一種新型載液細(xì)胞培養(yǎng)和觀察裝置的設(shè)計(jì)及其應(yīng)用

鐘 正， 阮亦銘， 俞大良， 侯 森，2

（1.暨南大學(xué)環(huán)境學(xué)院，廣州511486；2.中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所，土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210008）

0 引 言

激光共聚焦顯微鏡［1］經(jīng)過(guò)幾十年的改進(jìn)已成為科學(xué)研究的重要工具［2］，在生物學(xué)、環(huán)境學(xué)、測(cè)量學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)中占據(jù)了重要地位。由于其卓越的光學(xué)層掃和三維構(gòu)建能力［3］，激光共聚焦顯微鏡廣泛運(yùn)用于組織和細(xì)胞中的分子和結(jié)構(gòu)的檢測(cè)、細(xì)胞內(nèi)離子濃度變化的測(cè)量、熒光相關(guān)數(shù)據(jù)的測(cè)量、長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)的觀測(cè)、三維表面的測(cè)量等生物學(xué)研究領(lǐng)域中［4-7］。與普通熒光顯微鏡相比，激光共聚焦顯微鏡的激發(fā)光通過(guò)針孔而排除了次級(jí)熒光干擾，形成更加清晰的圖像［8］。激光共聚焦顯微鏡可同時(shí)對(duì)多種熒光染料標(biāo)記的樣本進(jìn)行信息獲取和構(gòu)建，同時(shí)進(jìn)行局部的光操作［9］。激光共聚焦顯微鏡要求使用厚度極薄的玻璃片（通常厚度為0.13～0.16 mm）作為樣品載物裝置［10］。而目前常用的載物裝置在使用成本、細(xì)胞培養(yǎng)可行性、反復(fù)滅菌能力等諸多方面還存在著種種缺陷，無(wú)法滿足細(xì)胞培養(yǎng)觀測(cè)的使用要求。

激光共聚焦顯微鏡是在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，利用針孔阻斷焦距外的光線以排除探測(cè)器聚焦外的光線，再利用光柵式掃描進(jìn)行成像的顯微鏡［11］。激光共聚焦顯微鏡采用共軛聚焦的方式，逐點(diǎn)掃描觀測(cè)樣品，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)熒光標(biāo)記樣品的高分辨三維成像［12］。激光共聚焦顯微鏡物鏡的最前端與聚焦平面的距離（即工作距離）較短［13］，通常需要使用厚度不超過(guò)0.17 mm的玻片承載被測(cè)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［14-15］。為了適應(yīng)這一要求，人們通常采用0.13～0.16 mm的蓋玻片來(lái)承載被觀測(cè)物。在觀測(cè)細(xì)胞時(shí)，通常做法是首先取細(xì)胞懸液滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片，此時(shí)細(xì)胞位于載玻片和蓋玻片之間的狹小空間內(nèi)；之后將整個(gè)載玻片與蓋玻片的組合翻轉(zhuǎn)，使得原本處于上方的蓋玻片翻到下方，載玻片和蓋玻片之間通過(guò)細(xì)胞懸液的表面張力結(jié)合在一起；最后將載玻片與蓋玻片的翻轉(zhuǎn)組合置于物鏡上方進(jìn)行觀測(cè)。這種方法的局限性在于載玻片和蓋玻片之間的空間無(wú)法密閉，因此難以防止染菌、防塵及防止液體蒸發(fā)；此裝置加載的液體量有限，無(wú)法達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)細(xì)胞要求；在翻轉(zhuǎn)過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致觀測(cè)物的攪動(dòng)及玻片之間的液體溢出從而影響觀測(cè)結(jié)果。另外一種承載器件設(shè)計(jì)方案是將0.17 mm蓋玻片用特殊生物膠粘合在帶孔的圓柱形塑料培養(yǎng)皿底部，制成一次性商業(yè)化的真核細(xì)胞培養(yǎng)載液裝置，細(xì)胞在底部玻片和帶孔培養(yǎng)皿構(gòu)成的空間內(nèi)生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)可將此裝置直接置于物鏡上方進(jìn)行觀測(cè)不用翻轉(zhuǎn)。但是這種商業(yè)化的器件底部的玻片已經(jīng)粘合固定，無(wú)法對(duì)玻片拆下進(jìn)一步修飾；且器件為不耐高溫的塑料制成，不能承受反復(fù)高溫滅菌，只能一次性使用；器件價(jià)格昂貴，使用一次大約花費(fèi)10元人民幣；且需要特殊的支架才能固定于載物臺(tái)上，并不一定兼容普遍使用的載玻片支架。若能針對(duì)目前激光共聚焦顯微鏡常用觀測(cè)器件的短板，制備一種能反復(fù)滅菌且拆卸方便、價(jià)格低廉的、方便固定于載物臺(tái)操作的面向真核細(xì)胞培養(yǎng)的激光共聚焦顯微鏡載液器件，將會(huì)對(duì)激光共聚焦顯微鏡及其相關(guān)儀器（如激光共聚焦熒光相關(guān)譜儀）的推廣，產(chǎn)生極大的推動(dòng)作用。

本文在以往觀察裝置的基礎(chǔ)上，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡的特點(diǎn)，針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)和重復(fù)使用等特性進(jìn)行研究，設(shè)計(jì)了一種新型真核細(xì)胞培養(yǎng)的載液裝置。該載液裝置的尺寸按照普通載玻片設(shè)計(jì)，能夠直接適用于各類載玻片支架；并且其成本低廉、可拆裝、可重復(fù)滅菌使用、使用操作方便。對(duì)這種新型載液細(xì)胞培養(yǎng)器件進(jìn)行了制片、滅菌、細(xì)胞培養(yǎng)、成像等實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證明，本裝置可為激光共聚焦顯微鏡提供一種可進(jìn)行真核細(xì)胞培養(yǎng)的、能夠用于常用的載玻片載物臺(tái)的、成本低廉的、可重復(fù)使用的新型載液器件。

1 材料和方法

1.1 新型載液觀察裝置

新型載液觀察裝置由下載器、載物玻片、密封墊、上載器、分離式上蓋、固定螺絲組成。裝置中厚度為1 mm的下載器、厚度為10 mm的上載器均采用玻璃材質(zhì)；厚度為0.1 mm的密封墊采用硅膠材質(zhì)；載物玻片使用面積為24 mm×50 mm，厚度為0.13～0.16 mm

的蓋玻片，分離式上蓋采用面積為24 mm×75 mm，厚度為1～1.2 mm的載玻片。下載器兩側(cè)設(shè)有兩個(gè)對(duì)稱的圓孔，中間設(shè)有較大的圓孔，沿下載器長(zhǎng)度中線將下載器分為對(duì)稱的兩塊，下載器上方蓋有載物玻片。載物玻片上方蓋有密封墊，密封墊兩側(cè)設(shè)有兩個(gè)對(duì)稱的圓孔，中間設(shè)有較大圓孔。密封墊上方蓋有上載器，上載器中間設(shè)有較大圓孔，兩側(cè)設(shè)有兩個(gè)對(duì)稱的圓孔，兩個(gè)對(duì)稱圓孔上方內(nèi)側(cè)設(shè)有螺紋，螺紋與螺絲配套用于固定組件。接入細(xì)胞后，在上載器上方覆蓋分離式上蓋防止染菌。細(xì)胞在載物玻片、密封墊、上載器、分離式上蓋組成的密閉空間內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將HeLa人宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)于90%DMEM高糖培養(yǎng)基中（ThermoFisher，中國(guó)上海英濰捷基貿(mào)易有限公司），培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清（Hyclone/?？寺?，中國(guó)廣州研信生物科技有限公司），1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液（Gibco，中國(guó)廣州研信生物科技有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)溫度為37℃，含有5%CO2。實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先用磷酸鹽緩沖液（PBS，aladdin/阿拉丁，中國(guó)上海阿拉丁生化科技股份有限公司）沖洗細(xì)胞，然后加入0.25%胰蛋白酶（0.25 g胰蛋白酶，100 mL PBS（1X），源葉生物，中國(guó)上海源葉生物科技有限公司），在37℃、5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 min，再加入DMEM培養(yǎng)基并將細(xì)胞從壁上輕輕吹脫，離心去上清液后重新加入DMEM培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液加入已消毒的新型載液觀察裝置中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞染色和成像

培養(yǎng)細(xì)胞接種于載液觀察裝置，培養(yǎng)12、24、36 h后使用普通顯微鏡（EVOS?FLoid，美國(guó)Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行觀測(cè)。藍(lán)色熒光染料Hoechst 33342能夠穿透細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行特異性染色。碘化丙啶（PI）是一種紅色熒光的細(xì)胞核染色試劑，特異性染色死亡細(xì)胞。將細(xì)胞接入本裝置培養(yǎng)16 h后，移去培養(yǎng)基，加入PBS緩沖液沖洗，然后加入1 mL稀釋100倍的雙氧水并孵育20 min，加入PBS緩沖液沖洗，再加入含有染色液的培養(yǎng)基孵育20 min，含染色液的培養(yǎng)基為10μL Hoechst33342試劑（1 mg/mL，Solarbio/索萊寶，中國(guó)北京索萊寶科技有限公司）與10μL碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）試劑（1 mg/mL，Solarbio/索萊寶，中國(guó)北京索萊寶科技有限公司）混勻于1 mL的培養(yǎng)基制備而成，最后使用熒光顯微鏡（EVOS?FLoid，美國(guó)Thermo Fisher Scientific）對(duì)染色完成的細(xì)胞進(jìn)行觀測(cè)。將細(xì)胞接入本裝置培養(yǎng)12 h后，使用Hoechst33342和PI染色劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，然后使用激光共聚焦顯微鏡（LMS900，德國(guó)Zeiss）進(jìn)行觀測(cè)。

1.4 滅菌實(shí)驗(yàn)

使用滅菌鍋（GI36DP，中國(guó)廈門至微儀器有限公司）對(duì)裝置進(jìn)行滅菌，在溫度123℃、氣壓0.1 MPa情況下滅菌30 min，觀察滅菌前后器件形貌的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 新型載液觀察裝置結(jié)構(gòu)

新型載液觀察裝置的構(gòu)造如圖1所示，其上載器、下載器采用玻璃制成，在使用過(guò)程中不易出現(xiàn)彎曲、變形。密封墊采用硅膠制成，載物玻片上覆蓋的密封墊對(duì)載玻片和上載器進(jìn)行貼合密封，可避免液體外泄。載物玻片可用普通蓋玻片（0.13～0.16 mm厚度）代替，既可以一次性使用，也可以反復(fù)清洗滅菌使用。裝置組裝時(shí)，按照從下到上的順序?qū)⑾螺d器、載物玻片、密封墊、上載器組合，然后使用兩顆固定螺絲從下載玻片兩側(cè)的圓孔擰入，將組件進(jìn)行固定。細(xì)胞在由載物玻片、密封墊、上載器和分離式上蓋構(gòu)成的圓柱形密閉空間培養(yǎng)。該空間可容納3 mL細(xì)胞培養(yǎng)液。采用硅膠密封墊對(duì)載物玻片和上載器進(jìn)行貼合密封進(jìn)而有效防止漏液。在上載器上方覆蓋分離式上蓋以防止液體蒸發(fā)、落塵、染菌，使得本裝置具有了長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞的可行性。

圖1 新型載液觀察裝置結(jié)構(gòu)圖（mm）

為了保護(hù)構(gòu)造脆弱的載物玻片，在載物玻片的下方增加厚度為2 mm的玻璃制分離式下載器來(lái)支撐整個(gè)裝置，可以減少由于受力不均而造成載物玻片碎裂的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)在載物玻片與上載器之間使用硅膠密封墊，緩沖載物玻片與上載器的剛性接觸，使載物玻片始終處于壓力均勻、穩(wěn)定的狀態(tài)，大大降低了載物玻片碎裂的風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

探究了新型載液觀察裝置進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞觀測(cè)的可行性。在接入細(xì)胞后的0、12、24、36 h時(shí)對(duì)其中培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行觀測(cè)（見(jiàn)圖2）。細(xì)胞培養(yǎng)0 h時(shí)細(xì)胞未完全沉降至載物玻片上，仍有部分細(xì)胞懸浮在液體培養(yǎng)基中，此時(shí)細(xì)胞還未增殖，密度較低，使用顯微鏡可以清晰地看到細(xì)胞已貼附于載物玻片上，呈現(xiàn)出大小均一的球形，形貌正常（見(jiàn)圖2（a））；細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)，正常貼壁發(fā)育的HeLa細(xì)胞呈梭形，圖中細(xì)胞外形緊湊、形態(tài)分明、輪廓清晰，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況良好（見(jiàn)圖2（b））；細(xì)胞培養(yǎng)24 h后細(xì)胞繼續(xù)增殖，細(xì)胞覆蓋率達(dá)到60%左右，細(xì)胞排列緊密，邊緣整齊，細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)情況良好（見(jiàn)圖2（c））；細(xì)胞培養(yǎng)36 h后細(xì)胞增殖數(shù)量較多，細(xì)胞覆蓋率達(dá)到85%左右，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞質(zhì)均勻，生長(zhǎng)情況良好（見(jiàn)圖2（d））。從以上分析可知，細(xì)胞可在本裝置中長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)正常，無(wú)染菌情況，同時(shí)表明這種新型載液觀察裝置能夠直接使用普通顯微鏡進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞的實(shí)時(shí)觀測(cè)。

圖2 細(xì)胞在新型載液觀察裝置培養(yǎng)

2.3 激光共聚焦顯微鏡成像實(shí)驗(yàn)

與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比，激光共聚焦顯微鏡加裝了激光掃描裝置，逐點(diǎn)掃描熒光標(biāo)記樣品，最后對(duì)各點(diǎn)的信息進(jìn)行總和，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的成像。對(duì)本裝置內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞用于激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)的可行性進(jìn)行研究。用雙氧水處理器件內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞并且使用Hoechst 33342和PI進(jìn)行細(xì)胞染色。細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33342染色后所有細(xì)胞核呈藍(lán)色（見(jiàn)圖3（a）），經(jīng)PI染色后部分細(xì)胞核呈紅色（見(jiàn)圖3（b））。染色部分輪廓清晰，說(shuō)明細(xì)胞的藍(lán)色和紅色熒光信號(hào)可有效通過(guò)新型載液觀察裝置被共聚焦顯微鏡觀測(cè)到（20×（NA 0.75）物鏡）。從紅藍(lán)熒光場(chǎng)合成圖（見(jiàn)圖3（c））可以看出，藍(lán)色信號(hào)區(qū)域與紅色信號(hào)區(qū)域重合良號(hào)。此外使用40倍和63倍油鏡同樣可以達(dá)到對(duì)雙熒光信號(hào)的有效共聚焦顯微鏡觀測(cè)（見(jiàn)圖3（d）～（i））。

圖3 染色細(xì)胞的激光共聚焦顯微鏡成像圖

20×（NA 0.75）物鏡的工作距離為0.60 mm；40×（NA 1.3）油鏡的工作距離為0.22 mm；63×（NA 1.4）油鏡的工作距離為0.19 mm；100×（NA 1.4）油鏡的工作距離為0.17 mm［16］。本裝置的載物玻片厚度為0.13～0.16 mm，完全能夠滿足物鏡工作距離的要求，使用物鏡或油水浸鏡都能觀測(cè)到清晰的圖像。

2.4 熒光顯微鏡成像實(shí)驗(yàn)

使用藍(lán)色熒光染料Hoechst33342（1 mg/mL）和紅色熒光染料PI（1 mg/mL）對(duì)新型載液觀察裝置內(nèi)培養(yǎng)16 h的細(xì)胞進(jìn)行染色后，使用普通熒光顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)并記錄圖像（見(jiàn)圖4）。Hoechse33342染料可將細(xì)胞的細(xì)胞核染成藍(lán)色，PI染料可將死亡細(xì)胞的細(xì)胞核染

成紅色。結(jié)果表明，使用藍(lán)色熒光染料Hoechst33342和紅色熒光染料PI對(duì)培養(yǎng)在新型載液觀察裝置中的細(xì)胞進(jìn)行染色后，能夠使用普通熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀測(cè)，得到清晰的染色細(xì)胞藍(lán)場(chǎng)、紅場(chǎng)圖像。其中藍(lán)色熒光部分為所有細(xì)胞核（圖4（b））；紅色熒光部分表示壞死細(xì)胞的細(xì)胞核（圖4（c））；細(xì)胞核位置與明場(chǎng)細(xì)胞位置（見(jiàn)圖4（a））呈現(xiàn)出一致性。

圖4 新型載液觀察裝置中培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)Hoechst和PI染色后的圖像

Hoechst33342作為常用的藍(lán)色熒光染料，其最大發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm，PI作為常用的紅色熒光染料，其發(fā)射波長(zhǎng)為615 nm，由于裝置使用普通蓋玻片作為載物玻片，波長(zhǎng)范圍在460～615 nm之間的光亦可通過(guò)，因此本裝置適用于多種可見(jiàn)光波段的熒光顯微鏡觀測(cè)。

2.5 其他特色

本裝置采用的主要材質(zhì)為玻璃，可以承受高溫高壓。將裝置進(jìn)行組合后使用蒸汽滅菌鍋對(duì)新型載液觀察裝置進(jìn)行了滅菌實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)圖5）。如圖5（a）所示，滅菌前下載器、載物玻片、密封墊、上載器、分離式上蓋均無(wú)損壞、變形情況。由圖5（b）所示，滅菌后下載器、載物玻片、密封墊、上載器、分離式上蓋均無(wú)損壞、變形情況，裝置整體無(wú)變化。為了驗(yàn)證新型載液裝置能夠承載細(xì)胞懸液不漏液，將培養(yǎng)基加入到該新型載液裝置，由圖5（c）可知，新型載液裝置經(jīng)滅菌鍋高溫高壓滅菌后加載細(xì)胞懸液后，可以完美承載細(xì)胞懸液不漏液。

本裝置可重復(fù)使用，可以進(jìn)行批量滅菌，需要進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)時(shí)只需增加裝置數(shù)量即可滿足使用需求。本裝置使用的載物玻片單價(jià)約為0.05元，價(jià)格便宜。其余部分的材料由玻璃或硅膠制成，可以反復(fù)使用，每次使用的損耗很小可以忽略不計(jì)。與單價(jià)為10元左右的一次性商業(yè)化的細(xì)胞培養(yǎng)皿相比，這種新型載液裝置單次使用的成本約為培養(yǎng)皿的0.5%。

本裝置的一個(gè)特色是可以直接裝載于面向普通載玻片的載物臺(tái)支架進(jìn)行觀測(cè)（見(jiàn)圖6）。載玻片是最普遍的顯微鏡載物器件，幾乎所有的顯微鏡都設(shè)計(jì)有能夠裝載載玻片的支架。本裝置的下載器、載物玻片、密封墊、上載器、分離式上蓋到組裝而成的整個(gè)裝置都參照載玻片的尺寸設(shè)計(jì)，為26 mm×76 mm的長(zhǎng)方形結(jié)構(gòu)，適應(yīng)載玻片的載物臺(tái)支架。且本裝置總高12 mm，在激光共聚焦顯微鏡載物臺(tái)可容納的高度范圍內(nèi)。這種面向普通支架設(shè)計(jì)的器件比起目前市場(chǎng)上商業(yè)化的圓柱形培養(yǎng)皿，具有更好的普適性。

圖6 新型載液觀察裝置固定于共聚焦顯微鏡載物臺(tái)

3 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，本裝置價(jià)格便宜，安全耐用，能夠反復(fù)滅菌，是一種適用于普通顯微鏡支架（如載玻片支架）的面向真核細(xì)胞培養(yǎng)的新型激光共聚焦顯微鏡載液器件。將普通蓋玻片經(jīng)過(guò)器件固定即可形成載液細(xì)胞培養(yǎng)觀測(cè)器件，在各個(gè)實(shí)驗(yàn)室可輕松獲得，每次使用僅需替換載物玻片，具有很高的實(shí)用性，有望能推廣使用。