單克隆抗體類(lèi)藥物的雜質(zhì)控制要點(diǎn)及相應(yīng)分析技術(shù)應(yīng)用的研究進(jìn)展

王思淵，張國(guó)林綜述，邢以文，楊純審校

1.蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，江蘇 蘇州 215000；2.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 兒科病研究所，江蘇 蘇州 215000

單克隆抗體類(lèi)藥物（以下簡(jiǎn)稱(chēng)單抗類(lèi)藥物）是一類(lèi)以免疫球蛋白G（IgG）結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，由對(duì)稱(chēng)的2條重鏈及2條輕鏈可變區(qū)組成抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可識(shí)別相應(yīng)特異抗原的大分子蛋白類(lèi)藥物［1］。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，單抗類(lèi)藥物制備技術(shù)日益完善，該類(lèi)藥物在整個(gè)醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)的地位顯得日趨重要，越來(lái)越多的醫(yī)藥公司，尤其是國(guó)際性大公司，均在積極開(kāi)展單抗類(lèi)藥物的研發(fā)和生產(chǎn)［2-3］。目前，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food&Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)上市的單抗類(lèi)藥物已有60余種，另有超過(guò)300種處于臨床試驗(yàn)階段，主要應(yīng)用于腫瘤、自身免疫病、心血管疾病及感染性疾病等多種疾病的治療［4-7］。國(guó)內(nèi)大型醫(yī)藥企業(yè)在單抗類(lèi)藥物的研發(fā)能力和生產(chǎn)產(chǎn)能正處于迅速提升中，其中以上海君實(shí)生物醫(yī)藥科技股份有限公司旗下的蘇州眾合生物醫(yī)藥科技有限公司、信達(dá)生物制藥（蘇州）有限公司、蘇州盛迪亞生物醫(yī)藥有限公司和百濟(jì)神州生物科技有限公司尤為突出。除了已上市的阿達(dá)木單抗、貝伐單抗、曲妥珠單抗及多款PD-1／PD-L1單抗類(lèi)藥物外，以抗體藥物偶聯(lián)（antibody-drug conjugate，ADC）、雙特異性抗體（bispecific antibody）、免疫檢查點(diǎn)抗體（immune checkpoint inhibitor）為代表的新型單抗類(lèi)藥物也是目前國(guó)內(nèi)外生物制藥公司研究的熱點(diǎn)［8-12］。單抗類(lèi)藥物生產(chǎn)工藝及過(guò)程有別于傳統(tǒng)化學(xué)藥品，含有一些傳統(tǒng)工藝中沒(méi)有的雜質(zhì)，存在一定質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)，因此其質(zhì)量控制要點(diǎn)及相應(yīng)的檢測(cè)方法與傳統(tǒng)化學(xué)藥品有較大差異。單抗類(lèi)藥物質(zhì)量控制，尤其是雜質(zhì)分析具有復(fù)雜性和多樣性，有別于小分子藥物，需通過(guò)多個(gè)維度對(duì)其分子進(jìn)行表征分析才能確保其有效性、安全性和一致性［13］。因此，本文著重就單抗類(lèi)藥物常用的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)規(guī)定、雜質(zhì)控制要點(diǎn)及相應(yīng)分析方法作一綜述，以期為該類(lèi)藥物的生產(chǎn)研發(fā)企業(yè)及相關(guān)檢定單位提供參考。

1 單抗類(lèi)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定

目前，單抗類(lèi)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)規(guī)定主要參照《中國(guó)藥典》三部（2015版）［14］、《中國(guó)藥典》四部（2015版）［15］通則、WHO相關(guān)定義與要求、人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH）對(duì)生物技術(shù)產(chǎn)品、生物制品及生物類(lèi)似藥的相關(guān)規(guī)定［16-17］、FDA和《美國(guó)藥典》的相關(guān)技術(shù)指南［18］、歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）相關(guān)技術(shù)規(guī)范制定［19］。由于單抗類(lèi)藥物是新型藥物，自2018年以來(lái)，雖國(guó)內(nèi)已有多家企業(yè)陸續(xù)上市多個(gè)單抗類(lèi)藥物，但未被《中國(guó)藥典》收載，均參照上述法規(guī)及指導(dǎo)原則執(zhí)行各自注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

2 單抗類(lèi)藥物的檢定

2.1 性狀與理化性質(zhì)檢定 單抗類(lèi)藥物是經(jīng)細(xì)胞表達(dá)、純化，制劑工藝后獲得的。不同的制劑工藝、配方、存儲(chǔ)及運(yùn)輸條件均會(huì)影響其分子間及分子內(nèi)部共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的形成或打開(kāi)，從而改變單抗類(lèi)藥物的性狀與理化性質(zhì)［20］。因此，單抗類(lèi)藥物的性狀與理化性質(zhì)檢定是其質(zhì)量控制的必要環(huán)節(jié)，檢定項(xiàng)目主要包括外觀(guān)、復(fù)溶時(shí)間、裝量差異、pH、可見(jiàn)異物、澄清度、不溶性微粒、摩爾滲透壓、水分等［21］。目前，單抗類(lèi)藥物的性狀與理化性質(zhì)檢定標(biāo)準(zhǔn)多參照《中國(guó)藥典》三部（2015版）［14］及《中國(guó)藥典》四部（2015版）［15］通則制定。

2.2 雜質(zhì)的控制要點(diǎn)及相應(yīng)分析技術(shù)

2.2.1 基于毛細(xì)管電泳技術(shù)（capillaryelectrophoresis，CE）的純度和雜質(zhì)分析 《中國(guó)藥典》四部（2015版）［15］通則0542表明，CE是一類(lèi)以彈性石英毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)分子電荷和分子質(zhì)量大小不同實(shí)現(xiàn)分離的新型分離技術(shù)，是電泳與色譜結(jié)合的產(chǎn)物。單抗類(lèi)藥物是電荷異質(zhì)性和分子質(zhì)量相近的異種混合物，在產(chǎn)品生產(chǎn)及批放行過(guò)程均需確保其純度及完整性，且無(wú)不需要的修飾發(fā)生。CE由于具有快速、靈敏、可靠等優(yōu)勢(shì)，已成為單抗類(lèi)藥物純度和雜質(zhì)分析中的必備技術(shù)［22-24］。在CE的多種分離模式中，依靠等電點(diǎn)分離的毛細(xì)管等電聚焦成像電泳（imaged capillary isoelectric focusing，iCIEF）、依靠電荷／質(zhì)量比分離的毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillary zone electrophoresis，CZE）和依靠相對(duì)分子質(zhì)量大小分離的毛細(xì)管凝膠電泳（capillary gel electrophoresis，CGE）是單抗類(lèi)藥純度和雜質(zhì)分析中最常用的3種模式。

單抗類(lèi)藥物分子的修飾，如糖基的唾液酸化、谷氨酸環(huán)化、二硫鍵的氧化等均會(huì)影響抗體的電荷異質(zhì)性及等電點(diǎn)［25］。iCIEF中電解質(zhì)溶液形成pH梯度，各組分遷移至各自等電點(diǎn)時(shí)變?yōu)橹行孕纬蓷l帶，給出蛋白質(zhì)電荷異質(zhì)性分布的信息。iCJEF在單抗類(lèi)藥物純度和雜質(zhì)分析中主要用于等電點(diǎn)的鑒定與電荷異質(zhì)性的檢查。與傳統(tǒng)平板凝膠電泳比較，iCIEF具有耗時(shí)短、樣品用量少、分辨率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。2017年，GOYON等［26］用iCIEF測(cè)定了23種治療性單抗的等電點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)值與等電點(diǎn)計(jì)算理論值的相關(guān)性較好。

CZE中各組分根據(jù)各自的電泳流和電滲流按陽(yáng)離子（酸性峰）、中性粒子（主峰）和陰離子（堿性峰）的順序通過(guò)檢測(cè)器。CZE在單抗類(lèi)藥物純度和雜質(zhì)分析中主要用于電荷異質(zhì)性的檢查。與iCIEF法比較，CZE用于電荷異質(zhì)性分析更快速［27］。同時(shí)，由于CZE所用緩沖液的紫外吸收低，可采用214 nm波長(zhǎng)紫外檢測(cè)，比采用280 nm檢測(cè)的iCIEF具有更高的靈敏度［28］。CZE用于電荷異質(zhì)性分析的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于其易于與質(zhì)譜檢測(cè)器連接，可為電荷變異體的結(jié)構(gòu)分析鑒定提供重要信息［29-30］。

目前，應(yīng)用于單抗類(lèi)藥物還原和非還原性純度分析（大小異質(zhì)性）和N寡糖分析的CGE，由于樣品蛋白質(zhì)與十二烷基硫酸鈉（SDS）結(jié)合形成復(fù)合物，這種模式也被稱(chēng)為SDS無(wú)膠篩分毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis-SDS，CE-SDS）。與SDS-PAGE比較，CESDS更快捷，耐用性更好，精密度及分辨率更高，且無(wú)拖尾峰、樣品殘留少、線(xiàn)性和重復(fù)性較高［31］。由于CE-SDS檢測(cè)無(wú)需對(duì)結(jié)果進(jìn)行二次處理，其結(jié)果較SDS-PAGE更準(zhǔn)確、穩(wěn)定、客觀(guān)，且CE-SDS法能將非糖基化重鏈與重鏈分離后對(duì)非糖基化重鏈進(jìn)行定量分析［32］。目前，CE-SDS主要采用紫外檢測(cè)和激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)兩種檢測(cè)方法。GUO等［33］報(bào)道，利用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器檢測(cè)痕量雜質(zhì)的靈敏度更高。

近年，CE法開(kāi)始涉及探索單抗類(lèi)藥物糖基分析領(lǐng)域，通過(guò)N糖苷酶F對(duì)單抗N糖進(jìn)行酶切，再對(duì)酶切的N糖進(jìn)行標(biāo)記衍生，采用毛細(xì)管電泳結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器（capillary electrophoresis-laser induced fluorescence，CE-LIF）進(jìn)行測(cè)定。與經(jīng)典液相技術(shù)分析方法比較，CE-LIF的N糖標(biāo)記前處理僅需1h，具有分析快速簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)［34］。同時(shí)，SHEN等［35］報(bào)道，可采用毛細(xì)管凝膠電泳結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器（capillary gel electrophoresis-laser induced fluorescence，CGE-LIF）技術(shù)分析宿主細(xì)胞殘留DNA（host cell DNA，HCD）的分布。該方法的檢測(cè)靈敏度明顯高于ELISA法，其檢測(cè)限低至6.25 ng／μL，定量限低至25 ng／μL。CE-LIF對(duì)酶切產(chǎn)物分離度高，在傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠法有7個(gè)條帶的情況下，CE-LIF獲得了8個(gè)峰，且小于15 000 bp的片段分離度大于1.46，且其重復(fù)性也更好，遷移時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜0.35%，校正峰面積百分比均＜5.65%［36］。

2.2.2 基于高效液相色譜技術(shù)（high performance liquid chromatography，HPLC）的純度和雜質(zhì)分析 作為現(xiàn)代藥品檢測(cè)的常用技術(shù)，在眾多類(lèi)型HPLC中，反相色譜（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）、分子排阻色譜（size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography，SEC-HPLC）和離子交換色譜（ion exchange chromatography-high performance liquid chromatography，IEC-HPLC）已成為單抗類(lèi)藥物不同方面質(zhì)量檢定的常用技術(shù)手段。

RP-HPLC主要用于單抗類(lèi)藥物的肽圖檢查，《中國(guó)藥典》四部（2015版）［15］通則3405表明，通過(guò)胰蛋白酶裂解單抗類(lèi)藥物，形成肽段，采用RPHPLC分析鑒定其一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性和準(zhǔn)確性。肽圖是蛋白質(zhì)及其酶解產(chǎn)物的指紋圖譜，是單抗類(lèi)藥物質(zhì)量控制和放行的必行檢測(cè)。該項(xiàng)檢測(cè)可監(jiān)控單個(gè)氨基酸的突變、氧化、去酰胺化，也能檢測(cè)單抗類(lèi)藥物N-末端環(huán)化、C-末端賴(lài)氨酸處理、N-糖基化等一系列非預(yù)期的表達(dá)變異［25］。肽圖分析包含4個(gè)主要步驟：蛋白的分離純化、選擇性酶切、多肽的色譜分離、多肽的分析和鑒定。肽圖分析應(yīng)得到足夠的肽段和盡可能高的覆蓋度以進(jìn)行有效的分析［37］，但該方法并未將二硫鍵還原處理成還原狀態(tài)自由巰基的預(yù)處理步驟收錄其中，如缺失上述步驟，采用胰蛋白酶裂解單抗類(lèi)藥物幾乎得不到裂解峰［38］。對(duì)于采用紫外檢測(cè)器的RP-HPLC肽圖分析，最重要的是具有足夠大的分離度，以分離所有的組分峰，使用小粒徑的長(zhǎng)柱及超高效液相色譜系統(tǒng)（ultra performance liquid chromatography，UPLC）可大幅提高分離效率和速度。

《中國(guó)藥典》四部（2015版）［15］通則0514表明，SEC-HPLC可通過(guò)分子篩原理將蛋白質(zhì)按多聚體、二聚體、單體及某些情況下出現(xiàn)的片段等小分子順序分離，依次通過(guò)檢測(cè)器。因此SEC-HPLC廣泛應(yīng)用于單抗類(lèi)藥物聚合物的檢測(cè)，是目前常用的質(zhì)控及放行檢測(cè)方法。SEC-HPLC可定量，二聚體和聚集體的分離度較高，分析時(shí)間較短，且操作簡(jiǎn)單，可收集流分進(jìn)行進(jìn)一步分析［39］。在SEC-HPLC分離中，樣品將在1個(gè)柱體積內(nèi)通過(guò)等度分離洗脫，因此，進(jìn)樣器、管路和檢測(cè)器體積在內(nèi)的液相系統(tǒng)總體積會(huì)影響分離效果。通常，與柱體積相關(guān)的液相系統(tǒng)總擴(kuò)散體積越小，峰型越窄，分離效果越好。GOYON等［40］發(fā)現(xiàn)，使用小粒徑（3μm）色譜柱比使用傳統(tǒng)5μm粒徑色譜柱可獲得更高的流速，且不影響分離度與柱效。隨后，RICHARD等［41］報(bào)道也表明，除使用更合理的流動(dòng)性pH之外，更小粒徑的SEC-HPLC色譜柱能提供更好的分離度與更快的分離速度。

IEC-HPLC是考察單抗類(lèi)藥物電荷異質(zhì)性的另一種手段，與CE比較，操作更簡(jiǎn)單，且能檢測(cè)蛋白分子表面電荷分布差異的優(yōu)勢(shì)［26］。弱陽(yáng)離子交換色譜柱常用于測(cè)定單抗類(lèi)藥物存在的酸性電荷異構(gòu)體（先于主峰出峰）與堿性電荷異構(gòu)體（晚于主峰出峰）。這些電荷異構(gòu)體多為主峰蛋白糖基化和去酰胺化的產(chǎn)物，但其有限的分辨率無(wú)法將各雜質(zhì)精確分離，該缺點(diǎn)也限制了其在單抗類(lèi)藥物質(zhì)量控制領(lǐng)域更深入地應(yīng)用［42］。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在單抗類(lèi)藥物質(zhì)量控制領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。四極桿-飛行時(shí)間（quadrupole time-offlight，QTof）高分辨質(zhì)譜、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption／ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-Tof-MS）及結(jié)合了高選擇性四極桿離子過(guò)濾與Orbitrap高分辨準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)技術(shù)的QE高分辨質(zhì)譜，在完整蛋白、肽圖分析、寡糖分析、蛋白定量、蛋白測(cè)序等單抗類(lèi)藥物質(zhì)量控制領(lǐng)域具有明顯優(yōu)勢(shì)，見(jiàn)表1［43-48］。

表1 質(zhì)譜技術(shù)在單抗類(lèi)藥物質(zhì)控領(lǐng)域中的應(yīng)用Fig.1 Application of mass spectrometry for quality control of monoclonal antibody drugs

另外，親水作用液相色譜（hydrophilic interaction liquid chromatography-high performance liquid chromatography，HILIC-HPLC）配以熒光檢測(cè)器（fluorescence detector，F(xiàn)LD）或電噴霧檢測(cè)器（corona chaged aerosol detection，CAD）也在單抗類(lèi)藥物相關(guān)質(zhì)量控制方面發(fā)揮著重要作用，如寡糖鏈分析與工藝中引入的表面活性劑與藥用輔料檢測(cè)等［49-50］。隨著多維液相色譜技術(shù)的發(fā)展，二維液相色譜（two dimensionalhigh performance liquid chromatography，2D-HPLC）可將樣品中難分離、需富集的雜質(zhì)分離或富集用于與質(zhì)譜、紅外和核磁共振等的聯(lián)用分析中，在單抗類(lèi)藥物雜質(zhì)分離與鑒定等分析中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用［51］，如VANHOENACKER等［52］采用2D-HPLC與QTof高分辨質(zhì)譜聯(lián)用分析經(jīng)處理和未經(jīng)處理的曲妥單抗酶解物，結(jié)果表明，采用HILIC的第一維液相與采用RPLC的第二維液相在兩個(gè)維度間提供了良好的正交性，2D-HPLC與高分辨質(zhì)譜的結(jié)合在肽圖詳細(xì)分析方面具有較大潛力。

2.2.3 細(xì)胞殘留雜質(zhì)分析 單抗類(lèi)藥物除了進(jìn)行常規(guī)的無(wú)菌試驗(yàn)、異常毒性、熱源試驗(yàn)、內(nèi)毒素等安全性檢查外，其生產(chǎn)過(guò)程中HCP、DNA及純化過(guò)程使用的親和色譜蛋白A（Protein A）等工藝雜質(zhì)殘留量也需進(jìn)行嚴(yán)格控制［53］。這些由生產(chǎn)過(guò)程引入的殘留雜質(zhì)不僅影響產(chǎn)品的效價(jià)，還可能在不同程度上引起機(jī)體的免疫應(yīng)答，最終引起過(guò)敏反應(yīng)或毒性、免疫原性、致癌性等嚴(yán)重的安全性問(wèn)題［54］。

美國(guó)FDA規(guī)定，用一種靈敏度較高的方法檢測(cè)藥品的HCP，其含量應(yīng)低于檢測(cè)限（通常＜100 ppm）［18］；《中國(guó)藥典》三部（2015版）［14］規(guī)定，CHO細(xì)胞HCP占總蛋白含量的0.05%以下［14］。雖然目前國(guó)際上針對(duì)HCP的殘留限度尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但ELISA法是與國(guó)際接軌的常用單抗類(lèi)藥物HCP及Protein A殘留的檢測(cè)方法，也是目前《生物制品質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)審評(píng)一般原則》中推薦的檢測(cè)方法［55］，但ELISA法在《中國(guó)藥典》四部（2015版）［15］通則并未收載［15］。另外，質(zhì)譜檢測(cè)在HCP定量也有所應(yīng)用，BOMANS［56］使用Orbitrap高分辨質(zhì)譜監(jiān)控純化過(guò)程中的HCP含量變化，并在最終藥物中鑒定到多種低豐度的HCP，對(duì)純化方法的優(yōu)化具有重要的參考意義。

WHO及國(guó)內(nèi)外藥物監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求，CHO宿主細(xì)胞DNA殘留量應(yīng)不高于10 pg。《美國(guó)藥典》（USP41-NF36版）［57］指出，定量PCR法（q-PCR）的適用性較其他檢測(cè)方法更好。q-PCR法對(duì)樣品的前期處理要求較高，但我國(guó)尚未建立統(tǒng)一的國(guó)家藥品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)核酸信息平臺(tái)和DNA殘留量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，單抗類(lèi)藥物中CHO宿主細(xì)胞殘留DNA的檢測(cè)均由各生產(chǎn)廠(chǎng)家自行檢測(cè)。宿主細(xì)胞DNA殘留國(guó)內(nèi)外常用的q-PCR法在《中國(guó)藥典》四部（2015版）［15］通則中也未收載。

3 展望

隨著單抗類(lèi)藥物研究的深入及分析技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（quality by design，QbD）質(zhì)量控制理念的推廣，單抗類(lèi)藥物雜質(zhì)分析正向自動(dòng)化、高特異性、高準(zhǔn)確度、高靈敏度、微型化及高通量實(shí)時(shí)快速檢測(cè)的方向發(fā)展［41］，如芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab-On-Chip）技術(shù)在雜質(zhì)殘留檢測(cè)領(lǐng)域不斷發(fā)展與探索［58］；自動(dòng)化處理平臺(tái)高通量蛋白純化、酶解、脫鹽、多肽分級(jí)、糖鏈富集等自動(dòng)化流程日趨成熟［59］；高分辨質(zhì)譜（high resolution mass spectrometry，HRMS）定性定量技術(shù)在過(guò)程開(kāi)發(fā)及批放行中的逐漸普及［40］。這些分析技術(shù)的發(fā)展正推動(dòng)著越來(lái)越多的新技術(shù)、新方法在單抗類(lèi)藥物雜質(zhì)分析領(lǐng)域得到應(yīng)用。同時(shí)，隨著單抗類(lèi)藥物的臨床應(yīng)用，出現(xiàn)了越來(lái)越多的不良反應(yīng)，對(duì)引起這些不良反應(yīng)的相關(guān)雜質(zhì)的深入研究將對(duì)單抗類(lèi)藥物的有效性、安全性和一致性的提升起到推動(dòng)作用。