作用機(jī)制仍不清楚。本文旨在探究miR-106a-5p過表達(dá)對ACLT誘導(dǎo)的OA大鼠軟骨退變和細(xì)胞外基質(zhì)降解的修復(fù)及血清炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物40只SD大鼠購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司，雄性，7周齡，體重（200±10）g，許可證號：SCXK（蘇）2016-0010。置于溫控（22±1）℃和光控（200 lux，12 h/12 h光暗循環(huán)）動物設(shè)施中常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 主要試劑與儀器蘇木素-伊紅（HE）染液（D006-1-1）、IL-6（H007）和TNF-α（H052）ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；U6引物、miR-106a-5p Scramble及miR-106a-5p激動劑購自上海吉瑪制藥公司；阿利新藍(lán)染液（0298-50G）購自青島捷世康生物科技有限公司；聚集蛋白聚糖（Aggrecan）（ab36861）、SOX-9（ab26414）、Ⅱ型膠原蛋白（typeⅡcollagen，ColⅡ）（ab34712）、Caspase-3（ab13847）、cleaved Caspase-3（ab2302）、Caspase-9（ab52298）、cleaved Caspase-9（ab2324）、Bax（ab53154）、Bcl-2（ab196495）、β-actin（ab8227）購自英國Abcam公司。半自動圖像數(shù)字化分析儀（GRT-3002）購自濟(jì)南格利特科技有限公司；Nanodrop分光光度計購自美國ThermoFisher公司；熒光顯微鏡購自德國徠卡。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立與分組將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：Control組、ACLT組、ACLT+Scramble組 和ACLT+miR-106a agomir組。除Control組外，其余3組參照郇松瑋等［9］的方法行前交叉韌帶橫斷手術(shù)，ACLT+Scramble組轉(zhuǎn)染無序序列，ACLT+miR-106a agomir組轉(zhuǎn)染miR-106a-5p激動劑。

1.2.2 HE染色取各組大鼠軟骨組織石蠟包埋切片，采用HE染液，將石蠟切片脫蠟，蒸餾水潤濕組織，核染液染色5 min，水洗5 s，漿染液染色30 s，水洗后，濾紙吸干，無水乙醇脫水2次后封片，在熒光顯微鏡下觀測。

1.2.3 RT-PCR檢測miR-106a-5p表達(dá)Trizol法提取軟骨組織總RNA，Nanodrop分光光度計測定吸光度（A260/A280），按照試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成和PCR擴(kuò)增，引物序列為：miR-106a-5p F：5'-AAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAG-3'，R：5'-GGAAAAGTGCTTACAGTGCAGGT-3'；U6 F：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴(kuò)增35個循環(huán)，72℃延長10 min。存儲在4℃條件下。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。以U6為內(nèi)參，用2-ΔΔCt方法計算。

1.2.4 骨組織形態(tài)計量學(xué)測量采用半自動圖像數(shù)字化分析儀測量骨小梁數(shù)目（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp）及骨小梁體積比（BV/TV）。測量范圍為：距離骺線0.1 mm至遠(yuǎn)端0.4 mm，兩側(cè)皮質(zhì)骨內(nèi)膜面范圍內(nèi)。

1.2.5 阿利新藍(lán)染色將軟骨細(xì)胞接種于3.5 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)液，PBS洗3次。4%多聚甲醛室溫下固定1 h，PBS洗3次，加入1 ml 1%阿利新藍(lán)染液（配于0.1 mol/L的HCl），37℃孵育過夜。去除多余染液，PBS洗3次，加1 ml無水乙醇脫色。倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 Western blot將各組大鼠軟骨組織冰上溶解25 min。以12 000 r/min離心10 min，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。提取等量的蛋白質(zhì)樣品（20 mg），100℃變性5 min。然后使用SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，4℃條件下加入相應(yīng)一抗并孵育過夜，清洗，4℃下加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，孵育2 h，最后加入發(fā)光液，曝光處理。Image J軟件統(tǒng)計灰度值。

1.2.7 ELISA采用ELISA法檢測各組大鼠外周血和骨組織中IL-6、TNF-α水平，操作步驟嚴(yán)格按照IL-6、TNF-α ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計軟件SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，兩兩比較采用獨(dú)立的t檢驗(yàn)，組間差異采用單因素方差分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-106a-5p過表達(dá)改善ACLT誘導(dǎo)的OA大鼠病理損傷HE染色檢測各組大鼠病理損傷程度結(jié)果如圖1A所示，Control組軟骨組織完整，ALCT組結(jié)構(gòu)紊亂，可見纖維變形和裂隙。ACLT+Scramble組潮線模糊、增生。ACLT+miR-106a agomir組軟骨及基質(zhì)排列較整齊，軟骨表層輕度粗糙，較ACLT+Scramble組病理損傷程度有所減輕。RT-PCR檢測各組大鼠miR-106a-5p表達(dá)結(jié)果如圖1B所示，與Control組相比，ACLT組miR-106a-5p表達(dá)降低（P＜0.05）。與ACLT+Scramble組相比，ACLT+miR-106a agomir組miR-106a-5p表達(dá)升高（P＜0.05）；半自動圖像數(shù)字化分析儀檢測各組大鼠Tb.N、Tb.Sp、BV/TV結(jié)果如圖1C～E所示，與Control組相比，ACLT組Tb.N、BV/TV明顯降低，Tb.Sp明顯升高（P＜0.05）。與ACLT+Scramble組相比，ACLT+miR-106a agomir組Tb.N、BV/TV明顯升高（P＜0.05），Tb.Sp明顯降低（P＜0.05）。

圖1 miR-106a-5p過表達(dá)對ACLT誘導(dǎo)的OA大鼠病理損傷的影響Fig.1 Effect of miR-106a-5p overexpression on pathological damage in ACLT-induced OA rats

2.2 miR-106a-5p過表達(dá)改善ACLT誘導(dǎo)的OA大鼠軟骨損傷通過阿利新藍(lán)染色檢測各組大鼠軟骨損傷情況結(jié)果如圖2所示，阿利新藍(lán)與細(xì)胞中的蛋白聚糖結(jié)合，使軟骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈淺藍(lán)色，細(xì)胞核呈深藍(lán)色。ACLT組染色明顯淺于Control組，ACLT+miR-106a agomir組染色明顯淺于ACLT+Scramble組。

圖2 miR-106a-5p過表達(dá)對ACLT誘導(dǎo)的OA大鼠軟骨損傷的影響Fig.2 Effect of miR-106a-5p overexpression on cartilage damage in ACLT-induced OA rats

2.3 miR-106a-5p過表達(dá)上調(diào)ACLT誘導(dǎo)的OA大鼠Aggrecan、SOX-9、ColⅡ蛋白表達(dá)水平Western blot檢測各組大鼠Aggrecan、SOX-9、ColⅡ蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖3所示，與Control組相比，ACLT組Aggrecan、SOX-9、ColⅡ蛋 白 水 平 明 顯 降 低（P＜0.05）。與ACLT+Scramble組相比，ACLT+miR-106a agomir組Aggrecan、SOX-9、ColⅡ蛋白水平明顯升高（P＜0.05）。

圖3 miR-106a-5p過表達(dá)對ACLT誘導(dǎo)的OA大鼠Aggrecan、SOX-9、ColⅡ蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of miR-106a-5p overexpression on Aggrecan，SOX-9 and ColⅡprotein expression levels in ACLT-induced OA rats

2.4 miR-106a-5p過表達(dá)降低ACLT誘導(dǎo)的OA大鼠cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2 Western blot檢測各組大鼠Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖4所示，與Control組相比，ACLT組cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2明顯升高（P＜0.05）。與ACLT+Scramble組相比，ACLT+miR-106a agomir組cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2明顯降低（P＜0.05）。

圖4 miR-106a-5p過表達(dá)對ACLT誘導(dǎo)的OA大鼠Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of miR-106a-5p overexpression on protein expression levels of Caspase-3，Caspase-9，Bax and Bcl-2 in ACLT-induced OA rats

2.5 miR-106a-5p過表達(dá)降低ACLT誘導(dǎo)的OA大鼠外周血和骨組織中IL-6、TNF-α水平ELISA檢測各組大鼠外周血和骨組織中IL-6、TNF-α水平結(jié)果如圖5所示，與Control組相比，ACLT組外周血和骨組織中IL-6、TNF-α水平明顯升高（P＜0.05）。與ACLT+Scramble組 相比，ACLT+miR-106a agomir組外周血和骨組織中IL-6、TNF-α水平明顯降低（P＜0.05）。

圖5 miR-106a-5p過表達(dá)對ACLT誘導(dǎo)的OA大鼠外周血和骨組織中IL-6、TNF-α水平的影響Fig.5 Effect of miR-106a-5p overexpression on IL-6 and TNF-α levels in peripheral blood and bone tissues of ACLT-induced OA rats

3 討論

OA為中老年人多發(fā)病，會導(dǎo)致關(guān)節(jié)明顯疼痛和僵硬。全球每年有數(shù)百萬人受OA的影響［10］。盡管骨關(guān)節(jié)炎遺傳學(xué)已引起關(guān)注，但臨床結(jié)果尚未得到明顯改善［11］。因此，迫切需要對OA患者的候選者進(jìn)行更好的識別，以增強(qiáng)OA的臨床管理。

在OA中，關(guān)節(jié)軟骨缺失是OA最典型的病理變化之一，軟骨下骨小梁骨質(zhì)改變在骨關(guān)節(jié)炎病理變化的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用［12］。軟骨下骨主要病理變化為骨質(zhì)象牙化、骨囊腫形成及骨贅形成等，微觀上則表現(xiàn)為軟骨下骨骨小梁數(shù)目增加，密度增高，間距變小，骨小梁方向與關(guān)節(jié)表面更垂直，而厚度無改變［13］。本文研究發(fā)現(xiàn)，miR-106a-5p過表達(dá)具有升高ACLT誘導(dǎo)的OA大鼠Tb.N、BV/TV，降低Tb.Sp的作用。提示miR-106a-5p過表達(dá)抑制軟骨下骨的骨質(zhì)疏松，改善軟骨下骨的生物力學(xué)性能，從而延緩關(guān)節(jié)軟骨退變。

軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨退變是OA的主要病理變化［14］。細(xì)胞外基質(zhì)主要由ColⅡ和Aggrecan組成，成熟軟骨細(xì)胞能夠合成及分泌細(xì)胞外基質(zhì)，在維持細(xì)胞外基質(zhì)合成代謝和分解代謝之間的動態(tài)平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用［15］。SOX-9為SOX蛋白家族成員，在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)代謝方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，能夠促進(jìn)軟骨標(biāo)志物Ⅱ型膠原、蛋白聚糖和Ⅸ型膠原的基因轉(zhuǎn)錄，并能夠抑制聚蛋白多糖酶、基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，從而維持關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表型［16］。張國梁等［17］研究發(fā)現(xiàn)miR-502-5p上調(diào)Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的表達(dá)緩解軟骨細(xì)胞損傷。李燦鋒等［18］研究發(fā)現(xiàn)，miR-140上調(diào)SOX-9表達(dá)維持骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞表型。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-106a-5p過表達(dá)具有上調(diào)ACLT誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎大鼠Aggrecan、SOX-9、ColⅡ蛋白表達(dá)水平的作用。提示miR-106a-5p過表達(dá)可減緩軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解。

細(xì)胞凋亡與人類骨關(guān)節(jié)炎組織標(biāo)本中軟骨破壞和基質(zhì)耗竭的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［19］。Caspase家族在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，其中Caspase-9、Caspase-3在凋亡級聯(lián)中的過度活化能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡［20］?？辜?xì)胞凋亡成員Bcl-2可防止細(xì)胞凋亡，而促凋亡成員Bax位于線粒體外膜或細(xì)胞質(zhì)，并在應(yīng)激下寡聚化，促進(jìn)線粒體釋放因子，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡［21］。本文研究發(fā)現(xiàn)，miR-106a-5p過表達(dá)具有降低ACLT誘導(dǎo)的OA大鼠cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2的作用。提示miR-106a-5p過表達(dá)抑制ACLT誘導(dǎo)的OA大鼠軟骨細(xì)胞凋亡。

炎癥是OA的早期過程，可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的代謝功能障礙，加劇關(guān)節(jié)軟骨的功能障礙，并最終導(dǎo)致滑膜關(guān)節(jié)的功能性破壞［22］。在OA患者中，各種炎癥介質(zhì)如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等表達(dá)水平明顯升高［23］。因此，抑制炎癥因子的釋放有助于改善OA。李坤等［24］研究發(fā)現(xiàn)miR-543過表達(dá)抑制骨關(guān)節(jié)炎大鼠TNF-α、IL-6表達(dá)減輕炎癥損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-106a-5p過表達(dá)具有降低ACLT誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎大鼠外周血和骨組織中IL-6、TNF-α水平的作用。提示miR-106a-5p過表達(dá)通過抑制炎癥因子的釋放改善OA。

綜上所述，miR-106a-5p通過緩解病理損傷程度，抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，抑制炎癥因子，對ACLT誘導(dǎo)的OA大鼠起改善作用。